劉海冬，劉偉，劉永樂(lè)，俞健，郭星辛，王發(fā)祥

(長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙, 410114)

冷凍面團(tuán)技術(shù)是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來(lái)的面點(diǎn)新工藝，是運(yùn)用冷凍原理與技術(shù)對(duì)面胚半成品進(jìn)行冷凍處理并冷凍保藏一段時(shí)間，待用時(shí)解凍，再銜接后續(xù)加工流程生產(chǎn)出成品[1]；相對(duì)傳統(tǒng)的面點(diǎn)加工和銷(xiāo)售方式，冷凍面團(tuán)相關(guān)產(chǎn)品具有安全、方便、利于標(biāo)準(zhǔn)化、適合連鎖生產(chǎn)等特點(diǎn)，在中央廚房模式和連鎖經(jīng)營(yíng)概念日益普及的背景下，是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵面制品工業(yè)化的必然趨勢(shì)。然而，由于在整形、醒發(fā)、烘烤(蒸制)流程的某個(gè)環(huán)節(jié)加入了冷凍貯藏工序，冷凍環(huán)節(jié)不可避免地會(huì)影響面團(tuán)品質(zhì)[2-3]。關(guān)于冷凍損害面團(tuán)品質(zhì)的機(jī)理，目前普遍認(rèn)為是冰晶形成導(dǎo)致面團(tuán)中酵母菌死亡、面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞、水分狀態(tài)改變等[4-6]。目前，添加合適的抗凍保護(hù)劑仍是改善面團(tuán)冷凍損害的最有效途徑，因此，研究和開(kāi)發(fā)高效抗凍劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

抗凍蛋白(肽)具有熱滯活性、修飾冰晶、抑制冰晶重結(jié)晶、保護(hù)細(xì)胞膜等特性[7-8]，近年來(lái)在提高酵母耐凍性能和改善冷凍面團(tuán)品質(zhì)方面的研究受到了廣泛關(guān)注[9]。如JIA等[10]從女貞葉中分離到一種熱穩(wěn)定性冰結(jié)構(gòu)蛋白，能降低酵母菌冷凍過(guò)程中的胞內(nèi)冰晶形成和還原性物質(zhì)釋放，從而提高酵母菌冷凍存活率；DING等[11]報(bào)道了大麥抗凍蛋白能改善面團(tuán)的熱性能，限制水分的遷移，對(duì)冷凍面團(tuán)具有很好的保護(hù)效果；GONG等[12]最近從絲膠蛋白水解物中篩選到一種絲膠肽，能顯著降低冷凍面團(tuán)的游離水含量、提高酵母的存活率。然而，目前很多天然的抗凍蛋白(肽)或處在實(shí)驗(yàn)室研究階段，或存在產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴、熱穩(wěn)定性差等問(wèn)題，仍需要解決其面臨的產(chǎn)業(yè)化問(wèn)題。本研究以商品化的魚(yú)鱗膠原肽為對(duì)象，研究其對(duì)冷凍面團(tuán)酵母存活率和冷凍面團(tuán)的品質(zhì)指標(biāo)的影響，為魚(yú)膠原肽在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為冷凍面團(tuán)工業(yè)生產(chǎn)化中抗凍劑的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)膠原肽(來(lái)自魚(yú)鱗，分子質(zhì)量500～3 000 Da)，海南華研膠原科技有限公司；高筋小麥粉(蛋白質(zhì)11.1 g/100g，脂肪1.5 g/100g，碳水化合物75.3 g/100g)，克明面業(yè)股份有限公司；高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；海藻糖(≥98%)，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PE9600 WT面包機(jī)，柏翠電器有限公司；UKOEO-F150醒發(fā)箱，珠海家寶德科技有限公司；YXD-Z204電熱烤箱，廣州三鼎金屬制品有限公司；UV 102PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌懸液的制備

稱(chēng)取干酵母1.0 g，分散于100 mL無(wú)菌水中，置于恒溫?fù)u床28 ℃、120 r/min活化30 min；量取9.0 mL，加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度(0、20、40、60、80 g/L)的魚(yú)膠原肽溶液和40 g/L海藻糖溶液(陽(yáng)性對(duì)照)作為抗凍劑，混合均勻即為酵母菌懸液。

1.3.2 酵母菌存活率的測(cè)定

將上述酵母菌懸液進(jìn)行0～6次凍融循環(huán)處理(-18 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h為1次凍融循環(huán))，參考熊思佳等[13]的方法，分別測(cè)定懸液經(jīng)0、2、4、6次凍融循環(huán)后的酵母菌存活率，根據(jù)存活率大小分析魚(yú)膠原肽對(duì)酵母菌的抗凍保護(hù)效果及其適合添加質(zhì)量濃度。

1.3.3 冷凍面團(tuán)的制備

空白組面團(tuán)配方：面粉200 g、去離子水100 g、白砂糖10 g、食鹽2 g、干酵母0.8 g；陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組面團(tuán)分別以同樣質(zhì)量的海藻糖溶液(40 g/L)和膠原肽溶液(60 g/L)替代去離子水。

按配方稱(chēng)取面粉、白砂糖、食鹽、干酵母，混合均勻置于面包機(jī)中，加入水或抗凍劑溶液，自動(dòng)和面15 min，面團(tuán)分成若干個(gè)30 g的小面團(tuán)，放入面包模具中壓實(shí)，分別進(jìn)行0～6次凍融循環(huán)(-18 ℃冷凍18 h，4 ℃解凍6 h)后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)相對(duì)發(fā)酵力的影響

參照GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》[14]，采用排水法測(cè)定30 g冷凍面團(tuán)發(fā)酵180 min產(chǎn)生的CO2，以CO2體積表示面團(tuán)中酵母菌的發(fā)酵力，其與相應(yīng)面團(tuán)0次凍融循環(huán)時(shí)發(fā)酵力的比值表示為相對(duì)發(fā)酵力。

1.3.5 魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)烘焙特性的影響

面團(tuán)凍融處理0～6次循環(huán)，置于醒發(fā)箱中醒發(fā)4 h，參照郭星辛等[15]的方法放入預(yù)熱的烤箱烘烤15 min，室溫冷卻30 min后測(cè)定面包比容和質(zhì)構(gòu)。其中，面包比容參照GB/T 20981—2007《面包》[16]采用排菜籽法測(cè)定；面包彈性采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定[15]。

1.3.6 冷凍面團(tuán)中濕面筋含量的測(cè)定

濕面筋含量參考GB/T 5506.1—2008《小麥和小麥粉 面筋含量》[17]采用手洗法測(cè)定。取30 g冷凍面團(tuán)于200 mL的去離子水中，先靜置20 min后用手揉搓面團(tuán)，期間不斷的更換去離子水直至洗滌面團(tuán)的水無(wú)淀粉檢出，排水后稱(chēng)重，得濕面筋質(zhì)量m，濕面筋含量按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.7 面筋中巰基含量的測(cè)定

將1.3.6中得到的濕面筋，置于-70 ℃預(yù)凍過(guò)夜，凍干后以粉碎機(jī)打碎，過(guò)120目篩。粉末參照WANG等[18]的方法分析其活性巰基含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)膠原肽對(duì)酵母菌抗凍保護(hù)作用

魚(yú)膠原肽對(duì)酵母菌懸液凍融過(guò)程中酵母菌存活率的影響如圖1所示?？梢?jiàn)，隨著凍融次數(shù)的增加，酵母菌存活率逐漸下降，6次凍融循環(huán)后，魚(yú)膠原肽組酵母菌存活率為39%，與陽(yáng)性對(duì)照海藻糖組(40%)相當(dāng)，顯著高于(P<0.05)空白組(9%)。郭星辛等[15]將魚(yú)膠原肽作為抗凍劑應(yīng)用于冷凍面團(tuán)中，發(fā)現(xiàn)6次凍融循環(huán)后面團(tuán)中酵母菌存活率為61%，與海藻糖組(61%)相當(dāng)。可見(jiàn)，上述結(jié)果表明魚(yú)膠原肽對(duì)懸液和面團(tuán)中的酵母菌細(xì)胞均具有較好的抗凍保護(hù)作用。大量研究已證實(shí)來(lái)自魚(yú)皮、魚(yú)鱗等的膠原肽能通過(guò)羥基及疏水相互作用與冰晶表面結(jié)合，減少冰晶的生長(zhǎng)，防止細(xì)胞膜蛋白變性，從而顯示出良好的微生物抗凍保護(hù)活性，而且其分子質(zhì)量主要分布在<3 000 Da 的范圍內(nèi)[19-21]，這與本研究的結(jié)果相符。

圖1 魚(yú)膠原肽對(duì)酵母菌凍融處理后存活率的影響Fig.1 Effect of fish collagen peptides on the survival rate of yeast with freeze-thaw treatment 注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 魚(yú)膠原肽質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌凍融存活率的影響

將不同質(zhì)量濃度的魚(yú)膠原肽加入酵母菌懸液中，凍融處理后酵母菌的存活率見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，酵母菌存活率均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但添加魚(yú)膠原肽能明顯提高懸液中酵母菌存活率，其中質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)酵母菌存活率最高(47%)，顯著高于空白(0 g/L)組(9%)。此外，魚(yú)膠原肽質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)酵母菌存活率反而較60 g/L時(shí)有所降低，可能是因?yàn)槠滟|(zhì)量濃度過(guò)大使酵母菌處于高滲透壓環(huán)境中，導(dǎo)致部分細(xì)胞失水過(guò)多死亡[22]。

圖2 魚(yú)膠原肽質(zhì)量濃度對(duì)酵母菌凍融處理后存活率的影響Fig.2 Effect of concentration of fish collagen peptides on the survival rate of yeast with freeze-thaw treatment

2.3 魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)相對(duì)發(fā)酵力的影響

將魚(yú)膠原肽作為抗凍劑加入冷凍面團(tuán)，分析其對(duì)面團(tuán)凍融循環(huán)處理后酵母菌發(fā)酵力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，面團(tuán)中酵母菌的相對(duì)發(fā)酵力呈下降趨勢(shì)；6次凍融循環(huán)后，魚(yú)膠原肽組相對(duì)發(fā)酵力為0.47，與海藻糖組(0.49)差異不大(P>0.05)；而空白組僅為0.27，顯著低于另外2組(P<0.05)。這與圖1中結(jié)果一致，表明添加膠原肽提高了冷凍面團(tuán)中酵母菌的存活率，從而較好地保留了其發(fā)酵力，這與GONG等[12]和郭星辛等[15]的結(jié)果一致。

圖3 魚(yú)膠原肽對(duì)面團(tuán)凍融處理后相對(duì)發(fā)酵力的影響Fig.3 Effect of fish collagen peptides on the relative fermentability of dough with freeze-thaw treatment

2.4 魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)烘焙特性的影響

魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)面包比容和彈性的影響如圖4所示，可見(jiàn)，隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加，面包比容和彈性逐漸下降。0次凍融循環(huán)時(shí)，魚(yú)膠原肽組面包的比容為3.3 mL/g，與海藻糖組(3.2 mL/g)相當(dāng)，高于空白組(2.8 mL/g)；6次凍融循環(huán)后，魚(yú)膠原肽組和海藻糖組面包的比容分別降低了16.1%、13.3%，降幅明顯低于空白組(18.4%)。面包彈性與比容的變化趨勢(shì)基本一致，空白組彈性下降最快，6次凍融循環(huán)后下降了38.5%，顯著高于(P<0.05)魚(yú)膠原肽組(13.8%)和海藻糖組(9.2%)，這與李靈等[23]的研究結(jié)果一致。因此，添加魚(yú)膠原肽有利于維持冷凍面團(tuán)的焙烤特性，這可能是因?yàn)轸~(yú)膠原肽具有修飾冰晶及抑制重結(jié)晶的作用，使面團(tuán)冷凍過(guò)程中生成的冰晶體積小且比較均勻[24]，減緩了凍融循環(huán)對(duì)面筋結(jié)構(gòu)的破壞。

2.5 魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)面筋含量的影響

凍融循環(huán)次數(shù)處理對(duì)冷凍面團(tuán)中濕面筋含量的影響如圖5所示?？梢?jiàn)，隨著凍融次數(shù)的增加，面團(tuán)濕面筋的含量逐漸下降，可能是因?yàn)楸纬珊椭亟Y(jié)晶導(dǎo)致了面筋蛋白分子質(zhì)量下降、面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)機(jī)械損傷[25]，從而導(dǎo)致了面筋蛋白分子溶解性的變化。凍融過(guò)程中，空白組的濕面筋含量下降幅度最大，6次凍融后，每100 g面團(tuán)中濕面筋降低了17%，顯著高于(P<0.05)膠原肽組(12%)和海藻糖組(13%)，說(shuō)明魚(yú)膠原肽能防止面團(tuán)凍融過(guò)程中面筋蛋白變化，減緩面筋含量下降。孫麗潔等[21]發(fā)現(xiàn)魚(yú)膠原肽具有較強(qiáng)的親水性，能降低冷凍面團(tuán)中可凍結(jié)水含量，減少冰晶的形成；而且，還能通過(guò)形成氫鍵使面團(tuán)形成更致密的面筋網(wǎng)絡(luò)，從而限制水分流失，保護(hù)面筋結(jié)構(gòu)[12,23]。

圖5 魚(yú)膠原肽對(duì)面團(tuán)凍融處理后面筋含量的影響Fig.5 Effect of fish collagen peptides on the gluten content in frozen dough with freeze-thaw treatment

2.6 魚(yú)膠原肽對(duì)冷凍面團(tuán)游離巰基含量的影響

巰基通常以二硫鍵的形式參與到面筋蛋白聚集行為中，維持面筋蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[26]。由圖6可知，隨著凍融次數(shù)的增加，面筋蛋白的游離巰基含量逐漸上升。這可能是由于凍融過(guò)程中的水分遷移和冰晶重結(jié)晶加速了面筋蛋白擠壓和分子間相互作用，導(dǎo)致其二硫鍵發(fā)生弱化和斷裂[27]；此外，酵母菌細(xì)胞在凍融過(guò)程中的機(jī)械損傷會(huì)釋放出還原性物質(zhì)，也會(huì)破壞面筋結(jié)構(gòu)中的二硫鍵[28]。6次凍融循環(huán)后，空白組面筋蛋白的游離巰基含量由5.25 μmol/g升至6.58 μmol/g，增加了25%；而魚(yú)膠原肽組和海藻糖組僅增加了8%和9%，顯著低于空白組(P<0.05)。這表明在凍融過(guò)程中魚(yú)膠原肽和海藻糖均對(duì)冷凍面團(tuán)具有抗凍保護(hù)作用，可能其通過(guò)抑制冰晶形成和重結(jié)晶減弱了凍融過(guò)程中面筋和酵母菌細(xì)胞的損傷，從而抑制面筋蛋白的解聚和面筋蛋白中二硫鍵的斷裂[5]。

圖6 魚(yú)膠原肽對(duì)面團(tuán)凍融處理后游離巰基含量的影響Fig.6 Effect of fish collagen peptides on the free sulfhydryl content in dough with freeze-thaw treatment

3 結(jié)論

魚(yú)膠原肽是一種潛在的冷凍面團(tuán)抗凍劑，在凍融循環(huán)處理過(guò)程中對(duì)酵母菌細(xì)胞和冷凍面團(tuán)面筋結(jié)構(gòu)均具有良好的抗凍保護(hù)效果。結(jié)果表明，添加魚(yú)膠原肽能顯著提高酵母菌在凍融過(guò)程中的存活率，添加魚(yú)膠原肽冷凍面團(tuán)的相對(duì)發(fā)酵力、面包比容和彈性均高于空白組。此外，添加魚(yú)膠原肽還可以抑制大分子蛋白的解聚和面筋蛋白中二硫鍵的斷裂。本研究采用的魚(yú)膠原肽是以魚(yú)鱗為原料經(jīng)蛋白酶解技術(shù)獲得小分子肽類(lèi)產(chǎn)品(分子質(zhì)量范圍500～3 000 Da)，能提高冷凍酵母菌的存活率和發(fā)酵活力，減緩冷凍面團(tuán)中面筋結(jié)構(gòu)的破壞，在改良冷凍面團(tuán)品質(zhì)方面顯示出很好的應(yīng)用前景，研究結(jié)果為促進(jìn)國(guó)內(nèi)冷凍面團(tuán)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化和品質(zhì)提升提供了有價(jià)值的參考。