唐蘭芳,王鋒*,蘇小軍,李清明,郭紅英,孫毅中,孫翟翎

1(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院,湖南 長沙,410128) 2(湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心,湖南 長沙,410128) 3(新化縣綠源農(nóng)林科技有限公司,湖南 新化,417600)

黃精(Polygonatumsibiricum),系百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根莖,是我國重要的藥食同源性中藥材,有著上千年的食用和藥用歷史。黃精富含多糖、皂苷、黃酮、木脂素等多種功能成分[1],其中多糖是黃精中主要活性物質(zhì)。研究表明黃精多糖具有良好的抗氧化、抑菌、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3],在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)應(yīng)用前景廣闊。

黃精多糖的提取通常采用熱水浸提法,該方法簡單、易操作,但耗時長、提取率低,且長時間熱處理容易引起多糖結(jié)構(gòu)破壞[4]。自2003年ABBOTT等[5]首次提出低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DESs)概念以來,DESs在生物活性成分的提取上的應(yīng)用備受關(guān)注。DESs是一種新型、綠色的溶劑,性質(zhì)類似離子液體,且價格低、易獲得,具有較好的生物可降解性、穩(wěn)定性，低毒或無毒[6],目前已被廣泛應(yīng)用于多酚[7]、黃酮[8]、多糖[9-10]的提取。DESs具有極強的溶解能力與極廣的溶解范圍,因此采用DESs提取植物中有效成分其提取率普遍高于傳統(tǒng)溶劑,且生物活性也更強[11-12]。氯化膽堿-尿素(choline chloride-urea,CCU)是常用的DESs,其具有易制備、成本低、無毒等特點。STEFANOVIC等[13]采用量子力學和分子動力學模擬法,檢測幾類以氯化膽堿為供氫體的DESs的納米結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)CCU比其他DESs具有更加完善的氫鍵網(wǎng)絡(luò),而氫鍵的形成是 DESs 影響活性成分提取率的重要因素。本課題組前期研究也表明,采用CCU提取淮山多糖,提取率顯著高于熱水浸提法[14]。然而,現(xiàn)有的文獻多集中在如何利用DESs提高活性成分提取率[15],對其影響提取成分的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能的研究卻很少。

為揭示DESs對黃精多糖理化性質(zhì)和功能特性的影響規(guī)律,本研究以多花黃精為原料,分別對CCU和熱水提取的黃精多糖分子質(zhì)量、單糖組成等基本性質(zhì)進行分析,并比較2種方法提取的黃精多糖抗氧化能力和抑制晚期糖基化末端產(chǎn)物能力的差異,以期為黃精多糖的提取及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多花黃精(P.cyrtonemaHua,PcH),產(chǎn)自新化縣綠源農(nóng)林科技有限公司萬寶山基地；葡聚糖標準品(Mw1 152、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800 Da)、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖標準品、氨基胍(純度≥98%),美國Sigma公司；熒光素鈉、奎諾二甲基丙烯酸(水溶性維生素E,純度為97%)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH,純度為97%)、葡萄糖分析對照品(純度≥99%),上海麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH,純度>97%),梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2′-聯(lián)氨-雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽 (ABTS,純度≥98%)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,純度≥98%),上海瑞永生物科技有限公司；氯化膽堿、尿素、牛血清蛋白、硫酸、甲醇、乙醇等均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；小型液氮冷凍低溫粉碎機,上海凈信有限公司；SCIENTZ-18 N冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍離心機,長沙英泰儀器有限公司；PHS-3C pH計,上海精密科學儀器有限公司；H-8數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海浦東物理光學儀器廠；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,鞏義市予華有限責任公司；SHZ-D(Ⅲ)W循環(huán)水式多用真空泵,上海力辰邦西儀器科技有限公司；FJ-7200型可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司；Varioskan Flash多功能讀數(shù)儀,美國賽默飛世爾科技有限公司；LC-10A高效液相色譜儀、QP2010plus氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、IRAffinity-1傅里葉紅外光譜儀,日本島津有限公司；JSM-6380LV掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社；BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱(8 mm×300 mm)、RXI-5 SIL MS色譜柱(30 m×0.25mm×0.25 μm),博瑞糖生物技術(shù)有限公司；RI-502SHODEX示差折光檢測器,日本Shodex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃精多糖的制備

原料處理：鮮黃精洗凈、切片,60 ℃熱風干燥至含水量<10%,由冷凍低溫粉碎機研磨成細粉,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

參照中國藥典(2015版)熱水回流法提取黃精多糖[16]。準確稱取10 g黃精粉于圓底燒瓶中,按料液比1∶30 (g∶mL)加入體積分數(shù)80%的乙醇熱水回流1 h,趁熱抽濾,將殘渣置燒瓶中,按料液比1∶30(g∶mL)加入蒸餾水,置沸水浴中加熱回流1 h,趁熱抽濾,殘渣重復提取1次,合并濾液,采用Sevage試劑[V(正丁醇)∶V(三氯甲烷)=1∶4]除蛋白,濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200 mL,加入4倍體積的無水乙醇于4 ℃冰箱醇沉12 h,離心(5 000 r/min,10 min),沉淀經(jīng)冷凍干燥,得到水提黃精多糖(PolygonatumcyrtonemaHua polysaccharides extracted by water,WPcHP)。

參照文獻[9]稍加改動,將氯化膽堿與尿素按摩爾比1∶2進行混合,設(shè)置含水量為30%,60 ℃水浴攪拌至完全溶解,配制成清澈透明的DESs,備用。準確稱取10 g黃精粉于錐形瓶中,按料液比1∶30(g∶mL)加入DESs,放入90 ℃水浴鍋中提取40 min,取出冷卻后加入4倍體積無水乙醇于4 ℃冰箱醇沉12 h,離心,沉淀采用一定體積蒸餾水復溶,過濾除渣,濾液采用Sevage試劑除蛋白,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200 mL,再次加入4倍體積無水乙醇,于4 ℃冰箱醇沉6 h,離心,沉淀經(jīng)冷凍干燥,得到DESs提黃精多糖(PolygonatumcyrtonemaHua polysaccharides extracted by CCU,CCUPcHP)。

1.3.2 黃精多糖提取率計算

采用蒽酮硫酸法測定提取液中多糖含量[16]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,制作標準曲線,得到線性回歸方程為y=0.134 2x+0.002 2,R2=0.999 6。將黃精多糖提取液稀釋至一定質(zhì)量濃度,按標準曲線制作步驟,于波長582 nm處測定吸光度。多糖提取率按公式(1)計算：

(1)

式中：C，標準曲線計算出的黃精多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V，樣品體積，mL；N，稀釋倍數(shù)；m1，黃精粉質(zhì)量，g。

1.3.3 黃精多糖純度(以總糖含量計)的測定

分別準確稱取WPcHP、CCUPcHP各10 mg,配制成1 mg/mL的黃精多糖溶液,將其稀釋至一定質(zhì)量濃度后,按1.3.1中標準曲線制作步驟,采用蒽酮硫酸法測定所得黃精多糖的總糖含量,計為多糖純度。多糖純度按公式(2)計算：

(2)

式中：0.9，多糖校正系數(shù)；m2，黃精多糖質(zhì)量，g。

1.3.4 分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)測定黃精多糖的重均分子質(zhì)量[17]。以不同分子質(zhì)量的葡聚糖為標準品,繪制標準品重均分子質(zhì)量的對數(shù)lgMw與保留時間的標準曲線,樣品重均分子質(zhì)量由保留時間根據(jù)標準曲線方程計算。

色譜條件：以去離子水作流動相,流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；柱溫35 ℃。

1.3.5 單糖組成分析

準確稱取2 mg黃精多糖,加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸水解90 min,減壓濃縮蒸干,殘基中加入2 mL雙蒸水,待殘基溶解后,加入100 mg硼氫化鈉還原8 h,加入冰乙酸中和,置于110 ℃烘箱中烘干,烘干后加入1 mL乙酸酐在100 ℃下乙?；? h,冷卻,然后加入3 mL甲苯,減壓濃縮至蒸干,重復4次,除盡多余的乙酸酐。在得到的黃精多糖乙?；a(chǎn)物中加入3 mL三氯甲烷溶解,轉(zhuǎn)至分液漏斗,加入少量蒸餾水充分搖勻后,除去上層水溶液,重復4次。得到的三氯甲烷層用適量的無水硫酸鈉干燥,定容至10 mL,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定樣品單糖組成[18]。

GC-MS條件：RXI-5 SIL MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫條件：起始溫度120 ℃,以3 ℃/min升溫至250 ℃/min；保持5 min；進樣口溫度250 ℃,檢測器溫度250 ℃/min,載氣為氦氣,流速1 mL/min。

1.3.6 傅立葉紅外光譜掃描

稱取1 mg黃精多糖置于研缽中,加入100 mg干燥至恒重的KBr,研磨均勻,電動壓片機壓片,在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外掃描。

1.3.7 多糖微觀形態(tài)觀察

取黃精多糖樣品適量,鋪于樣品臺上,噴金鍍膜后置于掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察并照相。

1.3.8 黃精多糖抗氧化活性的測定

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)法根據(jù)ZAR等[19]的方法進行；DPPH法與鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)法根據(jù)ZHAO等[4]的方法進行；ABTS法根據(jù)CHENG等[20]的方法進行。

1.3.9 黃精多糖抗糖基化能力的測定

參照楊生輝等[21]的方法,配制20 mg/mL的牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液與0.5 mol/L的葡萄糖(glucose,Glu)溶液,以體積比1∶1混合,備用。取3 mL BSA-Glu混合液,分別加入1 mL樣品溶液和6 mL磷酸緩沖溶液,混合均勻,于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃孵育1周,以氨基胍(aminoguanidine,AG)為對照,測定糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products,AGEs)在激發(fā)波長370 nm,發(fā)射波長440 nm處的熒光值,黃精多糖對AGEs生成的相對抑制率按公式(3)計算:

(3)

式中：Fc,對照組熒光值；Fs,樣品熒光值；Fs1,反應(yīng)體系中以磷酸緩沖溶液代替Glu樣品的熒光值；Fs2,反應(yīng)體系中以磷酸緩沖溶液代替BSA樣品的熒光值

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標準偏差”表示,采用Origin 8.5進行繪圖,采用SPSS 19 LSD法進行方差分析,P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法對黃精多糖提取率與純度的影響

熱水提取的黃精多糖提取率為(8.38±0.10)%,而采用DESs提取黃精多糖,提取率高達(28.50±0.04)%。相較于熱水,DESs具有更出色的溶解能力,采用DESs提取黃精多糖可大大提高多糖的提取率。但CCUPcHP純度為(65.99±0.55)%，顯著低于WPcHP[(83.12±0.36)%],這可能是因為DESs溶解范圍廣,在提取多糖的同時,原料中有其他成分溶出,從而降低了多糖純度。

2.2 提取方法對黃精多糖基本性質(zhì)的影響

2.2.1 分子質(zhì)量比較

WPcHP與CCUPcHP對應(yīng)的HPGPC圖譜非單一對稱峰(圖1),說明2種方法提取的黃精多糖為雜多糖[22]。WPcHP具有2個峰,其保留時間分別為37.428、42.785 min,由葡聚糖標準曲線方程計算可得到其重均分子質(zhì)量分別為73 369、3 499 Da；而CCUPcHP具有的3個峰,保留時間分別在32.579、38.086、43.218 min,對應(yīng)的重均分子質(zhì)量分別為1 152 818、50 487、2 736 Da。2種方法提取所得黃精多糖分子質(zhì)量差異較大,CCUPcHP分子質(zhì)量分布范圍更廣,可能與DESs溶解能力強,能夠降解熱水所不能提出的多糖有關(guān)。

a-WPcHP；b-CCUPcHP圖1 黃精多糖高效凝膠滲透色譜圖Fig.1 HPGPC spectra of PcHP

2.2.2 單糖組成比較

將2種方法所提黃精多糖的GC-MS圖譜與混合單糖標準品圖譜進行對照。如圖2所示,WPcHP有2種單糖出峰時間與標準品一致,表明其含有2種單糖,分析表明WPcHP主要由葡萄糖(95%)組成,并含有少量甘露糖(5%)；CCUPcHP有6種單糖出峰時間與標準品一致,表明其含有6種單糖,其中甘露糖(42.3%)所占比例最大,葡萄糖次之(23.9%),半乳糖與阿拉伯糖分別占19.8%、11.9%,鼠李糖(1.3%)與木糖(0.9%)所占比例小。由DESs所提取的黃精多糖的單糖組分多于熱水提取,可能與DESs溶解能力更強有關(guān),從兩者相對分子質(zhì)量的差異也能得到印證(圖1)。

圖2 黃精多糖GC-MS圖譜Fig.2 GC-MS spectra of PcHP注：1～7分別為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖單糖標準品

單糖組成結(jié)果表明,黃精多糖主要由葡萄糖與甘露糖組成,但劉娜[23]的研究表明,黃精多糖的單糖組成以鼠李糖、半乳糖為主,甘露糖、葡萄糖與木糖含量相對較少,與本結(jié)果差異明顯,原因可能是黃精產(chǎn)地不同以及本研究黃精多糖皆為粗多糖。

2.2.3 紅外光譜比較

圖3 兩種方法提取所得黃精多糖紅外光譜圖比較Fig.3 FTIR spectra of PcHP extracted with two solvents

2.2.4 微觀結(jié)構(gòu)比較

SEM常用于觀察物質(zhì)的表面形態(tài)結(jié)構(gòu),通過電子束對樣品表面進行掃描,從而獲得樣品表面的三維空間信息[27]。如圖4 所示,同一放大倍數(shù)下,2種方法提取所得黃精多糖表面結(jié)構(gòu)均較疏松,為多網(wǎng)孔片狀結(jié)構(gòu),但CCUPcHP片狀結(jié)構(gòu)更粗,表面更光滑(圖4-b),而WPcHP表現(xiàn)為表面粗糙和具有更多不規(guī)則的碎片(圖4-a)。王藝[28]在研究黃精多糖結(jié)構(gòu)表征中發(fā)現(xiàn),黃精多糖SEM圖有多網(wǎng)孔片狀、多分支鏈聚集與網(wǎng)鏈結(jié)構(gòu)3種,而本研究只發(fā)現(xiàn)多網(wǎng)孔片狀結(jié)構(gòu)。

a-WPcHP；b-CCUPcHP圖4 兩種方法提取所得黃精多糖掃描電鏡圖Fig.4 SEM micrographs of PcHP extracted with two solvents

2種提取方法黃精多糖微觀結(jié)構(gòu)的不同可能與提取條件的作用強度有關(guān),采用DESs提取黃精多糖,作用條件較熱水溫和,多糖結(jié)構(gòu)所受的破壞較小。ZHAO等[4]研究表明不同提取方式對淮山多糖的微觀結(jié)構(gòu)影響較大,其中采用溫水提取的多糖表面形貌為有規(guī)律的、光滑均一的形態(tài),而超聲輔助提取的多糖表現(xiàn)為表面粗糙的小顆粒塊狀。

2.3 提取方法對黃精多糖抗氧化活性影響

2.3.1 ORAC值與 FRAP值的比較

ORAC法最接近真實生理環(huán)境氧化過程,它具有可操作性強、靈敏度高等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于食品中功能成分抗氧化能力的檢測[29]。如圖5所示,CCUPcHP的ORAC值(170.99±6.88)μmol/g顯著大于WPcHP(35.82±3.22)μmol/g,表明CCUPcHP抗氧化能力顯著強于WPcHP。

酸性條件下,Fe3+在TPTZ溶液中呈橘黃色,在遇到抗氧化物質(zhì)后，F(xiàn)e3+被還原成Fe2+,使溶液成藍色,藍色越深則表明抗氧化能力越強。如圖5 所示,2種方法所得黃精多糖均具一定的鐵離子還原能力,但CCUPcHP的FRAP值顯著大于WPcHP,說明CCUPcHP的鐵離子還原能力顯著優(yōu)于WPcHP。

圖5 兩種方法提取所得黃精多糖ORAC值與FRAP值比較Fig.5 The ORAC and FRAP value of PcHP extracted with two solventsed

2.3.2 DPPH自由基清除能力比較

如圖6所示,2種方法提取所得黃精多糖對DPPH自由基具有一定的清除能力,清除效果具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性,與Vc相比,多糖的清除效果顯著低于Vc。多糖質(zhì)量濃度<5 mg/mL時,DPPH自由基清除率<10%,隨著濃度的增大,清除率不斷上升。多糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL時,WPcHP對DPPH自由基的清除率為32.05%,CCUPcHP的清除率為36.35%,表明在較高濃度時,CCUPcHP對DPPH自由基清除能力強于WPcHP。

圖6 兩種方法提取所得黃精多糖DPPH自由基清除能力比較Fig.6 DPPH free radical scavenging capacity of PcHP extracted with two solvents

2.3.3 ABTS陽離子自由基清除能力比較

如圖7所示,隨著黃精多糖質(zhì)量濃度增大,其對ABTS陽離子自由基的清除率也不斷增大,多糖的ABTS陽離子自由基清除效果顯著低于Vc。CCUPcHP對ABTS陽離子自由基的清除能力顯著強于WPcHP,在多糖質(zhì)量濃度為8 mg/mL時,CCUPcHP的清除能力>60%,相同質(zhì)量濃度下,WPcHP的清除能力為49.7%。當CCUPcHP質(zhì)量濃度增至16 mg/mL時,清除率達95.33%,趨于平緩；而WPcHP質(zhì)量濃度增至20 mg/mL時,清除率為89.78%。

圖7 兩種方法提取所得黃精多糖ABTS陽離子自由基清除能力比較Fig.7 ABTS free radical scavenging capacity of PcHP extracted with two solvents

2.4 提取方法對黃精多糖抗糖基化活性的影響

AGEs可在人體內(nèi)自發(fā)生成并累積,與人體糖尿病、阿爾茲海默癥以及心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[30]。由圖8可知,盡管2種方法提取得到的黃精多糖對BSA-Glu體系中AGEs生成的抑制作用均低于同濃度陽性對照AG,但也顯示出其對AGEs生成具有良好的抑制作用,抑制效果具有明顯濃度依賴性。CCUPcHP抑制AGEs生成能力顯著高于WPcHP。當質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,CCUPcHP和WPcHP對AGEs的抑制能力分別達到78.01%和73.14%,均有望用于生產(chǎn)天然、安全的AGEs抑制劑或相關(guān)的功能食品。

圖8 兩種方法提取所得黃精多糖抑制AGEs生成能力比較Fig.8 AGEs inhibition rates of PcHP in BSA-Glu model extracted with two solvents

3 結(jié)論

DESs比熱水具有更強的黃精多糖溶出能力,采用DESs提取黃精多糖,提取率高達28.50%,為熱水提取的3.40倍,但由DESs提取的黃精多糖(CCUPcHP)純度顯著低于熱水提取的黃精多糖(WPcHP)。

不同提取溶劑對黃精多糖基本性質(zhì)與生物活性的影響較大。CCUPcHP的分子質(zhì)量與單糖組成跟WPcHP相比差異顯著,CCUPcHP含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等6種單糖,而WPcHP僅含甘露糖與葡萄糖。2種方法提取所得黃精多糖表面結(jié)構(gòu)均較疏松,為多網(wǎng)孔片狀結(jié)構(gòu),但CCUPcHP片狀結(jié)構(gòu)更粗,主要呈現(xiàn)出有規(guī)律的光滑片狀,而WPcHP表現(xiàn)為表面粗糙的碎片狀。

通過4種不同的抗氧化方法測定黃精多糖的抗氧化活性,結(jié)果均表明,CCUPcHP抗氧化能力顯著強于WPcHP；抗糖基化結(jié)果表明,2種方法提取所得黃精多糖對AGEs的生成均具有良好的抑制作用,在相同質(zhì)量濃度下,CCUPcHP抗糖基化能力顯著高于WPcHP。