康紅霞， 朱永紅， 趙 萌， 賈 姝， 伍國強

(蘭州理工大學生命科學與工程學院， 甘肅 蘭州 730050)

紅豆草(OnobrychisviciifoliaScop.)是一種多年生、異花授粉的四倍體豆科牧草，又名驢食草，原產(chǎn)于歐洲和前蘇聯(lián)亞洲部分，在中國新疆天山和阿爾泰山北麓有野生種分布。20世紀50年代以來，我國先后從前蘇聯(lián)、匈牙利等國家引進紅豆草，最初主要在甘肅省中部干旱半干旱區(qū)推廣種植，隨后在青海、寧夏等省(區(qū))也有大量栽培。紅豆草根系發(fā)達，根部有根瘤，有生物固氮能力，可提高土壤肥力[1]；營養(yǎng)豐富，含有大量縮合單寧，牲畜喜食且不得膨脹病，被譽為“牧草皇后”[2]。但由于紅豆草對鹽堿環(huán)境較為敏感，其產(chǎn)量和品質(zhì)無法滿足草地畜牧業(yè)日益增加的需求[3-5]。因此，需要通過生物技術(shù)等手段來改良紅豆草的抗逆性。

紅豆草組織培養(yǎng)體系的研究開展較早，上世紀80年代張謙和鄭國锠[6]以子葉、下胚軸和根為外植體誘導出愈傷組織，并獲得少量再生植株。此后，國內(nèi)外學者對紅豆草再生體系做了較多的研究[7-13]。然而，由于紅豆草外植體(真葉、上胚軸、下胚軸等)很難形成愈傷組織，即使少量外植體能形成愈傷組織，也很難分化和生根[13]，限制了紅豆草的遺傳改良和分子育種進程。因此，建立和優(yōu)化紅豆草的高效組織培養(yǎng)及植株再生體系仍具有重要的現(xiàn)實意義。正交設計是一種高效、快速和經(jīng)濟的試驗方法[14]，不但可以優(yōu)化培養(yǎng)基，還可以確定再生體系中各階段的主因素。張龍等[15]采用正交試驗法對豆科牧草柱花草(Stylosanthesguianensis)愈傷組織的誘導和分化培養(yǎng)基進行優(yōu)化研究，建立了高效的組織培養(yǎng)體系。目前，利用正交設計法建立和優(yōu)化紅豆草的高效組培及植株再生體系卻鮮有報道。

因此，本研究采用正交試驗設計法，探究不同激素組合的培養(yǎng)基對紅豆草愈傷組織誘導及分化的影響，以期建立一種高效的組培及植株再生體系，為紅豆草的遺傳改良和生物育種奠定可靠基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘甘肅’紅豆草(O.viciifoliaScop. ‘Gansu’)，種子購自蘭州農(nóng)豐種苗科技有限公司，產(chǎn)地為甘肅省靜寧縣，采集時間為2015年8月。

興趣是最好的老師。教師可以從培養(yǎng)學生的朗讀興趣入手，激發(fā)學生的閱讀興趣，使其主動地、積極地去探求知識。激發(fā)興趣，關鍵是根據(jù)課文的特點和學生的實際，充分運用適合兒童心理特征的教學手段，導之以趣。例如采用精心設計導言、創(chuàng)設情境、看圖導入等教學方式，激發(fā)學生朗讀課文的興趣。

1.2 試驗方法

采用Excel軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果。用SPSS 17.0對結(jié)果進行方差分析和極差分析。

新一輪數(shù)學課程改革強調(diào)數(shù)學課程的出發(fā)點是學生全面、持續(xù)、和諧地發(fā)展，這就要求教師在教學中不僅需要遵循學生學習數(shù)學的普遍規(guī)律，還需要關注學生的特殊性.“由于學生所處的文化環(huán)境、家庭背景和自身思維方式的不同，學生的數(shù)學學習活動應當是一個生動活潑的、主動的和富有個性的過程”.

外植體愈傷組織誘導率(%)=
(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))
×100%。

通過方差分析可知(表3)，以上胚軸和下胚軸為外植體誘導愈傷組織時，NAA對紅豆草愈傷組織的誘導作用存在極顯著差異(P<0.01)，其他2種激素的影響較小；以真葉為外植體時，NAA對紅豆草愈傷組織的誘導作用存在顯著性差異(P<0.05)。3個影響因素的主次關系是：NAA>ZT>6-BA。由表4可知，Kn為該因素在n水平下所產(chǎn)生的平均效應值(在此處為愈傷組織的誘導率)；R為該因素在不同水平下的極差，即該因素在不同水平下的最大值與最小值之差|Xmax-Xmix|，R的大小反映了該因素對試驗結(jié)果的影響大小。極差分析結(jié)果表明，3種植物激素對紅豆草上胚軸、真葉和下胚軸3種外植體愈傷組織誘導率的作用效果不同，其中NAA的影響最大，其次為ZT和6-BA。水平優(yōu)選后可得出誘導紅豆草上胚軸產(chǎn)生愈傷組織的最佳濃度組合為 0.2 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1ZT；誘導紅豆草真葉產(chǎn)生愈傷組織的最佳濃度組合為1.0 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-1NAA+2.5 mg·L-1ZT；誘導紅豆草下胚軸產(chǎn)生愈傷組織的最佳濃度組合為1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1ZT。

表1 誘導愈傷組織的正交試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments on callusinduction

由表2可知，25個實驗處理組都成功誘導出愈傷組織，但是誘導率卻存在明顯差異。在無激素添加的MS培養(yǎng)基中愈傷組織誘導率(上胚軸17.50%、真葉12.25%和下胚軸28.00%)明顯低于其他添加激素的培養(yǎng)基。其中對紅豆草上胚軸愈傷組織誘導效率最高的激素組合是MS+0.5 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1ZT，誘導效率高達94.25%；對真葉愈傷組織誘導效率最高的激素組合是MS+0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1ZT，誘導率達到94.5%；對下胚軸愈傷組織誘導效率最高的激素組合是MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+2.5 mg·L-1ZT，愈傷組織誘導率達91.75%。

1.2.2愈傷組織的誘導 將5～7 d齡的紅豆草無菌苗外植體(上胚軸、真葉和下胚軸)接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導采用3因素5水平的正交試驗設計，以MS為基本培養(yǎng)基，添加細胞分裂素6-BA(0,0.2,0.5,1.0和2.5 mg·L-1)和ZT(0,0.2,0.5,1.0和2.5 mg·L-1)、生長素NAA(0,0.2,0.5,1.0和2.5 mg·L-1)各5水平(表1)。共25組實驗，每組重復3次，每個培養(yǎng)皿接種7個外植體。愈傷組織誘導率作為評價指標。黑暗培養(yǎng)3～5 d，待外植體的切痕邊緣出現(xiàn)膨大后開始光照培養(yǎng)(16 h·d-1，光照強度1 800 Lx)，7 d后開始出現(xiàn)愈傷組織(圖1b)。每隔14 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率。

其次，高校學生個體的差異性。高校學生人數(shù)多，對知識的掌握程度也不同，因此，分析學生教學對象的差異性，了解學生是實施差異教學的關鍵。學生的層次不同，教師在選擇思想政治教育的方法也要因人而異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.2.1無菌苗培養(yǎng) 選取籽粒飽滿、大小均勻的種子，剝?nèi)シN莢后，剔除破損、發(fā)霉和發(fā)黑的種子，將挑選出的色澤光亮的種子在冰箱4℃冷藏1 d。用蒸餾水清洗后，在超凈工作臺上先用75%乙醇震蕩消毒30～60 s，再用3% NaClO溶液消毒8～14 min，無菌水清洗3～5次；然后用無菌濾紙吸干種子表面殘余水分后接種于含有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種7粒種子，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為晝夜溫度25℃/18℃，光周期16 h·d-1，光照強度1 800 Lx，光照培養(yǎng)5～7 d，獲得無菌苗(圖1a)。

圖1 紅豆草愈傷組織誘導、生根及再生苗Fig.1 Callus induction,rooting culture,and regenerationplant of sainfoin注：a表示實生無菌苗；b表示愈傷組織誘導；c表示不定芽分化；d表示繼代培養(yǎng)后的愈傷組織；e表示分離出的長出2～3葉的不定芽苗；f表示生根誘導前生長出3～5葉的不定芽；g表示生根培養(yǎng)；h表示再生植株；i表示再生植株的底部視圖和長度測量Note:a is Aseptic seedlings;b is Callus induction;c is Adventitious bud differentiation;d is Isolated Callus after subculture；e is Isolated adventitious shoots with 2～3 leaves;f is Adventitious bud before rooting with 3～5 leaves;g is Rooting culture;h is Regeneration plant;i is Bottom view and length of regenerated plants

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素對愈傷組織誘導的影響

1.2.4試管苗生根培養(yǎng) 當不定芽長出3～5片真葉時，將其切下接種到生根培養(yǎng)基中(圖1f，g)，進行生根誘導。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA(0,0.5 mg·L-1)和IBA-K(0,0.2 mg·L-1)。每個處理30瓶，重復3次，每瓶接種1個不定芽。15 d后觀察生根情況，統(tǒng)計生根率。

1.2.3不定芽誘導 選擇質(zhì)地松軟、生長狀況良好的愈傷組織，切成約1 cm3的小塊，然后接種到不同激素配比的分化培養(yǎng)基中。不定芽誘導采用3因素5水平的正交試驗設計，以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA(0,0.2,0.5,1.0和2.5 mg·L-1)和ZT(0,0.2,0.5,1.0和2.5 mg·L-1)、NAA(0,0.2,0.5,1.0和2.5 mg·L-1)各5水平(表1)。共25組實驗，每組重復3次，每瓶接種4塊愈傷組織。培養(yǎng)10 d后在一些組織結(jié)構(gòu)比較松散的愈傷組織上出現(xiàn)較深綠色的突出，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d，這些突出的愈傷組織就會發(fā)展成不定芽(圖1c-e)，然后統(tǒng)計不定芽誘導率。愈傷組織的不定芽誘導率(%) = (產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織數(shù))×100%。

阿里并不知菩薩是做什么的。他只覺得四處花花綠綠人叫馬喧的，熱鬧得好玩。陌生人真是太多了，阿里便不停地跟人說：“我叫阿里。”人們便都望著他笑，笑容友善。阿東點了一炷香，遞給阿里，叫他拜菩薩時說：“姆媽要我開心?！?/p>

1.2.5煉苗 幼苗生根后繼續(xù)培養(yǎng)2周，選取根系完整，株高3～4 cm的試管苗(圖1 h，i)，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，然后移栽到裝有已消毒的蛭石和營養(yǎng)土1∶1體積比例混合的花盆中，將花盆用保鮮膜覆蓋?；ㄅ柩b盤，每隔2 d澆一次水，保持濕潤，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)3周左右以適應環(huán)境，隨后逐漸移除保鮮膜直至植株完全暴露到環(huán)境中。

表2 不同處理對紅豆草愈傷組織誘導和不定芽分化的影響Table 2 Effects of different hormone treatments on callus induced and induction of adventitious bud in callus of sainfoin

表3 紅豆草愈傷組織誘導結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of calls induction results in sainfoin

表4 紅豆草組織培養(yǎng)正交試驗結(jié)果的極差分析Table 4 Range analysis of orthogonal test results intissue culture of sainfoin

2.2 外源激素對愈傷組織分化不定芽的影響

由表2可知，不定芽誘導階段，在沒有添加激素的培養(yǎng)基中不定芽分化率僅5.76%，明顯低于添加激素的培養(yǎng)基。方差分析結(jié)果表明(表5)，NAA，6-BA及ZT對紅豆草不定芽分化率的影響無顯著性差異。從表4極差分析可知，3種植物激素對紅豆草愈傷組織分化不定芽的誘導影響大小順序為NAA>6-BA>ZT。盡管NAA對不定芽的誘導影響最大，但隨著NAA濃度的增加，不定芽的誘導率反而呈逐漸下降趨勢，表明高濃度NAA對紅豆草不定芽誘導有抑制作用。水平優(yōu)選后即可得出適宜紅豆草不定芽分化的培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1ZT。

表5 紅豆草不定芽分化結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of adventitious bud differentiation results in sainfoin

2.3 不同培養(yǎng)基對生根的影響

愈傷組織分化的不定芽由愈傷組織提供營養(yǎng)物質(zhì)逐漸長成幼苗，但由于其主要營養(yǎng)物質(zhì)由愈傷組織提供，故而再生幼苗沒有出現(xiàn)根組織。由表6可知，不同處理中的生根率存在差異，在沒有添加植物激素的1/2 MS和1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上沒有生根。添加0.2 mg·L-1IBA-K的培養(yǎng)基上雖然有根形成，但是生根率很低(5%)。同時添加低濃度的NAA (0.5 mg·L-1)和IBA-K (0.2 mg·L-1)時，培養(yǎng)10 d左右即可形成完整根系，且根長而多(圖1 h)。由此可見，本試驗中適宜紅豆草生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA-K，生根率高達45%(表6)。

表6 不同生根培養(yǎng)基上的生根效果Table 6 Rooting effects on the different rooting media

3 討論與結(jié)論

無菌操作是植物組織培養(yǎng)的基本要求[16-18],對種子消毒可以很大程度上降低其染菌率[19]。因此本試驗使用乙醇和NaClO溶液對紅豆草種子消毒，可以保證外植體具有良好的生理狀態(tài)。在植物組織培養(yǎng)過程中，植物細胞受到生理、生化等多種因素的影響，其中生長調(diào)節(jié)劑是最關鍵的限制因素之一[32]。調(diào)節(jié)激素種類和水平，可以很大程度上優(yōu)化組培體系。實踐證明，將正交設計應用于植物組織培養(yǎng)，一方面能夠用最少的處理得到最佳的組合，另一方面可以確定組織培養(yǎng)各個階段的關鍵因素[20]。本研究采用正交設計試驗優(yōu)化紅豆草組織培養(yǎng)最佳條件，試圖建立一套高效的組培和植株再生體系。

提高紅豆草愈傷組織誘導率是優(yōu)化其再生體系的第一步。細胞分裂素和生長素是愈傷組織誘導及分化過程中最常用的兩種激素。細胞分裂素可使植物細胞分裂并誘導芽的萌發(fā)和生長[21]；生長素可促進植物細胞伸長和根系分化[22]。已有研究表明，NAA和6-BA是誘導紅豆草愈傷組織應用最多的外源激素[10-13]。在紅豆草愈傷組織誘導過程中3種激素對上胚軸、真葉和下胚軸等外植體的愈傷組織誘導影響大小順序為：NAA > ZT > 6-BA，說明NAA是紅豆草愈傷組織誘導階段最重要的激素，這與李輝[23]以紅豆草下胚軸為外植體研究結(jié)果一致。在本研究中，以下胚軸為外植體時低濃度NAA更利于愈傷組織的誘導，這說明不同外植體對NAA的敏感程度不同。6-BA不是愈傷組織誘導過程中的主要因素，對愈傷組織誘導作用較小，一般與其他生長素配合使用，可以提高愈傷組織的質(zhì)量和誘導率[24]。

行業(yè)性質(zhì)：絕大多數(shù)企業(yè)位于產(chǎn)業(yè)鏈利潤最低的制造環(huán)節(jié)：超過90%的企業(yè)均為生產(chǎn)型企業(yè)；占據(jù)產(chǎn)業(yè)鏈高端環(huán)節(jié)的企業(yè)很少：總部、研發(fā)設計、采購及業(yè)務等比例較小，占比最大的采購環(huán)節(jié)亦僅五分之一左右。

愈傷組織只有轉(zhuǎn)入到生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)基上，才能發(fā)育為成熟的體細胞胚并形成植株，而細胞分裂素可以促進愈傷組織向再生植株的方向發(fā)展[25-27]。在本研究中，誘導紅豆草愈傷組織再分化為不定芽時，適當濃度6-BA對紅豆草不定芽分化有促進作用，這可能是由于6-BA能夠改善植物細胞內(nèi)源性生長素和細胞分裂素的比例，調(diào)節(jié)細胞生理生化狀態(tài)，有利于愈傷組織的誘導，從而增加分化頻率[28]。高濃度ZT使不定芽的誘導率明顯提高，與張文學等[29]和劉君等[30]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，隨著NAA濃度增加，不定芽誘導率呈逐漸下降趨勢，這與木臺塔爾·阿布力克木和楊茁萌[11]對甘肅紅豆草組織培養(yǎng)的研究結(jié)果一致。在本研究中，紅豆草不定芽分化的最佳培養(yǎng)基是MS+0.5 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-1ZT。該配方與云雅聰[31]研究蒙農(nóng)紅豆草不定芽誘導培養(yǎng)基配方有一定的差異，體現(xiàn)在NAA的用量上，不添加NAA對甘肅紅豆草不定芽誘導有利，說明甘肅紅豆草和蒙農(nóng)紅豆草在組織培養(yǎng)過程中對激素的適應能力有差別。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)應用生產(chǎn)中，試管苗的生根質(zhì)量是影響其移栽成活率的重要因子。在生根培養(yǎng)中合理添加植物生長激素可以促進根的形成，提高組培苗的生根率[32]。研究表明，IBA誘導形成的不定根細而長，NAA誘導形成的不定根短而粗[33-34]。因此本試驗研究了NAA和IBA-K的配合使用對紅豆草生根率的影響。結(jié)果表明只添加了IBA-K的培養(yǎng)基中雖然有根生成，但生根率低，僅有5%。只添加了NAA的培養(yǎng)基中沒有根生成，這與楊茁萌等[10]研究‘頓河’紅豆草的結(jié)果有一定差異；結(jié)論不一致的原因可能是紅豆草品種不同，也可能是NAA設置的濃度不同。在本研究中，用1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA-K組合濃度培養(yǎng)的紅豆草根系多且發(fā)達，與已報道的IBA和NAA能夠誘導試管苗生根的結(jié)論一致[35-37]。

本研究為紅豆草愈傷組織誘導和植株再生提供了一個高效方案，即紅豆草愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1ZT為最優(yōu)；不定芽分化的培養(yǎng)基以MS + 0.5 mg·L-16-BA+2.5 mg·L-1ZT為最優(yōu)；不定芽轉(zhuǎn)至1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1IBA-K，生根效果最好，生根率為45%。