張?zhí)?，王園園，張釗，葛乃嘉，尹學(xué)哲，鄭喜*，全吉淑*

1(延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉，133002)2(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉，133000)

草蓯蓉屬于寄生植物，寄生于樺本科上，生長(zhǎng)條件極為苛刻，喜歡在陰濕的環(huán)境生長(zhǎng)，在我國(guó)大興安嶺以及長(zhǎng)白山等地區(qū)分布較多[1]。草蓯蓉全草可入藥，因其有抗衰老作用又稱“不老草”，近些年來(lái)，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始重視草蓯蓉有效成分及其藥理作用研究[2]。其中草蓯蓉多糖(Boschnikiarossicapolysaccharides，BRPS)是草蓯蓉至關(guān)重要的活性成分[3]，具有保護(hù)肝臟、抗氧化應(yīng)激以及抗炎等作用[4-7]。

炎癥是人體的正常免疫反應(yīng)，屬于正常防御反應(yīng)之一，在通常情況下是對(duì)機(jī)體有益的；炎癥又是疾病進(jìn)展的重要因素之一，如不加以阻止就會(huì)引起自身免疫性疾病、癌癥、心血管疾病及糖尿病等多種疾病，將嚴(yán)重威脅人類生命健康及安全[8-9]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，目前是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥最常見的、危害最為嚴(yán)重的致炎因子[8-9]。因此，在本研究中利用LPS刺激小鼠J774A.1細(xì)胞建立巨噬細(xì)胞炎癥模型，探討草蓯蓉多糖對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制，皆為在其抗炎方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與材料

草蓯蓉，中國(guó)長(zhǎng)白山，常規(guī)方法提取含量為86.5% 的草蓯蓉多糖[3, 10]；小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞，美國(guó)ATCC公司。

1.2 主要試劑

LPS，美國(guó)Sigma公司；環(huán)氧合酶-2(COX-2)抗體、Toll樣受體4(TLR4)抗體、白介素-1受體相關(guān)激酶4(IRAK4)抗體、髓樣分化因子88(MyD88)抗體、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)抗體以及Lamin B1抗體，美國(guó)CST公司；β-action抗體，ABclonal公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗，中國(guó)納川生物有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，中國(guó)上海研瑾有限責(zé)任公司；核蛋白提取試劑盒，索萊寶有限公司；細(xì)胞增殖毒性試劑盒，中國(guó)北京莊盟科技公司。

1.3 主要儀器

RT-2100型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；UVP全自動(dòng)凝膠成像儀，美國(guó)UVP公司；DYCZ-24DN電泳儀，北京市六一生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞放置于含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4.2 LPS誘導(dǎo)J774A.1巨噬細(xì)胞建立炎癥模型

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J774A.1細(xì)胞，以密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，換成含有0、100、200、500、1 000、2 000 μg/L LPS的培養(yǎng)液。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。LPS作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中作用2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，如公式(1)所示。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟，檢測(cè)培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6含量。

(1)

1.4.3 BRPS對(duì)J774A.1細(xì)胞的毒性作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J774A.1細(xì)胞，以密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，換成含有0、12.5、25、50、100、200 mg/L BRPS的培養(yǎng)液。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。BRPS作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中作用2 h，測(cè)定492 nm處的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.4 細(xì)胞分組及處理

J774A.1細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、BRPS低、中、高劑量組(又稱BRPS25組、BRPS50組和BRPS100組，BRPS質(zhì)量濃度分別為25、50和100 mg/L)[11]。正常組與模型組加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h；BRPS組加入相應(yīng)濃度BRPS的DMEM培養(yǎng)液，作用24 h。隨后，除正常組換新的無(wú)血清培養(yǎng)液作用1 h 外，模型組與BRPS組均加入100 μg/L LPS，作用1 h。

1.4.5 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞IL-6、TNF-α和IL-1β分泌的影響

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟，檢測(cè)小鼠J774A.1細(xì)胞IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子的分泌情況。

1.4.6 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞分組以及處理同方法1.4.4，收集各組細(xì)胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液收集細(xì)胞全蛋白。利用核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，5%(體積分?jǐn)?shù))的脫脂牛奶封閉1 h后，一抗4 ℃過(guò)夜，相應(yīng)二抗25 ℃孵育2 h，ECL顯色，并用UVP全自動(dòng)化學(xué)成像儀分析相對(duì)灰度比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)J774A.1巨噬細(xì)胞的炎癥模型

如圖1所示，不同濃度的LPS刺激對(duì)J774A.1細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響(P>0.05)，但可顯著提高J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α的含量(P<0.05)，提示巨噬細(xì)胞炎癥模型成功。因此，本實(shí)驗(yàn)中J774A.1細(xì)胞炎癥模型的構(gòu)建均采用濃度為100 μg/L 的LPS處理J774A.1細(xì)胞1 h。

a-細(xì)胞存活率；b-IL-6；c-TNF-α圖1 LPS誘導(dǎo)的J774A.1巨噬細(xì)胞炎癥模型的構(gòu)建Fig.1 Construction of LPS-induced J774A.1 macrophage inflammation model 注：與正常組比較，*P<0.05

2.2 BRPS對(duì)J774A.1細(xì)胞的毒性作用

如圖2所示，BRPS濃度為0～100 mg/L時(shí)，J774A.1細(xì)胞存活率均在90%以上。因此，BRPS濃度小于100 mg/L時(shí)對(duì)J774A.1細(xì)胞沒有毒性作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將25、50和100 mg/L分別選定為BRPS低、中、高劑量組的藥物處理濃度。

圖2 BRPS對(duì)J774A.1細(xì)胞的毒性作用Fig.2 Effect of BRPS on the viability of J774A.1 cells

2.3 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌的影響

如表1所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，BRPS組TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明BRPS對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

表1 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Table 1 Effects of BRPS on LPS-induced secretion of inflammatory factors in J774A.1 cells

2.4 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3所示，與正常組比較，模型組COX-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，BRPS中、高劑量組COX-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 BRPS對(duì)J774A.1細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of BRPS on protein expression of COX-2 in J774A.1 cells 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05(下同)

2.5 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)水平的影響

如圖4所示，與正常組比較，模型組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，BRPS中、高劑量組的TLR4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖4 BRPS對(duì)J774A.1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of BRPS on expression of TLR4 protein in J774A.1 cells

2.6 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)水平的影響

如圖5所示，與正常組比較，模型組MyD88蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，BRPS組MyD88蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖5 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞MyD88蛋白 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of BRPS on protein expression of MyD88 in LPS-stimulated J774A.1 cells

2.7 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞IRAK4蛋白表達(dá)水平的影響

如圖6所示，與正常組比較，模型組IRAK4蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，BRPS組IRAK4蛋白水平降低(P<0.05)。

圖6 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞IRAK4 蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of BRPS on protein expression of IRAK4 in LPS-stimulated J774A.1 cells

2.8 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞核的NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

如圖7所示，與正常比較，模型組細(xì)胞核中的NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),與模型組比較，BRPS中、高劑量組的細(xì)胞核NF-κB蛋白水平明顯降低(P<0.05)。

圖7 BRPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞核NF-κB 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of BRPS on protein expression of nuclear NF-κB in LPS-stimulated J774A.1 cells

3 討論

炎癥反應(yīng)屬于人體正常防御反應(yīng)，在機(jī)體受到損傷時(shí)起到保護(hù)性作用，巨噬細(xì)胞恢復(fù)正常表型通常是成功解決或修復(fù)組織損傷的表現(xiàn)之一[12-13]。LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，可作為毒性因子起作用，因此常被用于炎癥模型的研究[14-17]。巨噬細(xì)胞作為促炎因子的主要來(lái)源，在炎癥疾病中起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)以LPS為誘導(dǎo)劑，小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，建立J774A.1巨噬細(xì)胞炎癥模型，研究BRPS對(duì)小鼠J774A.1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制。

LPS刺激巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生和分泌大量炎癥因子，其中IL-1、TNF-α和IL-6在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。IL-1是對(duì)各種炎癥和感染性刺激反應(yīng)所產(chǎn)生的炎癥因子，可分為IL-1α和IL-1β 2種，其中IL-1β是啟動(dòng)和維持局部及全身炎癥反應(yīng)的一種重要炎癥因子，主要通過(guò)IL-6和C反應(yīng)蛋白發(fā)揮作用[18-19]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，IL-6迅速被刺激和表達(dá)，這有助于防御機(jī)體感染；而C反應(yīng)蛋白作為炎癥生物標(biāo)志物，其合成主要受IL-6控制[20]。TNF-α是機(jī)體內(nèi)主要的炎癥細(xì)胞因子之一，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵參與者[21]。本實(shí)驗(yàn)中，用100 μg/L LPS處理J774A.1細(xì)胞1 h，可顯著增高細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平，提示J774A.1細(xì)胞炎癥模型已成功構(gòu)建；而BRPS組IL-1β、IL-6和TNF-α水平較模型組顯著降低，表明BRPS對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

TLR4蛋白位于細(xì)胞膜上，主要表達(dá)在免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等，當(dāng)LPS與TLR4結(jié)合后，通過(guò)MyD88募集IRAK1/4，隨后觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB發(fā)生活化，調(diào)控其他炎癥因子如IL-6和TNF-α的合成，誘導(dǎo)COX-2蛋白；而COX-2是前列腺素生物合成的關(guān)鍵酶，可通過(guò)多種促炎因子被誘導(dǎo)[15, 22-26]。課題組前期研究顯示，小鼠炎性肝損傷模型中BRPS可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)起到抑制作用，從而起到肝保護(hù)作用[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠J774A.1細(xì)胞COX-2、TLR4、IRAK4、MyD88及細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)水平升高；與模型組比較，BRPS組COX-2、TLR4、IRAK4、MyD88以及細(xì)胞核NF-κB蛋白水平顯著降低,提示BRPS的抗炎作用可能與其抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān),這與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[27]。TLR4信號(hào)通路還可通過(guò)TAK1蛋白，激活與炎癥反應(yīng)相關(guān)的MAPK通路，其中JNK和p38通路與炎癥關(guān)系最為密切[28-29]。因此，研究BRPS如何通過(guò)MAPK通路調(diào)節(jié)小鼠J774A.1細(xì)胞炎癥反應(yīng)將是本課題組下一步的研究方向之一。

綜上所述，BRPS能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的J774A.1細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其抗炎作用可能與其抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。BRPS具有較強(qiáng)的抗炎作用，且水溶性好、無(wú)毒副作用，這些優(yōu)點(diǎn)有利于對(duì)草蓯蓉多糖的開發(fā)和利用。