李琪雁，馬麗雅，張?jiān)气P，王軼英

(1.河南大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450003;2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450003)

宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性健康。據(jù)全球最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在女性癌癥中居第四位，而在經(jīng)濟(jì)水平較低的國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率僅次于乳腺癌，且近年來呈年輕化趨勢(shì)[1]。目前高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)持續(xù)感染-宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)-宮頸癌的演變模型已基本成共識(shí)。根據(jù)宮頸病變的嚴(yán)重程度，CIN患者的病理診斷分為低級(jí)別上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)和高級(jí)別上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。臨床上部分CIN患者可發(fā)生自然轉(zhuǎn)歸，而部分則進(jìn)展為癌，一些癌患者短期即發(fā)生轉(zhuǎn)移。相同病理診斷的宮頸病變存在不同的轉(zhuǎn)歸，因此單純通過病理診斷并不足以評(píng)估宮頸疾病的嚴(yán)重程度及預(yù)后，探尋更為客觀的分子標(biāo)記物在宮頸癌的防治中具有重大意義。p16、Ki67是評(píng)估宮頸病變嚴(yán)重程度的2個(gè)經(jīng)典分子標(biāo)記物，被廣泛應(yīng)用于臨床。胰島素樣生長(zhǎng)因子II mRNA結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor Ⅱ mRNA binding protein 3,IMP3)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，在多種腫瘤包括宮頸癌中發(fā)現(xiàn)存在異常表達(dá)。高遷移率蛋白A2(High Mobility Group AT-Hook 2,HMGA2)是一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道，IMP3與HMGA2在人類腫瘤中存在共表達(dá)現(xiàn)象，且HMGA2在胚胎發(fā)生及致癌過程中受IMP3調(diào)節(jié)[2]。本研究通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)HMGA2、IMP3、p16、Ki67在不同級(jí)別CIN和宮頸癌中的表達(dá)情況，并將HMGA2、IMP與兩個(gè)經(jīng)典分子標(biāo)記物p16、Ki67比較，探討4種分子標(biāo)記物之間以及其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年1月河南省人民醫(yī)院病理科存檔的146例宮頸組織蠟塊，其中包括30例正常宮頸組織(normal cervical epithelium,NCE)，36例LSIL，38例HSIL和42例宮頸癌(cervical cancer,CC)。所有標(biāo)本均經(jīng)本院病理科醫(yī)師再次核對(duì)。正常宮頸組織標(biāo)本來自在本院行宮頸錐切術(shù)或因婦科良性腫瘤(子宮肌瘤、子宮腺肌癥等)行全子宮切除術(shù)后病理證實(shí)為正常宮頸者。42例宮頸癌患者均在本院接受根治性子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)±腹主動(dòng)脈淋巴結(jié)清掃術(shù)治療，患者資料完整，平均年齡(47.17±11.39)歲；FIGO分期：I期20例(47.62%)、II期12例(28.57%)、III期10例(23.81%)；分化程度：高分化10例(23.81%)、中分化19例(45.24%)、低分化13例(30.95%)；病理類型：鱗癌31例(73.81%)、腺癌11例(26.19%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移者15例(35.71%)，無轉(zhuǎn)移者27例(64.29%)；浸潤(rùn)深度≤1/2者15例(35.71%)，>1/2者27例(64.29%)；脈管浸潤(rùn)：有浸潤(rùn)者26例(61.90%)，無浸潤(rùn)者16例(38.10%)；神經(jīng)浸潤(rùn)：有浸潤(rùn)者8例(19.05%)，無浸潤(rùn)者34例(80.95%)。

1.2 主要試劑 鼠抗人p16單克隆抗體、兔抗人IMP3單克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司，兔抗人HMGA2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，鼠抗人Ki67單克隆抗體(MIB-1)購(gòu)自DAKO公司。

1.3 方法 選取的宮頸組織蠟塊切片4μm，置于60℃烤箱中烤片1h，免疫組化染色在羅氏Bench Mark XT全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)上進(jìn)行。操作步驟嚴(yán)格按診斷優(yōu)化程序執(zhí)行，程序結(jié)束后常規(guī)進(jìn)行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，使用磷酸鹽平衡生理鹽水(PBS)代替一抗作空白對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 HMGA2主要表達(dá)于細(xì)胞核，IMP3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色陽(yáng)性以出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為準(zhǔn)。免疫組化評(píng)分按半定量積分法判定：(1)染色強(qiáng)度:無著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;(2)陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0%～5%為0分，6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,75%～100%為4分。免疫組化評(píng)分為染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比乘積：0分為陰性(-),1～4分為弱陽(yáng)性(+),5～8分為中陽(yáng)性(++),9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。p16定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿內(nèi)，Ki67定位于細(xì)胞核，以染色出現(xiàn)棕黃色或棕褐顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率:0%～30%為陰性(-)，31%～50%為弱陽(yáng)性(+)，51%～75%為中陽(yáng)性(++)，≥76%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

2 結(jié) 果

2.1 各分子標(biāo)記物在不同級(jí)別宮頸病變中的表達(dá) HMGA2在NCE、LSIL、HSIL、CC中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為30.00%(9/30)、41.67%(15/36)、63.16%(24/38)、80.95%(34/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=29.948，P=0.000)。IMP3在NCE、LSIL、HSIL、CC中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.00%(0/30)、2.86%(1/35)、5.56%(2/36)、78.57%(33/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=92.147，P=0.000)。p16在NCE、LSIL、HSIL、CC中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.00%(3/30)、63.89%(23/36)、86.84%(33/38)、97.62%(41/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=91.421，P=0.000)。Ki67在NCE、LSIL、HSIL、CC中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為20.00%(6/30)、55.56%(20/36)、94.74%(36/38)、100.00%(42/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=88.626，P=0.000)。見表1、圖1。

圖1 免疫組化法檢測(cè)HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宮頸病變中的表達(dá)(×200)

表1 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在不同級(jí)別宮頸病變中的表達(dá)

2.2 不同級(jí)別宮頸病變中各分子標(biāo)記物表達(dá)的兩兩比較 HMGA2、IMP3在NCE、LSIL、HSIL組中的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著低于CC組(Z=4.876、3.860、2.426,6.205、6.499、6.375，P=0.000、0.000、0.015,0.000、0.000、0.000)，HMGA2在NCE組中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于HSIL組(Z=3.031，P=0.002)。p16、Ki67陽(yáng)性表達(dá)率在不同級(jí)別宮頸病變中兩兩比較的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在不同宮頸病變中表達(dá)的兩兩比較(Z/P)

2.3 HMGA2、IMP3、p16、Ki67表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 HMGA2表達(dá)與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)(均P<0.05)；IMP3表達(dá)與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度、病理類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)相關(guān)(均P<0.05)；p16與宮頸癌患者年齡、FIGO分期、分化程度、病理類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)、宮旁浸潤(rùn)、侵及頸體交界均無相關(guān)性(均P>0.05)；Ki67與宮旁浸潤(rùn)有關(guān)(P=0.029)。見表3。

表3 HMGA2、IMP3、p16、Ki67表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中，HMGA2和IMP3陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.589,P<0.001)，p16和Ki67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.599,P<0.001)。見表4。

表4 HMGA2、IMP3、p16、Ki67在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果，涉及多種基因蛋白水平的變化。臨床上大部分CIN可發(fā)生自然轉(zhuǎn)歸，只有小部分CIN進(jìn)展為宮頸癌，另有一些宮頸癌患者短期內(nèi)即發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差。一方面,宮頸癌篩查和病理診斷都不能對(duì)宮頸病變未來演變做出預(yù)測(cè)；另一方面,分子標(biāo)記物有助于可疑病例的協(xié)診以及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)[3]。對(duì)宮頸病變嚴(yán)重程度以及預(yù)后做到準(zhǔn)確評(píng)估，可避免過度治療，減輕患者心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探究更為客觀的分子標(biāo)記物在宮頸病變中的表達(dá)情況，從而進(jìn)一步研究宮頸癌潛在的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)提高宮頸癌的診療具有重大意義。

HMGA2是一種非組蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，其自身沒有轉(zhuǎn)錄活性，但是其可與DNA序列中富含AT的小溝特異性結(jié)合改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、衰老、凋亡、DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過程[4]。HMGA2主要在胚胎發(fā)生過程中表達(dá)，而在高分化或成熟組織中基本檢測(cè)不到。多項(xiàng)研究表明，HMGA2在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌和甲狀腺癌等惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，其過表達(dá)與高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后有關(guān)[5]。本研究結(jié)果表明，隨著宮頸病變嚴(yán)重程度逐漸加重，HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率逐漸上升。這與Wang等[6]報(bào)道相似。本研究中HMGA2表達(dá)與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)，提示HMGA2在一定程度上促進(jìn)宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，對(duì)宮頸癌患者的預(yù)后和生存評(píng)估具有重大意義。關(guān)于HMGA2促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制仍未完全確立。Wang等[7]通過動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證明，HMGA2通過激活A(yù)TR/Chk1信號(hào)通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。HPV整合是宮頸癌發(fā)生過程中的關(guān)鍵遺傳事件，Hu等[8]通過對(duì)26例CIN、104例宮頸癌以及5個(gè)宮頸癌細(xì)胞系行全基因組測(cè)序和高通量病毒整合檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HMGA2以7.8%的積分頻率成為新的HPV整合熱點(diǎn)，HMGA2蛋白表達(dá)升高與其側(cè)翼區(qū)域的HPV整合有關(guān)，為HMGA2促進(jìn)宮頸癌提供新的見解。

IMP3是mRNA結(jié)合蛋白家族成員之一，在神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞遷移、代謝和癌細(xì)胞存活中起著重要作用[9]。和HMGA2相似，IMP3在胚胎組織及多種腫瘤組織中高表達(dá)，而在成人分化成熟組織中鮮有表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、不良預(yù)后密切相關(guān)。Lu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與CIN或無異常增生的宮頸組織相比，IMP3不僅在侵襲性鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)顯著增加，而且在并發(fā)侵襲性鱗狀細(xì)胞癌的CIN3病例中的一個(gè)亞組中表達(dá)顯著增加，認(rèn)為IMP3可作為CIN進(jìn)展為宮頸癌的一個(gè)預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物。Wei等[11]研究證明，IMP3表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的生存不良有關(guān)。本研究結(jié)果表明，IMP3在正常宮頸組織、CIN組織中表達(dá)極少，而在宮頸癌中的表達(dá)明顯升高[78.57%(33/42)]，且IMP3表達(dá)與宮頸癌患者FIGO分期、分化程度、病理類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)、神經(jīng)浸潤(rùn)有關(guān)，提示IMP3促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，可作為不良預(yù)后和生存評(píng)估的分子標(biāo)記物。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA circCDKN2B-AS1通過與IMP3蛋白相互作用來穩(wěn)定有氧糖酵解，以穩(wěn)定HK2 mRNA，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性表型。

p16是一種細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子，Ki67是一種核增殖標(biāo)志基因。正常生理?xiàng)l件下，兩個(gè)分子不會(huì)共表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)共表達(dá)時(shí)提示由HR-HPV感染介導(dǎo)的細(xì)胞周期失調(diào)，并預(yù)測(cè)高級(jí)別宮頸上皮病變的存在[13]。在一項(xiàng)包括40509例研究對(duì)象的橫斷面研究中，p16/Ki67顯示出很好的分流潛能及對(duì)CIN2患者HPV清除的預(yù)測(cè)能力[14]。本研究結(jié)果表明，p16和Ki67陽(yáng)性表達(dá)率均隨宮頸病變加重逐漸升高(均P<0.05)，而在LSIL與HSIL兩組比較中，p16和Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示p16和Ki67可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，并且在LSIL與HSIL的鑒別診斷上具有一定的應(yīng)用價(jià)值，與研究報(bào)道相符[15]。本研究中Ki67與宮旁浸潤(rùn)具有相關(guān)性，p16與各項(xiàng)宮頸癌臨床病理特征均無顯著相關(guān)。推測(cè)這可能是因?yàn)閜16和Ki67在宮頸癌的輔助診斷中具有較高的敏感性而特異性較差。因此p16和Ki67不太適用于臨床上宮頸癌患者的預(yù)后評(píng)估，但本結(jié)果還需要大樣本臨床數(shù)據(jù)支持。

本研究結(jié)果顯示,宮頸癌中HMGA2和IMP3表達(dá)呈正相關(guān)。這與Jonson等[2]研究相符，該研究還指出，IMP3通過抵抗Ago2/let-7與HMGA2 mRNA之間的交點(diǎn)來保護(hù)和上調(diào)HMGA2。Sheen等[16]研究證實(shí)，IMP3可結(jié)合并增強(qiáng)高遷移率族HMGA2 mRNA的穩(wěn)定性。本研究中p16和Ki67表達(dá)呈正相關(guān)，提示p16和Ki67在促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展方面具有協(xié)同作用，但是兩者是否具有潛在的相互作用調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HMGA2、IMP3、p16、Ki67陽(yáng)性表達(dá)率均隨著宮頸病變嚴(yán)重程度逐漸升高，提示這四種分子標(biāo)記物可能在宮頸癌的發(fā)生中起重要作用。HMGA2和IMP3可能參與促進(jìn)宮頸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，對(duì)宮頸癌患者的不良預(yù)后評(píng)估具有重要作用,兩者之間可能存在某種調(diào)節(jié)機(jī)制，可作為宮頸癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。p16和Ki67對(duì)臨床上LSIL與HSIL的鑒別診斷具有重要意義。