任琛琛,楊 欣,楊 立,李飛燕,朱遠(yuǎn)航,蔣冬媛,鄭婭婷,姬笑影,田 玥

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,鄭州 450052)

宮頸癌是全球主要影響女性生殖健康的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家，宮頸癌占世界女性癌癥死亡病例的60%以上[1-2]。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk humanpapilloma virus,HR-HPV)感染是宮頸癌及其癌前病變的主要病因[3-4]。大多數(shù)患者感染HPV病毒后，能通過宿主免疫反應(yīng)清除病毒,而高危型HPV持續(xù)存在與宮頸病變的進(jìn)展密切相關(guān)。宮頸暴露于陰道微環(huán)境中，陰道局部免疫狀態(tài)與其轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[5]。大多數(shù)機(jī)體抗腫瘤免疫時(shí)，細(xì)胞免疫為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，而體液免疫可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。如果機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答受到抑制，向體液免疫細(xì)胞漂移，則不利于病毒的清除[7]。推測(cè)HPV感染的持續(xù)存在與陰道局部體液免疫有密切聯(lián)系，而IL-10作為體液免疫的主要因子，可能對(duì)宮頸病變的發(fā)生發(fā)展有重要作用。研究表明，IL-10介導(dǎo)的JAK1/TYK2/STAT3通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用[8]。但I(xiàn)L-10是否通過此通路影響宮頸病變，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-10在宮頸組織和陰道灌洗液中的表達(dá)水平及是否通過JAK1/TYK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)正常宮頸上皮細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，探討其影響宮頸病變發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2018年12月至2019年6月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的宮頸病變患者的宮頸組織120例，其中宮頸低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(low-squamous intraepithelial lesion,LSIL)30例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(high-squamous intraepithelial lesion,HSIL)30例，宮頸鱗癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)60例。選取同期因子宮肌瘤并行全子宮切除術(shù)患者的宮頸組織30例。收集上述患者術(shù)前陰道分泌物、陰道灌洗液及宮頸脫落細(xì)胞。對(duì)照組、LSIL組、HSIL組、宮頸鱗癌組患者的平均年齡分別為(38±3)歲、(36±5)歲、(39±5)歲、(40±6)歲，四組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。60例宮頸鱗癌患者中I～I(xiàn)I期45例，III～I(xiàn)V期15例。LSIL、HSIL及CSCC組納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；病理明確診斷為LSIL、HSIL或?qū)m頸鱗癌；術(shù)前未接受過放、化療。正常宮頸組納入標(biāo)準(zhǔn)：因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)者；宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查未見異常。所有標(biāo)本均經(jīng)本院病理科醫(yī)師證實(shí),患者均知情同意，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株與試劑 人正常宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic由其他課題組贈(zèng)送；Elisa試劑盒購于武漢云克隆公司；IL-10過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-IL-10)及空載質(zhì)粒構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P公司完成；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Boster公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 3000購于美國Invitrogen公司；熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒購于biosharp公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR SYBR Green試劑盒購于自生工生物工程(上海)股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、Transewell小室、CCK-8檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；PF06700841購于美國Glpbio公司；一抗購于英國Abcam公司；二抗試劑盒購于北京康為世紀(jì)公司。

1.3 患者HPV E6/E7感染及陰道微生態(tài)情況 患者入院后收集宮頸分泌物及陰道分泌物，行HPV E6/E7感染檢查、陰道微生態(tài)環(huán)境檢查。(1)HPV E6/E7檢查。患者取截石位，用專用宮頸刷對(duì)宮頸鱗柱狀上皮移行處和后穹窿處刷取分泌物與細(xì)胞，對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV E6/E7檢測(cè);(2)陰道微生態(tài)環(huán)境檢查?；颊呷〗厥唬杉幍婪置谖?，統(tǒng)一使用消毒棉簽自陰道穹窿后部或陰道內(nèi)壁處進(jìn)行取樣。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者月經(jīng)期及檢查24h內(nèi)存在性生活、陰道用藥史等情況者。檢測(cè)標(biāo)本中微生態(tài)環(huán)境(白細(xì)胞、陰道pH值、乳酸桿菌)、細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV)、滴蟲性陰道炎(trichomonal vaginitis,TV)、外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)。上述任何1項(xiàng)異常，均可診斷為微生態(tài)失衡[9]，計(jì)算陰道微生態(tài)失衡率。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 ELISA實(shí)驗(yàn)分析陰道灌洗液中IL-10表達(dá)水平 充分暴露患者陰道及宮頸，用無菌生理鹽水沖洗宮頸陰道部與陰道壁上1/3處3次，用專用試劑管于陰道后穹窿吸取灌洗液3mL，室溫離心5min，取上清分裝并置于-80℃冰箱備用，標(biāo)本不能混有血液。按IL-10檢測(cè)試劑盒(SEA056Hu 96T)說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上讀出各個(gè)孔相對(duì)應(yīng)的OD450值。結(jié)果判讀：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值；以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的OD450值作為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出相應(yīng)的位置樣本中IL-10含量。

1.4.2 免疫組化法分析宮頸組織中IL-10表達(dá)水平 按說明書進(jìn)行操作。參照Mattern等[10]方法進(jìn)行判定：隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，以細(xì)胞漿或細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色為陽性細(xì)胞。染色深度:未見染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比:未見染色為0分，染色細(xì)胞小于25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。兩方面得分相加，0～2分判為陰性表達(dá)，>2分判為陽性表達(dá)。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人宮頸上皮細(xì)胞Hcerepic用DMEM高糖培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔1d更換新鮮的培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合達(dá)到約80%時(shí)，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將Hcerepic細(xì)胞按5×105細(xì)胞/孔接種于6孔板，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染率大于80%即為轉(zhuǎn)染成功[11]。PF06700841為JAK1和TYK2的抑制劑。轉(zhuǎn)染攜帶IL-10質(zhì)粒的細(xì)胞記為IL-10組，轉(zhuǎn)染攜帶空質(zhì)粒的細(xì)胞記為載體對(duì)照組，加有抑制劑組為IL-10+PF06700841組。抑制劑PF06700841作用濃度確定：將不同濃度PF06700841(0nmol/L,5nmol/L,10nmol/L,15nmol/L,20nmol/L,25nmol/L,30nmol/L,50nmol/L)加過表達(dá)IL-10的宮頸上皮細(xì)胞，采用CCK-8分別在0h、12h、24h、48h檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，PF06700841抑制效率具有時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間延長抑制效率增加，但在24h穩(wěn)定在最大抑制水平，此時(shí)半數(shù)抑制濃度為20nmol/L。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 消化離心收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，加1mL RNAiso Plus提取液提取總RNA，按試劑盒說明書操作，得到RNA用DEPC水溶解后，檢測(cè)濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄，立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，采用20μL體系，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃退火30s，40次循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，按2-ΔΔCT計(jì)算兩組細(xì)胞表達(dá)的變化量。IL-10引物序列：F:GGAGGAGGTGATGCCCCAAG；R:ATCGATGACAGCGCCGTAG；GAPDH引物序列：F：CCTTCCGTGTCCCCACT；R：GCCTGCTTCACCACCTTC。

1.4.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將消化對(duì)數(shù)期生長的HcerEpic細(xì)胞按5×105細(xì)胞/孔接種于6孔板。待細(xì)胞均勻長滿6孔板底部時(shí)，用200μL槍頭垂直6孔板底部劃線，槍頭垂直，不傾斜，PBS清洗2次，加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0h、24h、48h在顯微鏡下拍照。

1.4.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 分別取各組HcerEpic細(xì)胞，消化后收集，用培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。小室中加含2×105細(xì)胞/孔的無血清單細(xì)胞懸液200μL，下室加650μL 15%培養(yǎng)基，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，4%多聚甲醛固定15min，0.1%的結(jié)晶紫染色30min，PBS洗滌2次，自然風(fēng)干后在顯微鏡下拍照。

1.4.7 CCK-8法 轉(zhuǎn)染前24h，各組細(xì)胞胰酶消化，按2000細(xì)胞/孔接種至96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)24、48、72、96h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，3h后取出，用酶標(biāo)儀比色，檢測(cè)波長450nm處吸光度，收集數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.8 Western blot實(shí)驗(yàn) IL-10基因轉(zhuǎn)染HcerEpic細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，按說明書提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度。蛋白熱變性后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，每孔蛋白上樣量5μg，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，孵育一抗，4℃過夜，次晨復(fù)溫，TBST洗膜4次，每次10min。搖床上常溫孵育二抗1h，TBST洗膜4次，每次10min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，用Image J計(jì)算灰度。

2 結(jié) 果

2.1 各組HPV E6/E7感染、陰道微生態(tài)及陰道灌洗液IL-10濃度情況 各組分泌物陰道微生態(tài)分布見表1。隨著宮頸病變程度的加重，HPV E6/E7陽性率、陰道微生態(tài)失衡率及陰道灌洗液中IL-10濃度升高。陰道微生態(tài)失衡與陰道灌洗液中IL-10濃度呈正相關(guān)(r=0.575，P<0.001)。見表2。

表1 各組分泌物陰道微生態(tài)分布[n(%)]

表2 各組HPV E6/E7感染、陰道微生態(tài)及陰道灌洗液IL-10濃度情況比較

2.2 IL-10在組織中的表達(dá) 宮頸組織中IL-10染色為棕褐色顆粒，多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核(圖1)。IL-10在正常宮頸組織、LSIL、HSIL、宮頸鱗癌組織中陽性表達(dá)率分別為16.67%、40%、70%和90%，四組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.736，P<0.001)。組間兩兩相比:宮頸鱗癌組陽性率高于HSIL組(χ2=5.760，P<0.05)，HSIL組高于LSIL組(χ2=5.455，P<0.05)，LSIL組高于正常宮頸組(χ2=4.022，P<0.05)。

圖1 免疫組化檢測(cè)IL-10表達(dá)(×40)

2.3 HcerEpic細(xì)胞轉(zhuǎn)染后IL-10的表達(dá)水平 熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后HcerEpic細(xì)胞中大量表達(dá)綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染率均>90%。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與載體對(duì)照組(0.846±0.134)相比，轉(zhuǎn)染后IL-10 mRNA表達(dá)(537.161±56.117)顯著提高(t=16.547,P=0.004)。

2.4 細(xì)胞增殖情況 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后第24、48、72h，與載體對(duì)照組及IL-10+PF06700841組相比，IL-10組細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng)(P<0.05)；載體對(duì)照組與IL-10+PF06700841組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 各組HcerEpic細(xì)胞增殖活性的比較

2.5 細(xì)胞遷移及侵襲情況 細(xì)胞劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與載體對(duì)照組相比，IL-10組細(xì)胞劃痕愈合速度加快，細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著增多。IL-10+PF06700841組愈合速度慢于IL-10組,細(xì)胞侵襲數(shù)量少于IL-10組。見圖2、3。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞體外侵襲、遷移能力(×40)

2.6 細(xì)胞中通路蛋白表達(dá)情況 與載體對(duì)照組相比，IL-10組中JAK1、TYK2、STAT3、MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)；與IL-10組相比，IL-10+PF06700841組中STAT3、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)；IL-10+PF06700841組與載體對(duì)照組的STAT3、MMP-9蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖3 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞體外侵襲能力(×400)

圖4 過表達(dá)IL-10及PF06700841對(duì)通路蛋白的影響

3 討 論

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位，在某些發(fā)展中國家甚至位居首位[12]，是危害我國女性健康與生命的重要疾病，從分子水平揭示其侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。細(xì)胞因子IL-10是一種重要的抗炎因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，在陰道局部微環(huán)境中可由宮頸上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，也可由HR-HPV感染后刺激產(chǎn)生[13]。本研究表明，IL-10表達(dá)的陽性率隨著宮頸病變進(jìn)展逐漸增高，提示IL-10在宮頸病變的發(fā)展過程中起促癌作用，這與薛旻等[14]研究結(jié)果相一致。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7陽性患者陰道灌洗液中IL-10水平升高，提示陰道局部免疫狀態(tài)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程有密切關(guān)聯(lián)[5]。本研究結(jié)果表明，HPV E6/E7陽性，即高危型HPV病毒持續(xù)感染的患者，陰道局部微生態(tài)失衡率較HPV E6/E7陰性患者升高，且陰道灌洗液中IL-10濃度與陰道微生態(tài)失衡呈正相關(guān)。提示陰道微環(huán)境中的IL-10因子為HPV感染提供了易感的微生態(tài)環(huán)境，從而引發(fā)宮頸病變的發(fā)生。但本研究樣本量少，且相關(guān)系數(shù)與預(yù)期結(jié)果有一定差距。

IL-10與多種腫瘤，如胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌等相關(guān)，其在宮頸病變的發(fā)生發(fā)展中同樣起到了重要作用[15]。JAK1/TYK2/STAT3通路是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此信號(hào)通路的持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化[16]，在這個(gè)通路中，JAK上游信號(hào)的持續(xù)激活是STAT3持續(xù)表達(dá)的主要機(jī)制，而STAT3已被確認(rèn)為癌基因，其過度激活增強(qiáng)了EMT、腫瘤血管生成、ECM降解等多個(gè)環(huán)節(jié)的發(fā)生，從而促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，STAT3的激活能誘發(fā)與慢性炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子、趨化因子和其他介質(zhì)的表達(dá)和釋放，這些炎癥介質(zhì)在誘導(dǎo)和維持促癌炎癥環(huán)境中起著關(guān)鍵作用[17]。Chen等[18]研究表明，STAT3在宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa細(xì)胞中異?；罨?，表明STAT3信號(hào)通路在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。本研究結(jié)果顯示，IL-10可促進(jìn)正常宮頸上皮細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，JAK1、TYK2、STAT3及下游與細(xì)胞侵襲相關(guān)的MMP-9在IL-10過表達(dá)組細(xì)胞中高表達(dá)，而加JAK1/TYK2抑制劑PF06700841后，IL-10的作用被阻斷。表明IL-10通過JAK1/TYK2/STAT3通路影響宮頸病變的進(jìn)展。

綜上所述，陰道微環(huán)境中的IL-10因子為HPV感染提供了易感的微生態(tài)環(huán)境，IL-10可通過激活JAK1/TYK2/STAT3通路上調(diào)MMP-9表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，加速向?qū)m頸病變趨勢(shì)發(fā)展的進(jìn)程。今后，基于IL-10/JAK1/TYK2/STAT3細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)的腫瘤機(jī)制研究和藥物設(shè)計(jì)是值得思考的方向之一，控制陰道微生態(tài)平衡及抑制宮頸組織IL-10的分泌在阻斷宮頸病變發(fā)展及宮頸癌的靶向治療中可能具有重要價(jià)值。