田莉峰，伍瓊芳，夏雷震，王 娜，李小山

(1.江西省婦幼保健院輔助生殖中心，南昌 330006;2.吉安市婦幼保健院(兒童醫(yī)院)，吉安 343000;3.江西師范大學(xué)心理學(xué)院，南昌 330022)

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，囊胚培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛。與卵裂期胚胎移植相比，囊胚培養(yǎng)越過了胚胎基因組激活階段，可挑選更有發(fā)育潛能的胚胎，單囊胚移植不僅保障了臨床妊娠率和活產(chǎn)率，還明顯降低了多胎妊娠率及多胎妊娠并發(fā)癥的發(fā)生率[1]。囊胚培養(yǎng)延長(zhǎng)了胚胎在體外的時(shí)間，且近年來越來越多的研究報(bào)道了囊胚移植的產(chǎn)科并發(fā)癥，如早產(chǎn)[2-3]、先天畸形[4]、男/女性別比例增加[5]等。對(duì)于移植凍融卵裂期胚胎或囊胚，各研究結(jié)果不同[6]。因此，對(duì)卵裂期胚胎移植及囊胚移植的臨床結(jié)局進(jìn)行分析，可為臨床醫(yī)生及患者選擇合適的移植策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015-01至2018-06在江西省婦幼保健院輔助生殖中心接受輔助生殖技術(shù)助孕治療的患者，共2176個(gè)周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：凍融胚胎移植患者；移植后1個(gè)月B超見宮內(nèi)單孕囊單胚芽妊娠者。排除標(biāo)準(zhǔn)：供精I(xiàn)VF周期來源的胚胎；PGT周期來源胚胎?；颊呔炇鹬橥鈺?，研究遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 凍融胚胎移植方案 自然周期：患者月經(jīng)周期第10～12d開始監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，自排卵日開始黃體支持，黃體酮針劑40mg/d，根據(jù)患者冷凍胚胎的日齡，排卵后第3～5d行凍融胚胎移植，復(fù)蘇1～2枚D3或D5/D6胚胎，在腹部B超引導(dǎo)下進(jìn)行移植。移植后改用雪諾酮90mg/d放陰道。移植后12d抽血判斷是否生化妊娠，移植后30d經(jīng)陰道B超檢查確定臨床妊娠后，繼續(xù)雪諾酮90mg/d+地屈孕酮片20mg/d至孕10周。人工替代周期：月經(jīng)第2～3d給予補(bǔ)佳樂(戊酸雌二醇片，1mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司)4～8mg/d，至內(nèi)膜≥0.7cm時(shí)，給予黃體酮針劑80mg/d。根據(jù)患者冷凍胚胎的日齡，黃體轉(zhuǎn)化后4～6d行凍胚移植，移植后改用雪諾酮90mg/d放陰道和口服地屈孕酮20mg/d。移植后12d抽血確定生化妊娠，移植后30d經(jīng)陰道B超確定臨床妊娠后，繼續(xù)雪諾酮+地屈孕酮片黃體支持至孕10周。降調(diào)節(jié)人工替代周期：在患者月經(jīng)來潮第2～3d肌肉注射促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)(貝依，3.75mg/支，上海麗珠公司)3.75mg，28～30d后開始給予補(bǔ)佳樂，其余流程同人工替代周期。

1.3 胚胎培養(yǎng)及評(píng)級(jí) 使用Vitrolife序貫培養(yǎng)試劑(G1系列)進(jìn)行胚胎培養(yǎng)。取卵后48h和72h即第2d和第3d上午各評(píng)估胚胎1次。根據(jù)卵裂球大小均勻與否及無核碎片量進(jìn)行胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)，將胚胎分為4級(jí)。Ⅰ級(jí)：胚胎卵裂球連接良好、均勻、規(guī)則、有中等折光性，透明帶完整，碎片≤5%；Ⅱ級(jí)：卵裂球形態(tài)規(guī)則或輕度不規(guī)則，均勻或稍欠均勻，折光度有輕微變化，碎片≤20%；Ⅲ級(jí)：胚胎內(nèi)碎片少于50%，碎片外卵裂球形態(tài)同Ⅱ級(jí)，具有一定折光性，透明帶完整；Ⅳ級(jí)：胚胎內(nèi)碎片≥50%，碎片外卵裂球具有生存活力。根據(jù)這個(gè)評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將D2為3～5細(xì)胞數(shù)、D3為7～9細(xì)胞數(shù)的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎評(píng)為優(yōu)質(zhì)胚胎(D2至D3只發(fā)育了2個(gè)卵裂球的胚胎除外)。胚胎第1d下午觀察有對(duì)稱的2細(xì)胞分裂，為胚胎早期卵裂。選擇D2-3天優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍保存。

囊胚培養(yǎng)：D3胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液G2(瑞典vitrolife公司)行囊胚培養(yǎng)至D5/D6，囊胚評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)選用Gardner的標(biāo)準(zhǔn)[7]。根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵化程度將囊胚分為1～6期；對(duì)于3～6期囊胚，還需對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。1期：早期囊胚，囊胚腔體積<囊胚總體積的一半；2期：囊胚腔體積>囊胚總體積的一半；3期：完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚；4期：擴(kuò)張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚體積明顯擴(kuò)大，透明帶變??；5期：正在孵化的囊胚，囊胚正從透明帶破裂口孵出；6期：孵化出的囊胚，囊胚完全從透明帶中孵出。

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)評(píng)分：A級(jí)，細(xì)胞數(shù)多，結(jié)合緊密；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)目少，結(jié)合較散；C級(jí)，細(xì)胞數(shù)極少。

滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(trophetoderm cell,TE)評(píng)分：A級(jí)，細(xì)胞數(shù)多，囊胚四周均有細(xì)胞分布；B級(jí)，細(xì)胞數(shù)較少，上皮細(xì)胞較松散；C級(jí)，細(xì)胞數(shù)極少。

選擇受精后第5d選擇3期以上囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍，如無3期以上囊胚，培養(yǎng)至第6d，如無4期以上囊胚，放棄冷凍。將D5～6囊胚分期≥3期，且其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)為A或B級(jí)定為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.4 觀察指標(biāo) 收集患者的一般資料，年齡、不孕原因、不孕年限及治療情況。記錄移植胚胎數(shù)及胚胎日齡，移植胚胎后12d抽血查β-HCG，移植30d陰道B超檢測(cè)，B超檢查見孕囊者，則定義為臨床妊娠。妊娠12周以內(nèi)的妊娠失敗定義為早期流產(chǎn)。通過電話定期跟蹤指導(dǎo)直至妊娠結(jié)束，記錄妊娠的經(jīng)過、分娩時(shí)間、分娩方式和并發(fā)癥，新生兒的性別、出生體重及畸形情況。

2 結(jié) 果

2.1 凍融周期患者的一般資料比較 凍融卵裂期胚胎移植組與囊胚移植組患者的年齡、抗繆勒管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)、竇卵泡計(jì)數(shù)(antral follicle counting,AFC)、不孕年限、繼發(fā)不孕癥占比、排卵障礙占比、單胚移植占比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者的BMI，以及管性因素、男性因素及子宮內(nèi)膜異位癥不孕癥比例均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 凍融卵裂期胚胎與囊胚移植患者的一般資料比較

2.2 凍融周期孕期流產(chǎn)情況及母親孕期并發(fā)癥比較 凍融囊胚移植組患者的流產(chǎn)率較卵裂期胚胎移植組略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組的孕期并發(fā)癥發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 凍融卵裂期胚胎與囊胚移植孕期流產(chǎn)情況及母親并發(fā)癥比較

2.3 凍融周期新生兒出生結(jié)局比較 凍融囊胚組患者的分娩孕周較卵裂期組更短，新生兒男女性別比例更高(1.42∶1 vs 1.09∶1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組新生兒出生體重、出生缺陷比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。囊胚組新生兒心臟畸形(0.76% vs 0.20%)、神經(jīng)管畸形(0.25% vs 0.10%)、消化系統(tǒng)畸形(0.25% vs 0%)略高于卵裂期組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 凍融卵裂期胚胎與囊胚移植新生兒出生結(jié)局比較

2.4 兩組出生性別比、出生體重、孕周多元回歸分析 為避免混雜因素對(duì)出生結(jié)局的影響，使用多元logistic逐步回歸及多元線性回歸的方法來調(diào)整所有潛在的混雜因素，篩選出差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)列入表4中。關(guān)于出生性別比，納入變量包含胚胎日齡、年齡、不孕年限、不孕類型、排卵障礙、移胚數(shù)，經(jīng)過多元logistic回歸分析后，發(fā)現(xiàn)胚胎日齡對(duì)出生性別比有影響(P<0.05)。關(guān)于出生體重，納入變量包含胚胎日齡、年齡、不孕年限、不孕類型、排卵障礙、移胚數(shù)、出生性別，通過多元線性逐步回歸分析后，發(fā)現(xiàn)出生性別影響新生兒出生體重(P<0.05)。關(guān)于孕周，納入變量包含胚胎日齡、年齡、BMI、不孕年限、不孕類型、排卵障礙、瘢痕子宮、移胚數(shù)、出生性別，通過多元線性逐步回歸分析后，發(fā)現(xiàn)胚胎日齡、繼發(fā)不孕、瘢痕子宮及BMI均對(duì)孕周有影響(P<0.05)。見表4。

表4 出生性別比、出生體重、孕周多元逐步線性/logistic回歸

3 討 論

胚胎在體外培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)是否影響輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)母嬰安全及子代健康?對(duì)于單胎妊娠者移植囊胚的早產(chǎn)率是否高于卵裂期胚胎患者，國(guó)內(nèi)外各研究結(jié)果不同。Dar等[3]和Martins等[8]研究發(fā)現(xiàn)，囊胚移植顯著增加單胎早產(chǎn)率和圍產(chǎn)兒死亡率。Feranando等[9]和De Vos等[10]研究發(fā)現(xiàn)，卵裂期胚胎和囊胚組的分娩孕周和出生體重?zé)o差異。2017年Wang等[11]meta分析結(jié)果顯示，在新鮮胚胎移植周期中，移植囊胚的早產(chǎn)和極早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)較卵裂期胚胎增加，而在凍融胚胎周期中無差異。上述研究中關(guān)于移植囊胚是否增加早產(chǎn)的結(jié)論不同，這可能與研究樣本量不同及未區(qū)分新鮮還是凍融周期有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，凍融囊胚組的新生兒出生孕周小于凍融卵裂期組[(38.35±1.91)周 vs (38.65±1.73)周]，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)多元回歸分析調(diào)整混雜因素后發(fā)現(xiàn)，胚胎日齡、繼發(fā)不孕、瘢痕子宮及BMI均對(duì)孕周有影響(P<0.05)。囊胚移植可能增加早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量有關(guān)。本研究為避免雙胎導(dǎo)致的早產(chǎn)對(duì)出生結(jié)局的影響，選擇超聲檢查后為單孕囊單胚芽妊娠的患者，減少了多胎對(duì)早產(chǎn)的影響。未來需更大樣本量及多中心的研究結(jié)果來進(jìn)一步驗(yàn)證。

2018年Holden等[12]發(fā)現(xiàn)，凍融囊胚較卵裂期胚胎移植改善了妊娠結(jié)局，且兩組的新生兒出生結(jié)局相似。2019年Zhang等[13]對(duì)凍融卵裂期胚胎及囊胚移植后4201個(gè)單胎分娩的新生兒出生體重進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)組間平均出生體重比較無差異，但是囊胚組大于胎齡兒(large for gestational age,LGA)出生比例、出生性別比及年齡別體重Z評(píng)分(用于評(píng)估新生兒生長(zhǎng)發(fā)育情況)均高于卵裂期胚胎組。經(jīng)多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，出生體重和移胚數(shù)呈正相關(guān)。凍融囊胚移植增加新生兒出生體重，這與新生兒性別及Z評(píng)分相關(guān)。本研究中囊胚組新生兒出生體重較卵裂期胚胎組高(3409.9±516.2 vs 3364.6±502.2)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)多元回歸分析后發(fā)現(xiàn)，出生性別影響出生體重(P<0.05)。囊胚組男女出生性別比高于卵裂期胚胎組，這可能影響了新生兒的出生體重。

關(guān)于新生兒出生缺陷及母親孕期并發(fā)癥，各研究結(jié)果不同。有研究發(fā)現(xiàn)[14-16]，與卵裂期胚胎相比，囊胚組的圍產(chǎn)期死亡率和妊娠期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更高。但有研究[9,17-18]指出，囊胚與卵裂期胚胎移植后的母親孕期并發(fā)癥和新生兒出生結(jié)局相似。Shi等[19]研究顯示，兩組的出生缺陷、早產(chǎn)、低及極低出生體重方面無差異，但囊胚組男/女性別比增高。Hargreave等[20]在2019年JAMA上發(fā)表了一項(xiàng)對(duì)丹麥長(zhǎng)達(dá)16年的1085172例大樣本的凍融胚胎出生子代健康研究顯示，F(xiàn)ET出生兒童的癌癥患病風(fēng)險(xiǎn)高于正常妊娠出生兒童。其他類型的輔助生殖技術(shù)，如IVF(HR0.96，95%CI0.70～1.32)和ICSI(HR1.33，95%CI0.94～1.89)與兒童癌癥之間沒有任何顯著的關(guān)系，只有FET才有。不同的不孕癥治療方式，包括使用助孕藥物(如克羅米芬、促性腺激素、促性腺激素釋放激素類似物、人絨毛膜促性腺激素、孕酮及雌激素)與兒童癌癥之間也沒有明顯的關(guān)系。冷凍胚胎移植的相關(guān)效應(yīng)也不局限于兒童癌癥，與新鮮胚胎移植后出生的兒童相比，凍融胚胎出生的兒童有更高的平均出生體重及大孕周風(fēng)險(xiǎn)。Hargreave等[20]研究顯示，冷凍保存技術(shù)可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)變化，從而影響胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)。胎兒過度生長(zhǎng)與兒童癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，可能是表觀遺傳學(xué)改變所致。本研究中囊胚組出生缺陷及孕期并發(fā)癥與卵裂期胚胎組相比均無差異。未來還需對(duì)輔助生殖技術(shù)助孕的母兒進(jìn)行更大樣本及更長(zhǎng)期的隨訪，以了解母親及子代的遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)是否高于正常人群。

本研究還發(fā)現(xiàn)，囊胚組的男/女性別比顯著高于卵裂期胚胎組(1.42 vs 1.09,P<0.05)；經(jīng)多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，移植胚胎的日齡影響出生性別(P<0.05)。研究表明，在自然妊娠中影響出生性別的因素包括父母年齡[21]、生活方式[22]以及接觸二噁英[23]等。而在ART過程中，影響出生性別的因素主要包括受精方式(IVF或ICSI)[24]、胚胎日齡等[25-26]。早前關(guān)于鼠類和豬的研究表明[27-28]，與雄性胚胎相比，雌性胚胎分裂和發(fā)育速度更慢。而在人類，關(guān)于植入前胚胎的研究表明，雄性胚胎的發(fā)育速度明顯高于雌性[29]，從受精后第2日開始，雄性胚胎發(fā)育速度較雌性至少提前4.5h[30]。Bouillon等[31]移植了第5日擴(kuò)張率最高的胚胎，發(fā)現(xiàn)此類胚胎子代男性比例顯著增加。細(xì)胞數(shù)越多、分裂速度越快的胚胎，男性的概率越大，因此，男性胚胎被選為優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行移植的概率也越大[24,32]。此外，調(diào)控抗氧化、葡萄糖攝取和新陳代謝的基因位于X染色體，而這些基因或其調(diào)控的某些酶活性可能影響雌性胚胎的發(fā)育速度[24]。據(jù)聯(lián)合國(guó)相關(guān)研究，傳統(tǒng)自然妊娠出生嬰兒男/女比值在1.02～1.07之間。隨著ART技術(shù)的發(fā)展，胚胎培養(yǎng)技術(shù)的成熟，囊胚培養(yǎng)在ART中的應(yīng)用越來越廣泛。Chang[5]及丁錦麗等[33]的meta分析，比較了不同時(shí)間及不同地域，囊胚與卵裂期胚胎移植后子代男/女比值，結(jié)果表明囊胚移植后男/女比值顯著高于卵裂期胚胎(OR=1.29，95%CI=1.10～1.51)(OR=1.12，95%CI=1.07～1.16)，且不受時(shí)間和地域的影響。

綜上所述，與移植卵裂期胚胎相比，囊胚不增加新生兒出生缺陷及孕期并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，但可能增加子代男性出生比例。未來需要更多、更詳細(xì)的圍產(chǎn)期數(shù)據(jù)、更大樣本量及更長(zhǎng)遠(yuǎn)的產(chǎn)后隨訪研究，以幫助研究卵裂期與囊胚移植后單胎妊娠短期的嬰兒期和長(zhǎng)期的兒童發(fā)育的差異，及人口性別比例改變可能帶來的社會(huì)影響，從而為臨床治療提供更多有力的證據(jù)。囊胚移植可提高種植率，但如何平衡妊娠率、多胎率、卵巢過度刺激、母嬰并發(fā)癥及子代健康等潛在風(fēng)險(xiǎn)?未來的研究可專注于：(1)優(yōu)化挑選胚胎的方法以提高妊娠率；(2)優(yōu)化胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)，允許體外長(zhǎng)期、安全地培養(yǎng)人類胚胎；(3)研發(fā)出預(yù)測(cè)妊娠率高的胚胎的生物標(biāo)記物?？傊?，在今后的臨床移植策略制定過程中，需考慮囊胚移植的這些可能的影響。