呂竑建， 鄒 璇， 吳 碩， 李 云， 陳曉陽*， 張 慶*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院， 廣東 廣州 510642； 2. 華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院， 廣東木本飼料工程技術(shù)研究中心，廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室， 廣東 廣州 510642； 3. 北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院， 北京 100083)

玉米(Zeamays)秸稈是世界上常見的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品之一，其年產(chǎn)生物量超過11.3億噸[1]。大部分的玉米秸稈都被焚燒處置，不僅造成了資源的浪費，同時帶來了環(huán)境污染問題[2-3]。將玉米秸稈做成青貯飼料不僅能減少環(huán)境污染，且能緩解飼料短缺問題[4]。但玉米秸稈青貯飼料的局限性體現(xiàn)在其消化率和營養(yǎng)價值較低，作為單一飼料原料飼喂時難以滿足動物日常營養(yǎng)需求，這是由于其木質(zhì)纖維素和半纖維素含量高，蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)含量較低，不利于有效微生物的生長。要提高玉米秸稈青貯的發(fā)酵質(zhì)量，改善其營養(yǎng)價值和適口性，混合青貯是一個有效的辦法[5]。

辣木(MoringaOleifera)，起源于印度，營養(yǎng)價值豐富，每一個部分都能被充分利用，且辣木能在非常惡劣的環(huán)境下存活，在全球廣泛種植，蛋白質(zhì)，維生素和微量元素含量高，是我們?nèi)粘Ｊ秤玫乃卟说仁称返臄?shù)倍[6-7]。鑒于辣木的特性，它可以用作飼料添加劑來改善飼料成分和利用效率，提高動物的健康水平[8-9]。Rubanza[10]報道將辣木作為飼料添加劑可以提高動物飼料消化率。Kholif[11]報道用辣木替代75%干物質(zhì)的苜蓿(MedicagoSativa)，能提高哺乳期努比亞山羊的飼料利用率，改善瘤胃發(fā)酵，提高奶產(chǎn)量和質(zhì)量。不僅如此，Wang[12]也報道用辣木葉和苜?；蛑ú?Stylosanthesguianensias)混合青貯，能提高它們的營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)。有氧穩(wěn)定性是青貯飼料加工的重要指標，Wilkinson[13]研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈青貯容易在有氧環(huán)境下出現(xiàn)腐敗，引起干物質(zhì)損失甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。添加乳酸菌不僅可以改善玉米秸稈的青貯品質(zhì)[14]，而且能提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，Ranjit[15]研究發(fā)現(xiàn)，在玉米秸稈青貯中添加布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri，LB)，能顯著改善其有氧穩(wěn)定性。根據(jù)我們此前的研究，在辣木青貯中分離出的香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis，LF)，可以提高青貯飼料的品質(zhì)，對有氧穩(wěn)定性的效果還有待探索[16]。

南方天氣高溫多雨，飼料保存難度大，容易出現(xiàn)霉變等腐敗現(xiàn)象，然而飼料安全對動物養(yǎng)殖生產(chǎn)具有極其重要的意義，青貯是保存青綠飼料的一個經(jīng)濟便捷的方式。玉米秸稈的產(chǎn)量大，但營養(yǎng)價值低，混合辣木葉青貯可改善其營養(yǎng)品質(zhì)，為我國南方地區(qū)提供優(yōu)質(zhì)的飼料資源。但有關(guān)于利用木本飼料混合青貯的方式改善其他牧草青貯品質(zhì)的研究比較少，有關(guān)有氧穩(wěn)定性的研究更是少之又少。所以，本試驗采用完全隨機試驗設(shè)計，設(shè)置了100%玉米秸稈，80%玉米秸稈+20%辣木葉，60%玉米秸稈+40%辣木葉及是否添加LF共6個組別，在60 d青貯后測定了發(fā)酵品質(zhì)等指標，并對青貯開袋后的8 d內(nèi)的有氧穩(wěn)定性進行了記錄。旨在研究添加辣木葉和乳酸菌LF對玉米秸稈青貯品質(zhì)，營養(yǎng)成分和有氧穩(wěn)定性的影響，對開發(fā)木本飼料資源與現(xiàn)實生產(chǎn)提供理論依據(jù)和指導意義。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌的制備

試驗所用的辣木種植于華南農(nóng)業(yè)大學試驗田，并于2019年5月人工采葉，采葉后用鍘刀進行切割，長度約2 cm，將切碎的辣木葉混合均勻，按照試驗設(shè)計分裝至聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中，每袋約200 g，真空封口機抽真空并密封保存。參照Zhang[17]的研究，經(jīng)過60 d青貯發(fā)酵后，分離出96株乳酸菌菌株，并鑒定和篩選出LF，用于后續(xù)青貯試驗。

1.2 試驗設(shè)計

試驗中的辣木和玉米均種植于華南農(nóng)業(yè)大學試驗田，玉米秸稈于玉米籽實收獲后立即收割，辣木葉于第一次刈割后40天收割，采摘后處理和青貯方法同上。試驗采用雙因素完全隨機試驗，因素Ⅰ為辣木葉的添加量，因素Ⅱ是LF乳酸菌添加劑，添加量為1×106cfu·g-1鮮樣(Fresh matter，F(xiàn)M)，分為6個組，分別是CK(空白對照組)，20%M(20%辣木葉和80%玉米秸稈混合青貯)，40%M(40%辣木葉和60%玉米秸稈混合青貯)，CK+LF(空白對照組+LF)，20%M+LF(20%辣木葉和80%玉米秸稈混合青貯+LF)，40%M+LF(40%辣木葉和60%玉米秸稈混合青貯+LF)，M代表辣木葉，每組9個重復，共54袋青貯。封裝后在室溫下保存，在60 d后進行開袋，對其化學成分，青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性進行測定分析。

1.3 有氧穩(wěn)定性

參照Zhang[17]的方法對有氧穩(wěn)定性進行測定。開袋后，每3袋收集400 g青貯，松散地放置在體積為1 L的塑料罐中，以評估有氧穩(wěn)定性，共18罐，罐上覆蓋一層紗棉布，讓空氣可以滲入青貯飼料，同時防止青貯變干和污染。所有的罐子都存放于紙箱(90 cm×50 cm×60 cm)中并以聚苯乙烯泡沫填滿空間。每隔10 min測量一次室溫和每個塑料罐的溫度，記錄儀型號(SMOWMDL-1048A，上海天河自動化儀器有限公司，中國上海)。

1.4 微生物及化學指標的測定

青貯開袋后，將20 g樣品與180 mL無菌生理鹽水溶液充分混合，并將其濃度依次從10-1稀釋至10-6倍，得到不同濃度的樣品浸提液，以平板計數(shù)法測定乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)、大腸桿菌(Coliform bacteria)、酵母菌(yeast)和霉菌(molds)的數(shù)量，乳酸菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌采用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(Violet Red Bile Agar,VRBA)，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅瓊脂)。培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。為了檢測pH值和有機酸含量，將20 g樣品與180 mL無菌純水充分混合，并置于4℃冰箱內(nèi)18 h，取出過濾后即可測試pH值，剩余液體通過0.22 μm孔徑的濾膜即可測定有機酸含量。氨態(tài)氮(Aammonium nitrogen，NH3-N)含量的測定方法參照Broderick[18]的方法。干物質(zhì)(Dry matter，DM)含量的測定方法為在65℃烘箱內(nèi)烘干48 h后計算。將烘干后的樣品用粉碎機粉碎后置于干燥器保存，粗蛋白質(zhì)(Crude protein，CP)含量的測定依照AOAC[19]的方法；非蛋白氮(Nonprotein nitrogen，NPN)和真蛋白質(zhì)(True protein，TP)的含量測定方法參照Licitra[20]的方法；中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber，ADF)的測定方法參照Van soest[21]的方法；可溶性糖(Water-soluble carbohydrates，WSC)的測定采用蒽酮比色法[19]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 19.0 進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，兩個因素互作時用Duncan氏對各組進行多重比較，P< 0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料

如表1所示，玉米秸稈和辣木葉原料的特性。玉米秸稈原料的干物質(zhì)含量16.4%，CP含量為9.01%DM，NDF和ADF的含量為63.8%和36.1%DM，WSC含量為4.17%DM。微生物包括乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌和霉菌，數(shù)量分別為6.54，4.39，7.23和4.55 lgcfu·g-1FM。辣木葉原料的干物質(zhì)含量20.4%，CP含量為22.1%DM，NDF和ADF的含量為23.3%和17.2%DM，WSC含量為7.36%DM。微生物包括乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌和霉菌，數(shù)量分別為5.72，3.53，7.00和<2.00 lgcfu·g-1FM。

表1 青貯原料的特性(± SD,n=3)Table 1 The characteristics of materials for ensiling (± SD,n=3)

2.2 秸稈辣木混合青貯60 d的青貯品質(zhì)

如表2所示，玉米秸稈和辣木葉的青貯60 d后的青貯品質(zhì)。添加辣木葉或LF均對DM無顯著影響。添加辣木葉可以顯著降低pH值(P<0.01)和大腸桿菌數(shù)量(P<0.01)，同時提升乳酸含量(P<0.01)。乳酸菌數(shù)量在添加40%辣木葉時顯著降低(P<0.05)。乙酸含量在添加辣木后均有所下降，但僅在20%M組有顯著差異(P<0.05)。辣木葉與LF的交互作用對乳酸菌，大腸桿菌和酵母菌的數(shù)量均有顯著影響(P<0.05)。

表2 混合青貯60 d發(fā)酵品質(zhì)(n=3)Table 2 The fermentation quality of the mixed silages after 60 d of ensiling (n=3)

2.3 秸稈辣木混合青貯60 d營養(yǎng)成分

表3 混合青貯60天營養(yǎng)成分(n=3)Table 3 The nutritional components of the mixed silages after ensiling for 60 days(n=3)

2.4 辣木秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性

如圖1所示，開袋后8 d內(nèi)溫度變化的趨勢。添加辣木葉后降低了青貯開袋后的有氧穩(wěn)定性，但在添加LF后，有氧穩(wěn)定性有明顯的提升，并無有氧腐敗的現(xiàn)象(表4)。達到最大溫度用時為0的組別(CK，CK+LF，20%M+LF，40%M+LF)代表初始溫度即為整個試驗期內(nèi)的最高溫度。

表4 青貯60 d后開袋8 d內(nèi)有氧穩(wěn)定性(n=3)Table 4 The aerobic stability of the mixed silages 8 days after exposure to air

圖1 混合辣木葉和添加乳酸菌LF對玉米秸稈青貯60 d后有氧暴露8 d溫度變化的影響Fig.1 Effect of Moringa Oleifera leaves addition on the temperature dynamics of corn stover ensiled with/without LF for 60 days and subsequently exposure to air for 4 days

3 討論

3.1 玉米秸稈與辣木葉原料的特點

本試驗中玉米秸稈的粗蛋白質(zhì)含量高于周瑞[22]的研究。辣木葉原料的粗蛋白質(zhì)含量高于王成[23]報道的16.72%DM，而NDF，ADF和WSC的含量均低于其報道。但是辣木葉的WSC含量達到了張慶[24]報道的制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料并良好保存的標準。原料的營養(yǎng)成分含量不同，可能是不同的地理位置、氣溫、品種和作物生長期等因素導致[23]。另外，兩種原料的乳酸菌數(shù)量都達到了Cai[25]報道的良好青貯原料的標準(> 5.0 lg cfu·g-1)，但原料中較多的大腸桿菌數(shù)量可能會影響青貯效果。同時，玉米秸稈纖維含量高，WSC和DM含量低，青貯效果不理想[26-27]。將WSC含量低的飼草與WSC含量高的牧草混合青貯是改善青貯飼料質(zhì)量的常見方法[5]。辣木葉蛋白質(zhì)含量高，纖維含量低，是動物飼料的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源。因此，將辣木葉與玉米秸稈混合青貯可提高其營養(yǎng)價值和青貯品質(zhì)。

3.2 秸稈辣木葉混合青貯60 d的青貯品質(zhì)

添加辣木葉混合青貯后，pH值顯著降低，大腸桿菌數(shù)量顯著下降。pH值是衡量青貯品質(zhì)的重要指標[28]，一般來說，pH值<4.2表示青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)良好[25]，較低的pH值還能抑制大腸桿菌的生長。據(jù)報道，辣木是一種有效的抗菌植物，能減少飼草中常見的有害微生物[29-30]，說明辣木葉在青貯中可能有一定的抗菌性能。乳酸菌數(shù)量的下降應該是較低的pH值所致，Ohmomo報道很多乳酸菌菌株對pH值<4.0的環(huán)境耐受性較弱[31]。本試驗中，酵母菌僅出現(xiàn)在20%M和40%M組，Muck[28]報道稱大部分酵母菌能在pH值為3.5的環(huán)境下存活，這遠低于一般青貯飼料足以抑制大多數(shù)有害微生物的pH值。此外，添加辣木葉提高了乳酸和WSC含量，給酵母菌提供了生長條件。由于酵母菌在好氧條件下會引起青貯飼料變質(zhì)，因此酵母菌數(shù)量的增加值得引起注意[4,28]。乙酸的產(chǎn)生常是由于乳酸被分解，添加辣木葉降低了乙酸的含量。此外，添加LF能抑制有害微生物的生長，說明LF能改善飼料的青貯品質(zhì)。以上結(jié)果表明添加辣木葉和LF都能提升玉米秸稈的青貯品質(zhì)。

3.3 秸稈辣木葉混合青貯60 d的營養(yǎng)成分

添加辣木葉可以顯著降低氨態(tài)氮含量，可能是辣木葉抑制了梭菌等微生物的生長和蛋白質(zhì)的水解活動。另一方面，Guo[32]報道辣木葉中的單寧成分可以抑制青貯飼料中的蛋白質(zhì)水解。添加辣木葉顯著增加了蛋白質(zhì)含量，同時顯著降低了纖維成分的含量。高水平的膳食纖維可能會使動物消化能損失，降低礦物質(zhì)利用效率，并對生物生殖指標產(chǎn)生負面影響[33]。WSC含量在添加辣木葉后也有所提升(添加LF組)，一般來說，WSC含量代表青貯飼料發(fā)酵中糖的消耗。低pH值環(huán)境可能會抑制微生物的活動從而抑制青貯飼料的發(fā)酵[4]。WSC含量與乳酸含量相關(guān)，試驗組中WSC含量低時，乳酸含量較高，發(fā)酵效果較好。從CK與CK+LF兩組對比，可以看出，添加LF對促進玉米秸稈發(fā)酵有積極意義。不過，無LF組的WSC含量相近，且平均值比添加LF組高，也有可能是纖維酸水解導致的。

3.4 秸稈辣木葉混合青貯的有氧穩(wěn)定性

有氧穩(wěn)定性的定義為青貯飼料的核心溫度高于外界溫度2℃所需要的時間，是衡量青貯飼料質(zhì)量的重要指標之一。有氧腐敗會使飼料的營養(yǎng)價值下降，且降低動物的采食量[34]。當飼料暴露于空氣中時，引起有氧腐敗的主要因素是酵母菌，將碳水化合物和乳酸分解成水和二氧化碳[17]。從表4可知，僅2組出現(xiàn)了有氧腐敗(20%M和40%M)。從圖1可知，20%M和40%M2組均從第一天開始出現(xiàn)有氧腐敗的現(xiàn)象，并一直保持較高的溫度，而其他組未出現(xiàn)有氧腐敗現(xiàn)象。出現(xiàn)有氧腐敗的2組，正好是檢測出酵母菌的2組，所以有氧腐敗很可能是相關(guān)酵母菌引起的。He[35]也報道了類似的情況，添加辣木后降低了青貯的有氧穩(wěn)定性，可能是由于辣木葉提高了青貯中乳酸和WSC含量，且降低了乙酸和丙酸等抗菌成分的含量。但是，通過添加LF可明顯提高青貯的有氧穩(wěn)定性，即使添加了辣木葉的玉米秸稈青貯也未出現(xiàn)有氧腐敗，可能是LF抑制了酵母菌的生長。通過以上的試驗結(jié)果表明，添加辣木葉可以改善玉米秸稈青貯的發(fā)酵質(zhì)量，提高營養(yǎng)價值，而添加LF可提高玉米秸稈青貯的有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本研究表明，在玉米秸稈青貯中添加辣木葉可降低pH值、大腸桿菌數(shù)量，使乙酸、氨態(tài)氮、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量下降，同時辣木葉可以增加蛋白質(zhì)和乳酸含量，但會降低青貯的有氧穩(wěn)定性。香腸乳桿菌可以減少玉米秸稈青貯中大腸桿菌和酵母菌的數(shù)量，同時提高青貯的有氧穩(wěn)定性。因此，將辣木葉與玉米秸稈混合青貯時，添加香腸乳桿菌能得到發(fā)酵效果更好，品質(zhì)更優(yōu)的青貯飼料。