劉 磊

(大連市第三人民醫(yī)院藥劑部，大連 116033)

雙嘧達(dá)莫(DPM)為磷酸二酯酶可逆性抑制劑，具有擴(kuò)張冠脈及抗血栓形成作用，臨床主治中風(fēng)術(shù)后并發(fā)癥以及心臟手術(shù)或瓣膜置換術(shù)等[1-2]。DPM為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(BCS)Ⅱ類藥物，解離常數(shù)pKa為6.4，屬于弱堿性藥物[3]，藥物溶解性具有pH依賴性，在酸性(pH值1～4)環(huán)境中藥物溶解度較高，在pH 7.0介質(zhì)中溶解度僅為5 μg·mL-1[4]，這會導(dǎo)致已經(jīng)溶解在胃液中的DPM隨著胃排空進(jìn)入小腸時會析出沉淀[5]，個體間生物利用度差異性較大(18%～43%)[6]，臨床療效不確切。納米混懸劑(NPs)以少量高分子聚合物和/或表面活性劑作為穩(wěn)定劑，通過機(jī)械性超微粉碎技術(shù)或控制結(jié)晶析出條件將藥物制備成粒徑小于1 000 nm且具有良好物理穩(wěn)定性的膠體分散體[7-9]，NPs粒徑較小，將藥物制備成NPs后能顯著增加藥物的溶解度和生物利用度[10-11]。本研究將DPM制備成DPM-NPs，并通過模擬體內(nèi)藥物溶出實(shí)驗(yàn)，為DPM的體內(nèi)藥動學(xué)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器 FA25型高剪切分散乳化機(jī)(上海右一儀器有限公司)；PSI-20型高壓微射流均質(zhì)機(jī)(上海奧法美嘉生物科技有限公司)；Zetasizer Nano ZSP型動態(tài)光散射粒度分析儀(英國馬爾文公司)；RC-8DA型藥物溶出試驗(yàn)儀(天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造股份有限公司)；KYKY-EM8000型掃描電子顯微鏡(北京中科科儀股份有限公司)。

1.2試藥 雙嘧達(dá)莫原料藥(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號S190817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%)；羥丙甲纖維素E5(HPMC E5，陶氏化學(xué)中國有限公司)；羥丙基纖維素EXF(HPC EXF)和聚維酮K30(PVP K30)，均購自亞什蘭中國投資公司；吐溫-80(P80，南京威爾藥業(yè)股份有限公司)；泊洛沙姆188(F68，巴斯夫中國有限公司)；甘露醇(羅蓋特連云港有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1DPM-NPs的制備 采用高壓均質(zhì)法制備DPM-NPs。制備工藝：稱取經(jīng)氣流粉碎機(jī)處理過的DPM原料藥[顆粒累積分布為90%的粒徑(D90)為10.2 μm，顆粒累積分布為50%的粒徑(D50)為4.1 μm，顆粒累積分布為10%的粒徑(D10)為1.6 μm]1.0 g加入到含有穩(wěn)定劑的純化水中，介質(zhì)體積為100 mL，攪拌分散均勻；通過高剪切分散乳化機(jī)高速剪切10 min，轉(zhuǎn)速為20 000 r·min-1，初步減小DPM粒徑，再將DPM分散液通過高壓微射流均質(zhì)機(jī)高壓均質(zhì)處理，在一定的均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)下均質(zhì)，即得DPM-NPs。取DPM-NPs 2.5 mL，置于10 mL西林瓶中，加入甘露醇溶解，使甘露醇質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1，將樣品置于冷凍干燥機(jī)中凍干處理，干燥結(jié)束后加塞密封保存，備用。

2.2DPM-NPs處方考察

2.2.1穩(wěn)定劑種類考察 研究表明[12]，NPs處方中通常單獨(dú)加入HPC EXF、HPMC E5和PVP K30等高分子材料，或與表面活性劑F68、P80聯(lián)合使用作為穩(wěn)定劑，以增加納米混懸劑的穩(wěn)定性。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選方法，以制備的DPM-NPs粒徑大小、多聚分散系數(shù)(PDI)以及Zeta電位和穩(wěn)定性(通過肉眼觀察)作為評價指標(biāo)，在相同的制備工藝條件下考察了不同種類穩(wěn)定劑對DPM-NPs性質(zhì)的影響，結(jié)果見表1。

表1 穩(wěn)定劑的篩選結(jié)果

NPs為熱動力學(xué)不穩(wěn)定體系，穩(wěn)定劑的加入一方面可以降低界面張力，使顆粒表面充分潤濕，另一方面穩(wěn)定劑通過空間位阻或靜電斥力作用抑制顆粒聚集[13]。由表1可知，以PVP K30與F68組合使用制備的DPM-NPs粒徑最小，PDI及Zeta電位值相對較低，放置24 h未出現(xiàn)絮狀沉淀。因此選擇PVP K30和F68作為DPM-NPs的穩(wěn)定劑作進(jìn)一步研究。

2.2.2穩(wěn)定劑質(zhì)量濃度篩選 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇PVP K30質(zhì)量濃度為5、10 mg·mL-1，F(xiàn)68質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg·mL-1，采用交叉實(shí)驗(yàn)方法，在相同的制備工藝條件下考察穩(wěn)定劑質(zhì)量濃度對DPM-NPs性質(zhì)的影響，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定劑質(zhì)量濃度的篩選結(jié)果

由表2可知，PVP K30質(zhì)量濃度對DPM-NPs粒徑分布的影響較顯著，當(dāng)PVP K30質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1時，制備的DPM-NPs粒徑較大，當(dāng)PVP K30質(zhì)量濃度增加到10 mg·mL-1時，制備的DPM-NPs粒徑較小，因此確定DPM-NPs處方中穩(wěn)定劑PVP K30的質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1，F(xiàn)68的質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1。

2.3制備工藝優(yōu)化

2.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究表明，高壓均質(zhì)法工藝參數(shù)對DPM-NPs的粒徑有較大影響，因此本研究通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化高壓均質(zhì)工藝參數(shù)。以均質(zhì)壓力(X1)和均質(zhì)次數(shù)(X2)作為變量因素，以制備的DPM-NPs粒徑分布(Y)作為評價指標(biāo)，采用“中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”優(yōu)化得到制備DPM-NPs的最佳工藝參數(shù)。因素與水平見表3，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表3 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.3.2模型建立與統(tǒng)計(jì)分析 采用“中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”實(shí)驗(yàn)軟件對表4中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評估均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對DPM-NPs粒徑分布的影響程度，結(jié)果見表5。由表5可知，模型P值為0.000 6，小于0.05，說明模型顯著，可用該模型進(jìn)行分析和預(yù)測；失擬項(xiàng)P值為0.250 2，大于0.05，說明實(shí)測值和預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型預(yù)測準(zhǔn)確度較高。建立的二元多次擬合方程模型為：Y=510.57-149.13X1-78.58X2+47.78X1X2+120.38X12+8.63X22(R2=0.973 4)，其中X1、X2、X1X2和X12的P值均小于0.05，對粒徑具有顯著影響。通過繪制效應(yīng)面圖可直觀分析均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)及其相互作用對DPM-NPs粒徑分布的影響，見圖1。

表4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

圖1 均質(zhì)壓力(X1)和均質(zhì)次數(shù)(X2)對DPM-NPs粒徑分布(Y)的效應(yīng)面圖

由圖1可知，當(dāng)均質(zhì)壓力恒定時，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，DPM-NPs的粒徑呈減小趨勢；當(dāng)均質(zhì)次數(shù)恒定時，隨著均質(zhì)壓力的增加，DPM-NPs的粒徑呈減小趨勢。

本研究要求制備的DPM-NPs粒徑分布趨于最小化，經(jīng)軟件優(yōu)化得到的最佳制備工藝參數(shù)為：均質(zhì)壓力為18 000 psi，均質(zhì)8次，預(yù)測得到DPM-NPs的粒徑大小為449.5 nm。根據(jù)最佳均質(zhì)工藝參數(shù)制備DPM-NPs，測得粒徑分布為(438.6±24.7)nm，誤差均在5%以內(nèi)，實(shí)驗(yàn)測定值與預(yù)測值接近，說明使用“中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”優(yōu)化DPM-NPs制備工藝準(zhǔn)確度較高。

2.4DPM-NPs凍干前后表征

2.4.1粒徑分布及Zeta電位測定 采用Zetasizer Nano ZSP動態(tài)光散射粒度分析儀測定凍干前DPM-NPs溶液以及該批樣品凍干復(fù)溶后的粒徑分布、PDI及Zeta電位，比較凍干前后DPM-NPs的粒徑分布、PDI及Zeta電位是否發(fā)生變化，結(jié)果見表6。

表6 DPM-NPs凍干前后的理化性質(zhì)

由表6可知，DPM-NPs在凍干前后的粒徑分布、PDI及Zeta電位均未發(fā)生顯著變化，說明冷凍干燥能夠保持DPM-NPs原有的理化性質(zhì)，有效避免其聚集，穩(wěn)定性良好。

2.4.2微觀形貌 取凍干前及復(fù)溶后的DPM-NPs溶液適量，滴加到錫箔紙上，揮干水分，黏附到雙面帶有碳膠帶的電膠布上，噴金，在掃描電鏡下觀察其微觀形貌，見圖2。由圖2可知，凍干前后DPM-NPs均呈不規(guī)則狀態(tài)分布，冷凍干燥未改變DPM-NPs的微觀結(jié)構(gòu)。

圖2 DPM-NPs凍干前(A)及復(fù)溶后(B)的掃描電鏡圖

2.5模擬體內(nèi)藥物溶出研究 已有研究表明，采用胃腸道特定部位的模擬液進(jìn)行生物相關(guān)的溶出度實(shí)驗(yàn)是預(yù)測難溶藥物吸收的一種有效方法[14-15]，因此本研究比較DPM-NPs和DPM片在模擬人工胃液(SGF)和模擬人工腸液(SIF)中的藥物溶出度情況。介質(zhì)溶液體積為500 mL，攪拌槳轉(zhuǎn)速為50 r·min-1，分別取DPM-NPs和DPM片加入到溶出杯中，分別在5、10、20、30、45、60 min取樣5 mL(同時補(bǔ)加等溫釋放介質(zhì)5 mL)，離心10 min，取上清液，經(jīng)HPLC法[16]測定DPM的含量，并計(jì)算溶出度，繪制DPM-NPs與DPM片在SGF和SIF中的溶出曲線。見圖3。

圖3 DPM-NPs和DPM片在SGF和SIF中的溶出曲線

由圖3可知，DPM-NPs和DPM片在SGF中60 min內(nèi)溶出度均達(dá)到了90%以上，這是由于DPM在SGF(pH值為1.5)介質(zhì)中具有較高的溶解性，而在SIF(pH值為6.8)介質(zhì)中，DPM-NPs和DPM片的溶出度呈降低趨勢，這是由于DPM在中性環(huán)境中溶解性較差，不利于藥物溶解[17]；同時也觀察到DPM-NPs在SGF和SIF介質(zhì)中的藥物溶出速度均明顯高于DPM片，這是由于DPM-NPs粒徑較小，比表面積較大，加快了藥物溶出。通過模擬體內(nèi)藥物溶出實(shí)驗(yàn)可初步判斷DPM-NPs能夠提高藥物在胃腸道溶液中的溶出速度，有望減小藥物口服吸收變異性，提高生物利用度。

3 討論

高壓均質(zhì)技術(shù)是在高壓作用下將原料藥以極大的速度流經(jīng)微管通道，并進(jìn)入微米級固定均質(zhì)腔，在此過程中大粒徑的原料藥受到高剪切力、高碰撞力和空穴效應(yīng)等綜合作用使其粒徑減小，可以通過精確調(diào)節(jié)均質(zhì)壓力以獲得穩(wěn)定的剪切力[18]，確保制備的NPs粒徑大小分布均勻，因此本研究采用高壓均質(zhì)技術(shù)制備DPM-NPs。

NPs的處方中需要加入穩(wěn)定劑來降低固-液界面表面張力，避免聚集、團(tuán)聚和沉降等現(xiàn)象[19]，常用的穩(wěn)定劑包括高分子化合物和表面活性劑，表面活性劑通過降低藥物與介質(zhì)之間的表面張力，在原料藥粒徑減小時介質(zhì)能夠充分潤濕其表面，極大降低了微粒之間的吸附性，而高分子化合物很快分散并吸附在藥物微粒表面，形成一層類似于膜的結(jié)構(gòu)，可以提供空間位阻作用，兩者共同作用可有效避免粒子間的相互聚集作用。本研究通過對DPM-NPs穩(wěn)定劑種類的篩選，最終確定PVP K30和F68作為穩(wěn)定劑能夠有效防止NPs聚集沉淀，能使其長時間保存。