馮程程,張雯,蔡子哲,李穎,汪勇,張寧*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系,廣東 廣州,510632) 2(暨南大學(xué)-薩斯喀徹溫大學(xué)“油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實驗室,廣東 廣州,510632) 3(宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院,江西 宜春,336000)

植物雌激素是從植物中發(fā)現(xiàn)或源自植物前體的多酚類物質(zhì),結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素類似,具有雌激素和抗雌激素功能[1]。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同,主要分為異黃酮類、香豆雌酚類、木酚素類、二苯乙烯類、鞣花丹寧類[2]。其中木酚素是一類由兩分子苯丙素衍生物(C6-C3)聚合而成的化合物[3],按其來源可分為植物木酚素和哺乳動物木酚素。植物中含量最多的植物木酚素是開環(huán)異落葉松樹脂酚(secoisolariciresinol,SECO)及其前體開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside,SDG)、羅漢松脂酚(matairesinol,MAT)。另外,松脂酚(pinoresinol,PIN)、皮樹脂醇(medioresinol,MED)、丁香脂素(syringaresinol,SYR)、異落葉松脂素(isolariciresinol,ISOLAR)、羥基羅漢松脂酚(hydroxymatairesinol,HYMAT)、落葉松樹脂醇(lariciresinol,LARI)、牛蒡子苷(arctiin,ART)、牛蒡苷元(arctigenin,ARG)、脫水開環(huán)異落葉松脂酚(anhydrosecoisolariciresinol,AHS)、芝麻素酚(sesaminol,SES)及前體芝麻素酚三糖苷(sesaminol triglucoside,STG)也是在植物中發(fā)現(xiàn)的木酚素[1]。植物木酚素因具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒甚至殺蟲的特性,可以保護(hù)植物免受病原體和害蟲侵害,如MAT及其相關(guān)代謝物可抑制云杉真菌生長[4]。哺乳動物木酚素也叫腸道木酚素,由植物木酚素經(jīng)過腸道微生物的作用形成,主要是腸二醇(enterodiol,END)和腸內(nèi)酯(enterolactone,ENL),存在于血清、血漿、尿液和糞便中。

木酚素因在預(yù)防結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和更年期綜合癥[1]等疾病中發(fā)揮作用,近年來越來越受到關(guān)注,然而植物木酚素由于其生物利用度低而具有有限的生物學(xué)特性[5-6],必須將其轉(zhuǎn)化為腸道木酚素才能在人體內(nèi)發(fā)揮最大有益作用。盡管已經(jīng)有了化學(xué)合成END的方法[7],但因其使用的化學(xué)試劑價格昂貴、步驟復(fù)雜且對環(huán)境有污染,實際生產(chǎn)中越來越傾向于生物轉(zhuǎn)化法,生物轉(zhuǎn)化法具有操作簡單、對設(shè)備要求低、反應(yīng)快速等優(yōu)點,具有重要的應(yīng)用前景以及巨大的經(jīng)濟(jì)價值和現(xiàn)實意義。因此,本文將主要綜述木酚素的結(jié)構(gòu)、種類和分布、木酚素腸道微生物代謝機(jī)制,以及體外木酚素微生物和酶法轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展。

1 木酚素生理功能

END和ENL與雌二醇化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,進(jìn)入機(jī)體后與雌激素競爭性結(jié)合雌激素受體,產(chǎn)生一系列生理活性[8]。體內(nèi)外試驗表明,腸道木酚素是哺乳動物芳香酶抑制劑,它通過與競爭底物雌烯二酮的結(jié)合、抑制雄性激素的合成、與性甾結(jié)合蛋白競爭性結(jié)合、促進(jìn)性激素結(jié)合蛋白的合成、抑制二氫睪酮與促進(jìn)性激素結(jié)合蛋白的結(jié)合及抑制人組織中5α-還原酶和17β-羥基類固醇脫氫酶的活性,進(jìn)而降低血漿中雌二醇和睪丸激素的水平達(dá)到防治性激素依賴性疾病的目的?，F(xiàn)有研究表明,腸道木酚素還具有內(nèi)源性洋地黃樣及降低冠心病發(fā)作的生理活性[9]。除此之外,腸道木酚素能影響結(jié)腸、前列腺和乳腺的體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖,在體外比木酚素前體具有更強(qiáng)的抗氧化性能[10]。

2 木酚素分布

木酚素主要存在于植物中,在根、莖、葉、種子及果實中都能發(fā)現(xiàn),軟木樹的結(jié)中存在大量的木酚素,主要是以HYMAT的形式[3]存在,如挪威云杉結(jié)中含有高達(dá)20%的木酚素(干重),其中HYMAT為主要成分。亞麻籽是最廣泛的植物木酚素來源,含量約300 mg/100 g鮮重,以SECO的糖苷形式SDG為主[11](表1)。谷物類如黑麥、小麥、蕎麥和燕麥含有中等到高等含量的木酚素,全麥亞麻籽面包和雜糧面包中含量也較高,羽衣甘藍(lán)、卷心菜、蘆筍、花椰菜、大蒜、杏、柚子和棗等蔬菜水果都含有適量的木酚素,紅茶、綠茶、咖啡、啤酒等常見飲料中也有少量木酚素[12-16]。

表1 植物性食品中植物木酚素的含量 單位：μg/100 g(濕重)

3 木酚素代謝

SETCHELL等[17]用人糞便菌培養(yǎng)亞麻籽可產(chǎn)生END和ENL,但是無菌糞便培養(yǎng)不能產(chǎn)生,且抗生素處理降低了結(jié)腸中END和ENL的產(chǎn)生,表明腸道微生物群負(fù)責(zé)將植物木酚素轉(zhuǎn)化為腸道木酚素,主要部位是盲腸和結(jié)腸。腸道菌群主要包括擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形桿菌門,有超過1 000種不同的細(xì)菌種類,腸道菌群扮演著基因編碼酶的儲存庫的角色,這些酶可用于不同的代謝活動,而這是宿主本身所不具備的[2]。植物雌激素的潛在健康益生功能和生物活性很大程度上依賴于腸道微生物群,通過研究人體腸道菌群的代謝活動,可以更好地了解人類腸道菌群代謝木酚素的機(jī)制。

表2整理了能使植物木酚素轉(zhuǎn)化為腸道木酚素及其前體的各種特定腸道細(xì)菌。因為亞麻籽是木酚素最豐富的來源,大多數(shù)實驗都是使用亞麻籽為底物,亞麻籽中主要含有SECO,一般以其糖苷形式SDG存在。SDG的生物轉(zhuǎn)化通過腸道菌群中占優(yōu)勢、亞優(yōu)勢組之間復(fù)雜的相互作用進(jìn)行,一般要經(jīng)過4個步驟(圖1),轉(zhuǎn)化的第一步是從SDG中除去葡萄糖基產(chǎn)生SECO,這種生物轉(zhuǎn)化可以通過產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株進(jìn)行[6]。SDG釋放葡萄糖基是益生菌增加SECO釋放、提高其結(jié)腸黏膜吸收的生物利用度、腸道微生物向END和ENL的生物轉(zhuǎn)化的重要特征[18]。水解SDG的細(xì)菌有擬桿菌,如吉氏擬桿菌(Bacteroidesdistasonis),脆弱擬桿菌(B.fragilis),卵形擬桿菌(B.ovatus)和梭菌,如耳蝸形梭菌(Clostridiumcocleatum)、多枝梭菌(C.ramosum)、噬糖梭菌(C.saccharogumia)[19-21]。RONCAGLIA等[22]證明了雙歧桿菌可將SDG水解為SECO,發(fā)現(xiàn)了10株能夠水解SDG的雙歧桿菌菌株,尤其是假鏈狀雙歧桿菌WC401,對水解SDG和其他糖綴合的多酚類物質(zhì)具有較高的效率。

表2 使植物木酚素轉(zhuǎn)化為腸道木酚素及其前體的各種特定腸道細(xì)菌Fig.2 Various specific intestinal bacterias of transforming plant lignans into intestinal lignans and precursors

圖1 常見的植物木酚素轉(zhuǎn)化為腸道木酚素END和ENL的途徑Fig.1 Conversion pathway of common plant lignans to enterolignans END and ENL注：實線表示已知路徑,虛線表示理論路徑;反應(yīng)為：1-去糖基;2-脫甲基;3-脫羥基;4-脫氫;5-還原;6-氧化;?-未知

轉(zhuǎn)化的第二步是SECO去除甲基,產(chǎn)生二羥基腸二醇(dihydroxyenterodiol,DHEND)。能夠使SECO去甲基的菌株有食甲基丁酸桿菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、卡蘭德真桿菌(Eubacteriumcallanderi)、粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum)、布勞特氏菌(Blautiaproducta)、消化鏈球菌(Peptostreptococcusproductus)[19-20]。P.productus不僅催化SECO去甲基化,而且還催化LAR、MAT、PIN和其他各種甲基化芳香化合物的去甲基化[19]。Eubacterium.sp.ARC-2可使牛蒡苷元脫甲基為二羥基腸內(nèi)脂(dihydroxyenterolactone,DHENL),還可以通過去甲基化將SECO轉(zhuǎn)化為DHEND[23]。JIN等[24]發(fā)現(xiàn)梭菌科細(xì)菌(Clostridiaceae) END-2具有使SECO脫甲基的能力。

轉(zhuǎn)化的第三步是脫羥基,產(chǎn)生END。能去除芳香環(huán)上的羥基的細(xì)菌有遲緩埃格特菌(Eggerthellalenta)和梭狀芽苞桿菌(C.scindens)[20]。Lactonifactorlongoviformis可從END脫氫產(chǎn)生ENL[20-21]。這些反應(yīng)似乎是對映體特異性的,SDG與腸道細(xì)菌共孵育后分離出的END和ENL的形式為(+)-END和(+)-ENL。而ART或松脂酚二葡萄糖苷為底物則生成(-)-END和(-)-ENL[25-26]。E.lentaSDG-2可以將(+)-DHEND轉(zhuǎn)化為(+)-END,而不能將(-)-DHEND轉(zhuǎn)化為(-)-END,人類糞便中分離出的ARC-1,不僅能將(-)-DHEND轉(zhuǎn)化為(-)-END,也能將(+)-DHENL轉(zhuǎn)化為(+)-ENL[24]。另外,DHEND可以通過脫氫作用形成內(nèi)酯環(huán),從而形成中間體DHENL,然后再脫氫生成ENL[27]。

膳食木酚素PIN也通過4種化學(xué)反應(yīng)被腸道微生物轉(zhuǎn)化：首先是經(jīng)過2次還原反應(yīng)生成SECO,然后脫去2個甲基成為DHEND,再脫去2個羥基成為END,最后內(nèi)酯化成為ENL[19,28]。BESS等[29]通過比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組研究了4種細(xì)菌在厭氧環(huán)境生長過程中進(jìn)行每種反應(yīng)的能力。E.lentaDSM2243T發(fā)生催化還原和脫甲基反應(yīng),菌株產(chǎn)生的二芐醚還原酶(benzyl ether reductase,ber),由基因ber編碼,足夠使PIN發(fā)生還原和脫甲基反應(yīng)；B.productaDSM3507把SECO代謝為DHEND,培養(yǎng)過程中表達(dá)最高的基因guaiacol lignan methyltransferase(glm)；Gordonibacterpamelaea3C使DHEND脫羥基,生成END,培養(yǎng)過程中catechol lignan dehydroxylase(cldh)基因顯著上調(diào)；L.longoviformisDSM 17459T催化END的2個羥基內(nèi)酯化為ENL,在END的存在下，1個包含3個基因的單一基因組位點的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，其中1個基因與主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族轉(zhuǎn)運(yùn)體有同源性，另外2個基因與4Fe-4S NADP-依賴型氧化還原酶基和NAD (P)依賴型短鏈脫氫酶/還原酶基因(END lactonizing enzyme,edl)具有同源性，可能是這些酶基因簇使END發(fā)生到ENL的轉(zhuǎn)化。其他分離菌株的基因簇和酶還有待鑒定,雖然目前已經(jīng)分離并鑒定了大量的木酚素生物轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生腸道木酚素的菌株,但對其基因及編碼酶的詳細(xì)研究并不普遍,比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄分析已被證明是鑒定木酚素生物轉(zhuǎn)化過程中所涉及的酶的有效工具。

芝麻種子中最豐富的木酚素為芝麻素酚三葡萄糖苷(sesaminol triglucoside,STG),是一種有亞甲二氧基苯基的四氫呋喃類木酚素,去糖基后生成芝麻素酚(sesaminol,SES),腸道菌群將四氫呋喃木酚素轉(zhuǎn)化為哺乳動物木酚素,涉及到糖苷的水解、亞甲基的去甲基化、二芐基丁二醇氧化為二芐基丁內(nèi)酯、呋喃環(huán)的還原裂解[30]。對轉(zhuǎn)化SES的生物體的研究沒有涉及SDG轉(zhuǎn)化的生物體那么廣泛,在人類和大鼠體內(nèi)以及體外培養(yǎng)中,SES也能轉(zhuǎn)化為END和ENL[30]。ART的苷元ARG轉(zhuǎn)化為ENL需要5個反應(yīng)步驟,包括3個去甲基化反應(yīng)和2個去羥基化反應(yīng)[1]。

END和ENL生成后被腸道吸收,出現(xiàn)在血漿中,然后以葡萄糖醛酸鹽或硫酸鹽偶聯(lián)物的形式隨尿液和膽汁排出體外。QUARTIERI等[6]用5名連續(xù)7 d有亞麻籽膳食補(bǔ)充的受試者的糞便接種含SDG的培養(yǎng)物。在糞便培養(yǎng)物中鑒定出了與SECO、MAT和AHS有關(guān)的新型中間體,這些代謝物也以天然形式和/或以葡萄糖苷酸鹽或硫酸鹽復(fù)合物的形式隨尿液和膽汁排出體外。GAYA等[31]通過腸道菌群分析木酚素的代謝,體外發(fā)酵實驗采用14例健康成年志愿者的糞便樣品,所有受試者中均發(fā)現(xiàn)ENL,而END僅出現(xiàn)5例,木酚素代謝中沒有發(fā)現(xiàn)性別差異。雖然在腸道木酚素的產(chǎn)生中可以觀察到一些個體間的差異,但成年人類的腸道微生物在木酚素的代謝中表現(xiàn)出類似的行為。

4 體外木酚素微生物和酶法轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

體外木酚素的微生物和酶法轉(zhuǎn)化研究以生產(chǎn)應(yīng)用為目的,表3整理了與體外木酚素代謝有關(guān)的微生物和酶。杜木香等[37]利用生物酶水解SDG,結(jié)果顯示,3 mg/mL來源于綠色木霉的纖維素酶在60 ℃下反應(yīng)48 h時,對SDG的水解效果最佳,此時產(chǎn)物SECO的得率為43.6%,相較于化學(xué)法水解得率更高,且反應(yīng)后處理更為簡便、快捷。HWANG等[38]從人類糞便中分離出一株蠟樣芽孢桿菌(BacilluscereusH62L),可以釋放香豆酸葡萄糖苷(coumaric acid glucoside,CAG)、阿魏酸葡萄糖苷(ferulic acid glucoside,FAG)和SDG的糖基,但是其將SDG轉(zhuǎn)換為SECO的過程是有限的。由于蠟樣芽孢桿菌H62L葡萄糖苷酶的可逆性,SDG向SECO的生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率極其有限,影響產(chǎn)率的參數(shù)包括SDG的純度和β-葡萄糖苷酶的可逆性。為了提高腸道木酚素的產(chǎn)量,有研究提出在較高濃度下使用高純度SDG底物,或使用變構(gòu)抑制劑延緩SECO向SDG的反向反應(yīng),或?qū)ο灅友挎邨U菌株H62L進(jìn)行轉(zhuǎn)基因處理。之后,HWANG等[39]研究了從臭豆腐水中分離出的高地芽孢桿菌(BacillusaltitudinisHK02)產(chǎn)生的SDG-β-葡萄糖苷酶對亞麻籽糖苷SDG、CAG和FAG 3種糖苷的去糖作用。這些酚類糖苷的脫糖率取決于糖苷元上的糖基數(shù)目。3種糖苷的酶解糖效率可達(dá)100%左右。脫脂亞麻籽粉可以增強(qiáng)酶的活性,葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇等碳源對酶活性有明顯的抑制作用,纖維素可能是產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的良好誘導(dǎo)劑。ZHOU等[40]發(fā)現(xiàn)1株從人類腸道菌群中分離出來的菌株S1,與克雷伯氏菌屬(Klebsiella)親緣關(guān)系相近,該菌株可以通過轉(zhuǎn)化脫脂亞麻籽中前體產(chǎn)生SECO。

表3 與體外木酚素代謝有關(guān)的微生物和酶Table 3 List of microbial and enzyme implicated in the metabolism of lignans in vitro

GAYA等[41]研究了90種乳酸菌和雙歧桿菌中木酚素的代謝,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株有將SDG脫糖基為SECO的能力。還發(fā)現(xiàn)在一株青春雙歧桿菌(BifidobacteriumadolescentisINIA P784)作用下,能從木酚素提取物中產(chǎn)生1.12～4.18 μmol/L的END。然而,純木酚素SECO、MAT和SES并不能產(chǎn)生最終產(chǎn)物。BRAVO等[42]分析了70株乳酸菌、乳球菌和腸球菌產(chǎn)END和ENL的情況。在唾液乳桿菌(LactobacillussalivariusINIA P183、L.salivariusINIA P448)和格氏乳桿菌(L.gasseriINIA P508)中發(fā)現(xiàn)存在END和ENL,濃度分別約為46和6 μmol/L,且這些菌株產(chǎn)END的量是陽性對照B.adolescentisINIA P784產(chǎn)END量的10倍左右,這是首次發(fā)現(xiàn)單個菌株同時產(chǎn)生END和ENL。在此基礎(chǔ)上,PEIROTN等[43]在20種雙歧桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)3種雙歧桿菌(BifidobacteriumbifidumINIA P466、B.catenulatumINIA P732和B.pseudolongumINIA P2)能夠從木酚素提取物中產(chǎn)生低水平END(2～11 μmol/L),而另一種假鏈狀雙歧桿菌(B.pseudocatenulatumINIA P946)則使SECO產(chǎn)生量大大增加。隨后,這3種產(chǎn)END的雙歧桿菌和另外3種先前被確定能產(chǎn)腸道木酚素的乳桿菌(L.gasseriINIA P508、L.salivariusINIA P448和L.salivariusINIA P183)分別與純SECO共同培養(yǎng),得到END和ENL,而沒有代謝MAT。其中B.catenulatumP732和L.gasseriINIA P508是轉(zhuǎn)化SECO效率最高的菌株,產(chǎn)生濃度為2 mmol/L以上的ENL。此外,所有菌株的發(fā)酵過程中都觀察到中間化合物DHEND的形成。這項工作首次證明了雙歧桿菌和乳桿菌能夠進(jìn)行完全的腸道木酚素代謝,轉(zhuǎn)化純木酚素SECO為END和ENL。

ZHU等[44]通過反復(fù)傳代和平板培養(yǎng),從活性菌群中分離鑒定出3個形態(tài)各異的菌落,分別稱為ZL-I、ZL-II和ZL-III,在ZL-(I-II-III)菌株的聯(lián)合作用下,可直接從脫脂亞麻籽中產(chǎn)生END。3種菌株分別具有去糖基(ZL-I)、去甲基(ZL-II)和脫羥基(ZL-III)的功能。通過16Sr RNA序列分析發(fā)現(xiàn)它們分別與單行擬桿菌(B.uniformis)、粘液真桿菌(E.limosum)和遲緩埃格特菌(E.lenda)密切相關(guān),這些物種都常見于人的腸道。用單行擬桿菌(B.uniformisZL-I)和粘液真桿菌(E.limosumZL-II)轉(zhuǎn)化亞麻木酚素的試驗中,在2 L的發(fā)酵體系中于24 h內(nèi)約59.1%的SDG轉(zhuǎn)化為DHEND,到第6天時,發(fā)酵液中DHEND濃度達(dá)最大值,此時SDG轉(zhuǎn)化率達(dá)94.4%[45]。而與ZL-I菌株將脫脂亞麻籽中SDG轉(zhuǎn)化為SECO的比例(約80%)[46]相比,SDG轉(zhuǎn)化為END的轉(zhuǎn)化率大大提高,達(dá)到90%以上。

MUNOZ等[47]通過完全體外消化全亞麻籽和亞麻籽粉來評估干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌對亞麻木酚素生物可給性(bioaccessibility)的影響。干酪乳桿菌在體外消化過程中提高了亞麻籽中SDG和END的生物可給性。然而,嗜酸乳桿菌在開始的12 h內(nèi)增加了END的生物可給性,48 h后無增加。2種益生菌對亞麻籽粉的消化均無明顯影響。

5 結(jié)論

木酚素廣泛存在于亞麻籽、黑麥麩皮等各種植物中,是一種植物雌激素,具有預(yù)防結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和更年期綜合癥等作用。植物木酚素需經(jīng)腸道微生物多步代謝轉(zhuǎn)化為哺乳動物木酚素才能被人體吸收利用,各種木酚素的腸道代謝途徑、參與轉(zhuǎn)化的腸道微生物已有許多報道。其中,催化木酚素各轉(zhuǎn)化步驟的微生物酶系仍然有待進(jìn)一步明確,這將為指導(dǎo)木酚素體外生物轉(zhuǎn)化提供重要理論依據(jù)。由于木酚素的生物利用度對腸道菌群健康狀況的高度依賴,木酚素體外生物轉(zhuǎn)化,尤其是體外益生菌轉(zhuǎn)化對開發(fā)高活性木酚素產(chǎn)品具有重要意義。對植物木酚素分布、生理功能、體內(nèi)代謝吸收和體外生物轉(zhuǎn)化的研究將推動以亞麻籽粕、麩皮等農(nóng)副產(chǎn)品為原料開發(fā)木酚素高附加值產(chǎn)品的深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展,實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用,具有重要社會經(jīng)濟(jì)價值。