陳大衛(wèi),梁嬌嬌,程月,瞿恒賢,陳春萌,任晨瑜,張臣臣,關(guān)成冉,馬文龍,陳霞,李啟明,顧瑞霞*

1(揚州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室,江蘇 揚州,225127) 2 (新希望乳業(yè)股份有限公司,四川 成都,610023)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是由非酒精消耗或其他原因引起的肝臟脂質(zhì)過量,造成肝細(xì)胞中脂滴積聚,肝臟呈現(xiàn)腫大的現(xiàn)象,會對人體健康產(chǎn)生較大的影響[1]。目前,NAFLD的藥物治療主要是通過預(yù)防肝細(xì)胞的氧化、減少肝細(xì)胞的促炎因子及血脂水平等方式進行[2-3],但其存在一定的副作用[4]。通過膳食干預(yù)也能有效改善肝臟的脂肪變性和炎癥反應(yīng),并具有良好的益生作用[5],因此,膳食干預(yù)是人們進行輔助治療NAFLD的重要途徑。

益生菌及其發(fā)酵乳制品不僅可以通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等來增強機體的抗氧化能力和免疫能力[6-7],還可以通過降低肝細(xì)胞的甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)含量以及調(diào)節(jié)脂肪變性和炎癥因子水平等來改善機體的NAFLD癥狀[8-10]。而臨床研究也發(fā)現(xiàn),益生菌可以通過改善患者血清中的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平及降低脂肪肝指數(shù)等來達(dá)到輔助治療NAFLD的效果[11-14],但具體的作用機制尚不明確。

目前,NAFLD的機制研究大多數(shù)采用動物和肝癌細(xì)胞株HepG2來進行[15],但動物模型造模周期長、成本高、穩(wěn)定性較差；同時,肝癌細(xì)胞株HepG2與人肝細(xì)胞存在較大的差距[16]。與之相比,人肝細(xì)胞系L-02具有造模周期短、個體差異小等優(yōu)勢[17]。來源于廣西巴馬長壽人群的鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發(fā)酵乳對由高血脂癥引起的大鼠肝臟細(xì)胞脂肪變性具有良好的改善作用[18],但對于人肝細(xì)胞的作用效應(yīng)和機制尚不明確。研究顯示,將樣品在大鼠體內(nèi)經(jīng)過一系列的生物轉(zhuǎn)化,再作用于細(xì)胞的研究結(jié)果較樣品直接添加到細(xì)胞中更為準(zhǔn)確[19]。本文利用油酸和棕櫚酸的混合物游離脂肪酸(free fat acid,FFA)建立體外人肝細(xì)胞L-02 NAFLD模型,探討鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)大鼠后的血清在模型中對脂肪變性的人肝細(xì)胞L-02的益生作用,并建立一種更接近于人肝細(xì)胞的體外NAFLD細(xì)胞變性模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wistar雄性大鼠,6周齡,體重(200±20) g,揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(蘇)2017-0007,實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2017-0044；基礎(chǔ)飼料(面粉、米粉、玉米、鼓皮、豆料、魚粉及骨粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、10%、20%、26%、20%、2%、2%),江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)hsryfm 1301,江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室；人肝細(xì)胞株L-02,蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。

胎牛血清,杭州四季青生物有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液,美國Hyclone公司；無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),德國Ruibio公司；細(xì)胞凍存液、胰酶消化液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%)、RIPA裂解液,上海碧云天生物技術(shù)有限公司；油酸鈉(oleic acid,OA)、油紅O試劑盒、AV/PI凋亡試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；棕櫚酸鈉,美國Sigma公司；CCK8(Cell Counting Kit-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒,日本同仁公司；甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒,美康生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HERAcell 150CO2培養(yǎng)箱、Multiskan Sky 1510全波長酶標(biāo)儀,美國ThermoFisher科技有限公司；IX2-ILL100熒光倒置顯微鏡,日本Olympus公司；7020全自動生化分析儀,日本日立公司；5804R高速冷凍離心機,德國Eppendorf股份公司；LSRFortessa流式細(xì)胞儀,美國BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇的人肝細(xì)胞L-02置于完全培養(yǎng)液中(RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)分別為90% 和10%),于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每24 h更換1次培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(細(xì)胞面積>80%),用胰酶消化液消化傳代,取5代后的細(xì)胞進行后續(xù)試驗。

1.3.2 NAFLD細(xì)胞模型中FFA的添加濃度

1.3.2.1 不同F(xiàn)FA濃度對細(xì)胞存活率的影響

取100 μL濃度為5×104個/mL的人肝細(xì)胞L-02懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液；利用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA完全培養(yǎng)液將5 mmol/L FFA分別稀釋至0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2 mmol/L；以未添加FFA為對照組,添加不同濃度的FFA為模型組,每組3個復(fù)孔,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后加入10 μL CCK8試劑,37 ℃孵育1 h后于490 nm處測定OD值,按公式(1)計算細(xì)胞存活率：

(1)

1.3.2.2 不同F(xiàn)FA濃度對細(xì)胞脂滴的影響

取1 mL濃度為5×105個/mL的人肝細(xì)胞L-02懸液接種于6孔培養(yǎng)板中,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,以未添加FFA為對照組,添加1.3.2.1小節(jié)中不同濃度的FFA為模型組,每組3個復(fù)孔,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,釆用油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況。

1.3.3 NAFLD細(xì)胞模型的評價

1.3.3.1 細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的測定

取1 mL濃度為5×105個/mL的人肝細(xì)胞L-02懸液接種于6孔培養(yǎng)板中,以不添加FFA為對照組,添加最佳濃度的FFA為模型組,每組3個復(fù)孔,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,胰酶消化液消化3 min后,用完全培養(yǎng)液終止消化,1 000×g離心5 min,PBS溶液清洗2遍,每管加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液,吹打均勻,置于冰上裂解4 h后,12 000×g離心10 min取上清液,采用全自動生化分析儀測定上清液中TG和TC含量。

1.3.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、ALT酶活力的測定

從1.3.3.1小節(jié)培養(yǎng)24 h后的6孔培養(yǎng)板中取出細(xì)胞上清液,以不添加FFA為對照組,4 000×g離心5 min,測定培養(yǎng)液中AST和ALT的含量。

1.3.3.3 細(xì)胞凋亡率的測定

取1 mL濃度為5×106個/mL的人肝細(xì)胞L-02懸液接種于6孔培養(yǎng)板中,在37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,對照組加入含1%的BSA的完全培養(yǎng)液,模型組加入最佳濃度的FFA,每組3個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后加入500 μL胰酶消化液消化3 min后,加入完全培養(yǎng)液終止消化,1 000×g離心5 min,去上清液收集細(xì)胞；用100 μL 1×buffer輕輕吹打細(xì)胞后,分別加入4 μL 異硫氰酸熒光素和4 μL 碘化丙啶,輕輕渦旋混勻,室溫避光孵育15 min后每管加入400 μL 1×buffer,混勻,測定細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發(fā)酵乳的制備

將在MRS液體培養(yǎng)基中活化2代后的鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301按3%的接種量接種至熱處理后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的脫脂乳中,42 ℃發(fā)酵至活菌數(shù)為109CFU/mL,進行活菌計數(shù),4 ℃貯藏備用。

1.3.5 大鼠血清的制備

試驗期間保持動物房通風(fēng)、透光,室溫為(23±1) ℃,濕度為(50±5)%,22只Wistar雄性大鼠用基礎(chǔ)飼料正常飼喂1周后,按各組間平均體重?zé)o顯著差異分為對照組和益生菌干預(yù)組,每組11只。干預(yù)組喂食基礎(chǔ)飼料,并按1 mL/100 g的量灌胃鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳,對照組喂食基礎(chǔ)飼料及等量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水,每天上午灌胃1次,記錄每天的進食量及每周的體重,以便調(diào)整灌胃量。4周后眼球取血,4 ℃孵育30 min,3 500×g離心20 min,合并同組大鼠血清,56 ℃滅活30 min除去血清中的雜抗體等物質(zhì),并利用0.22 μm濾孔過濾除菌,避免細(xì)胞受到污染[17,20],-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有實驗程序?yán)格按照《實驗動物的護理和使用指南》進行。

1.3.6 鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)后的大鼠血清對模型中細(xì)胞的益生作用

利用RPMI-1640培養(yǎng)液分別將對照組和干預(yù)組的大鼠血清稀釋至10%[17],然后取1 mL 加至細(xì)胞模型中,每組3個復(fù)孔,于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,PBS溶液清洗2遍；觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化,并測定細(xì)胞中TG、TC含量、細(xì)胞凋亡率以及血清細(xì)胞培養(yǎng)液中AST和ALT的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均采用Sigmaplot 10.0、SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計和分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,以單因素方差分析進行顯著性檢驗,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAFLD細(xì)胞模型中FFA的添加濃度

通過測定模型中人肝細(xì)胞L-02的存活率及觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化情況來確定模型中FFA的最佳添加濃度,結(jié)果如表1和圖1所示。

表1 不同濃度的FFA對細(xì)胞存活率的影響(n=3)Table 1 Effect of different concentration of FFA on the survival rate of cells

a-0 mmol/L (對照組)；b-0.25 mmol/L；c-0.5 mmol/L；d-0.75 mmol/L；e-1 mmol/L；f-1.5 mmol/L；g-2 mmol/L圖1 不同濃度的FFA對細(xì)胞脂滴的影響(×400)Fig.1 The effect of different concentration of FFA on the lipid droplets in cells

由表1可知,當(dāng)模型中FFA的濃度分別為0.25、0.50和0.75 mmol/L時,人肝細(xì)胞L-02的存活率較高,均大于88.78%；而隨著FFA濃度的不斷增加,細(xì)胞的存活率隨之下降,當(dāng)FFA濃度大于1 mmol/L時,細(xì)胞的存活率顯著下降(P<0.05),由1 mmol/L時的86.37%分別下降至1.5 mmol/L時的31.98%和2 mmol/L時的19.48%。

由圖1可知,人肝細(xì)胞L-02經(jīng)油紅O染色后,未添加FFA的細(xì)胞邊緣清晰,核膜完整,細(xì)胞內(nèi)未見紅色脂滴；而隨著FFA濃度的增加,細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量呈逐漸增多,且體積呈逐漸增大的趨勢。當(dāng)FFA濃度大于1 mmol/L時,肉眼可見的細(xì)胞數(shù)量大幅度減少,細(xì)胞形狀發(fā)生變化,表明當(dāng)添加的FFA超過一定濃度時,會嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞；但當(dāng)濃度低于1 mmol/L時,脂肪變性不充分,脂滴數(shù)量較少；當(dāng)FFA濃度為1 mmol/L時,細(xì)胞脂肪變性充分,脂滴數(shù)量較多,結(jié)合細(xì)胞存活率的試驗結(jié)果,選取1 mmol/L作為模型中FFA的最佳添加濃度。

2.2 NAFLD細(xì)胞模型

由表2可知,添加了1 mmol/L FFA的模型組人肝細(xì)胞L-02培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞內(nèi)TG含量為5.73 mmol/L,顯著高于對照組(P<0.05)；同時,培養(yǎng)液中AST含量為113.50 U/L,顯著高于對照組的73.67 U/L(P<0.05),表明1 mmol/L的FFA造成了細(xì)胞的脂肪變性,與NAFLD大鼠模型特征較為一致[21]。

表2 脂肪變性細(xì)胞內(nèi)TG、TC及細(xì)胞培養(yǎng)液中 AST和ALT 的含量(n=3)Table 2 Content of TG,TC in the steatosis cells and AST,ALT content in the cell culture medium

由圖2可知,對照組人肝細(xì)胞L-02的早期凋亡率為1.82%,晚期凋亡率為1.79%,占總體細(xì)胞的3.61%；而模型組細(xì)胞早期凋亡率為1.88%,晚期凋亡率為2.14%,占總體細(xì)胞的4.02%,兩組之間的細(xì)胞凋亡率差異較小,表明1 mmol/L的FFA對細(xì)胞未造成嚴(yán)重?fù)p傷,與機體單純性脂肪變性特征相符[22]。

a-對照組；b-模型組圖2 脂肪變性對細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of steatosis on the apoptosis rate of cells

2.3 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)后的大鼠血清對模型中細(xì)胞的益生作用

2.3.1 大鼠血清對細(xì)胞脂滴的影響

以未干預(yù)菌株發(fā)酵乳的大鼠血清作為對照組,研究鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)后的大鼠血清對NAFLD模型中人肝細(xì)胞L-02脂滴的影響,結(jié)果如圖3所示。

a-對照組；b-益生菌干預(yù)組圖3 大鼠血清對細(xì)胞脂滴的影響(×400)Fig.3 Effect of rats serum on the lipid droplets in cells

由圖3可知,對照組大鼠血清作用脂肪變性的人肝細(xì)胞L-02 24 h后,細(xì)胞邊緣較為明顯,核膜完整,胞內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴且體積較大,出現(xiàn)脂肪變性現(xiàn)象；與對照組相比,干預(yù)組大鼠血清作用的細(xì)胞內(nèi)胞漿豐富,胞內(nèi)紅色脂滴數(shù)量較少、體積較小,表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)的大鼠血清能有效改善細(xì)胞的脂肪變性。

2.3.2 大鼠血清對細(xì)胞TG、TC含量及血清培養(yǎng)液中AST和ALT含量的影響

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)后的大鼠血清對模型中人肝細(xì)胞L-02 胞內(nèi)TG、TC含量的影響及血清培養(yǎng)液中AST和ALT的含量見圖4和圖5。

圖4 大鼠血清對細(xì)胞TG和TC含量的影響(n=3)Fig.4 The effect of rats serum on the content of TG and TC in cells

圖5 大鼠血清細(xì)胞培養(yǎng)液中AST和ALT的含量(n=3)Fig.5 The content of AST and ALT in the cell culture medium of rats serum

由圖4可知,干預(yù)組的大鼠血清作用于人肝細(xì)胞L-02后,細(xì)胞內(nèi)TG含量為1.95 mmol/L,顯著低于對照組的2.88 mmol/L(P<0.05)；TC含量稍低于對照組,但無顯著性差異(P>0.05)。

由圖5可知,對照組的人肝細(xì)胞L-02培養(yǎng)液中AST的含量為118.67 U/L,干預(yù)組的血清細(xì)胞培養(yǎng)液中AST的含量為93.33 U/L,顯著低于對照組(P<0.05)；而ALT的含量分別為5.59 U/L和5.83 U/L,無顯著性差異(P>0.05)；表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳可通過降低細(xì)胞內(nèi)TG和AST轉(zhuǎn)氨酶的含量來減輕NAFLD對細(xì)胞的損傷。

2.3.3 大鼠血清對細(xì)胞凋亡率的影響

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)后的大鼠血清對人肝細(xì)胞L-02凋亡率的影響如圖6所示。

a-對照組；b-益生菌干預(yù)組圖6 大鼠血清對細(xì)胞凋亡率的影響Fig.6 The effect of rats serum on the apoptosis rate of cells

由圖6可知,對照組中人肝細(xì)胞L-02的早期凋亡率為1.42%,晚期凋亡率為5.04%,正常細(xì)胞數(shù)量為91.2%；經(jīng)干預(yù)組的大鼠血清作用后,人肝細(xì)胞L-02的早期凋亡率為0.89%,晚期凋亡率為2.61%,正常細(xì)胞數(shù)量高達(dá)95.7%。與對照組相比,干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率相對下調(diào)了2.96%,正常細(xì)胞數(shù)量相對上調(diào)了4.5%,說明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)的大鼠血清能夠降低人肝細(xì)胞L-02的凋亡率,緩解細(xì)胞損傷,對NAFLD具有較好的改善作用。

3 討論

由于人與動物之間生物代謝表達(dá)和活性不同[23],使得在動物試驗中肝細(xì)胞脂肪變性的穩(wěn)定性較差[14],因此建立一種理想的體外模擬人肝細(xì)胞的NAFLD模型尤為重要。棕櫚酸是飲食和血清中最豐富的游離脂肪酸,容易引發(fā)肝臟的脂肪變性[24-25],而油酸毒性較小,能夠抵消棕櫚酸對肝細(xì)胞的毒性[26],并具有增強棕櫚酸酯化和穩(wěn)定脂滴的能力[27]。因此,試驗采用油酸和棕櫚酸混合的FFA建立人肝細(xì)胞L-02脂肪變性模型。當(dāng)1 mmol/L的FFA作用于人肝細(xì)胞L-02時,對細(xì)胞的存活率影響較小,同時還使得細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量達(dá)到最大值,并顯著增加了模型中細(xì)胞TG含量及培養(yǎng)液中AST含量(P<0.05),且細(xì)胞的凋亡率與對照組無顯著性差異(P>0.05),符合NAFLD的特征指標(biāo)[21]。表明成功建立的NAFLD細(xì)胞模型,具有造模周期短、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢[28]。

鼠李糖乳桿菌可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物來改善機體的NAFLD癥狀[29]。鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發(fā)酵乳能夠通過調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的腸道微生物來改善大鼠血清的脂質(zhì)代謝[18],而本文的研究還發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)后的大鼠血清不僅可以顯著降低細(xì)胞TG含量,還可以顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)液中AST的含量(P<0.05)；CAUSSY等[30]的研究發(fā)現(xiàn),血清中來自腸道微生物的代謝產(chǎn)物在改善NAFLD癥狀過程中發(fā)揮著重要作用；而雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌可以通過調(diào)節(jié)機體血清中的脂質(zhì)、轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子及抗氧化物質(zhì)等代謝產(chǎn)物來降低NAFLD對機體的損傷[11-13,31]。因此,鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發(fā)酵乳可能是通過調(diào)節(jié)腸道微生物來改善機體血清中脂質(zhì)、轉(zhuǎn)氨酶等代謝產(chǎn)物,進而發(fā)揮其對NAFLD人肝細(xì)胞L-02的益生作用。

益生菌還能通過調(diào)節(jié)SIRT-1/PGC-1α/SREBP-1、Nrf-2/HO-1和PPAR-α等與血脂、抗氧化物質(zhì)及膽汁酸代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)來減輕機體的NAFLD癥狀[8,32-33]。因此,后續(xù)將從腸道微生物-血清的代謝產(chǎn)物及其代謝通路等方面入手,進一步闡明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發(fā)酵乳干預(yù)的大鼠血清在NAFLD模型中對人肝細(xì)胞L-02的益生作用機制。