楊 欣，全 睿，王 慧，郭海波，滕 柳

在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，存在大量表達(dá)硫酸軟骨素蛋白多糖的一類細(xì)胞，稱為NG2細(xì)胞，其抗原屬性、形態(tài)及功能等有別于其他的膠質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為是第四類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。研究表明NG2細(xì)胞在體內(nèi)能夠產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞，還能產(chǎn)生原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞；在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個區(qū)域，NG2細(xì)胞和神經(jīng)元之間存在獨特的突觸聯(lián)系，可能與神經(jīng)元形成一個獨特的神經(jīng)膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是調(diào)節(jié)睡眠和覺醒的神經(jīng)遞質(zhì)，主要來源于中腦中縫核, 中縫核內(nèi)富含5-HT神經(jīng)元，同時中縫核內(nèi)也存在著神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞群。課題組前期研究顯示腦內(nèi)的5-HT下降可激活中縫核星形膠質(zhì)細(xì)胞，但NG2細(xì)胞功能變化對大鼠中縫核興奮性和抑制性遞質(zhì)含量的影響尚不明確。因此，該研究采用微透析的方法，探討中縫核中5-HT與NG2細(xì)胞的相互作用對γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid,GABA)和谷氨酸 (glutamic acid,Glu) 遞質(zhì)含量變化的影響。

1 材料與方法

1

.

1 材料

1

.

1

.

1

實驗動物 健康SD(Sprague- Dawley)大鼠70只，雄性，體質(zhì)量220～250 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK (湘) 20180010。實驗動物飼養(yǎng)在避光、通風(fēng)、電磁屏蔽狀態(tài)環(huán)境中，實驗溫度(22±2)℃，相對濕度45%～50%，飼料由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。

1

.

1

.

2

實驗試劑 甲醇、乙腈(色譜純)購自德國默克公司；無水乙酸鈉、冰醋酸、四氫呋喃及其余試劑為國產(chǎn)分析純；Glu標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg，純度≥99%)、GABA標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg，純度≥98%)購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1

.

1

.

3

實驗儀器 液相色譜儀(型號：安捷倫1260)為安捷倫科技(杭州)有限公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)(型號：Eppendorf 5810R)為美國Thermo公司產(chǎn)品；電子天平(型號：Sartori-us BSA124S )為賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(型號：KQ5200E)為昆山市超聲儀器(昆山)有限公司產(chǎn)品；OLABO數(shù)顯三用恒溫水箱(型號：HH-W420)為鑫貝西生物技術(shù)(濟(jì)南)有限公司產(chǎn)品。

1

.

2 實驗方法

1

.

2

.

1

動物分組及給藥 健康雄性SD大鼠70只，隨機(jī)分為正常組、對照組、NG2抗體(NG2-Ab)組、對氯基丙氨酸(p-chlorophenylalanine，PCPA)組、5-羥色胺(5-HT)組、PCPA+NG2-Ab組和5-HT+NG2-Ab組。正常組不做任何處理；對照組中縫核微量注射2 μl 0.9%氯化鈉溶液；NG2-Ab組中縫核微量注射NG2-Ab(2 μg/μl)2 μl；PCPA組中縫核微量注射PCPA(5 μg/μl)2 μl；5-HT組中縫核微量注射5-HT(1.25 μg/μl)2 μl；PCPA+NG2-Ab組中縫核微量注射PCPA(10 μg/μl)1 μl+ NG2-Ab(2 μg/μl)1 μl。5-HT+NG2-Ab組中縫核微量注射5-HT(2.5 μg/μl)1 μl+NG2-Ab(2 μg/μl)1 μl。

1

.

2

.

2

標(biāo)準(zhǔn)品及緩沖液配制 GABA、Glu標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取GABA、Glu標(biāo)準(zhǔn)對照品10.00 mg，配成100 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)液，置于40 ℃冰箱保存。鄰苯二甲醛(O-Phthalaldehyde，OPA)柱前衍生: 稱取0.2 g OPA，溶解于10 ml甲醇(4 ℃保存)；配置衍生劑溶液[0.5 ml OPA+2 ml 0.2 mol/L四硼酸鈉緩沖液(PH=9.4)+30 μl β-巰基乙醇]，此衍生劑溶液可保持2 d。取樣品或標(biāo)準(zhǔn)品10 μl，加入上述溶液100 μl，混勻，反應(yīng)1 min后通過0.22 μm濾膜過濾進(jìn)樣。

1

.

2

.

3

色譜分析條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18 (250 mm×4.6 mm，填料顆粒直徑5 μm)，流動相A為氫呋喃-甲醇-0.05 mol/L醋酸鈉(PH=6.2,5∶75∶420 V/V)，流動相B為甲醇，檢測波長254 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl。梯度洗脫程序：0～6 min，流動相B的體積分?jǐn)?shù)為20%；6～20 min，流動相B的體積分?jǐn)?shù)從20%升至50%；20～30 min，流動相B的體積分?jǐn)?shù)從50%升至100%；30～40 min，流動相B的體積分?jǐn)?shù)從100%降至20%。

1

.

2

.

4

微透析實驗

1

.

2

.

4

.

1

微透析管的埋置 動物用25%氨基甲酸乙酯(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于立體定位儀上。按照Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜確定中縫核位置(前囟后7.4 mm,旁開0 mm，深度6.4 mm)，用顱骨鉆鉆開一直徑為2 mm的顱窗，挑破硬腦膜，在立體定位儀引導(dǎo)下將微透析套管插入中縫核，牙科水泥固定，術(shù)后將實驗動物置于特定的環(huán)境中，單籠飼養(yǎng)，連續(xù)3 d腹腔注射4萬U青霉素，動物恢復(fù)5 d后用于實驗。實驗結(jié)束后微透析插管部位注入臺盼藍(lán)染色，切片，鏡下檢查插管位置，檢查結(jié)果表明插管位置均位于中縫核。

1

.

2

.

4

.

2

微透析液的收集 實驗動物每日9 a.m.進(jìn)行微透析液收集。將微透析探針插入預(yù)先埋置于中縫核的套管中，微透析管膜長1 mm，外徑為0.5 mm。用Ringer氏液以2 μl/min的速度灌流，每20 min收集1管透析液(40 μl)。微透析管置入60 min后正式收集微透析液，以取得穩(wěn)定的基礎(chǔ)值。實驗給藥前分別收集20、40 min微透析液作為實驗對照，然后收集給藥后第20、40、60、80、100、120 min各時相點的微透析液，用于測定Glu、GABA的含量。樣本收集器的溫度設(shè)定為4 ℃。收集后的微透析液樣品置于-80 ℃冰箱保存。

2 結(jié)果

2.1 Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

分別吸取Glu和GABA濃度為0、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/ml，加入衍生劑溶液100 μl。以峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。Glu：

Y

=2 086

.

6

X

+741

.

35，

r

=0.990 7；GABA：

Y

=3 040

X

-962

.

05，

r

=0.990 1。

2.2 GABA、Glu定性結(jié)果

將GABA、Glu標(biāo)準(zhǔn)液在色譜儀上以10 μl進(jìn)樣作色譜分析。在標(biāo)準(zhǔn)液的定性分析中，根據(jù)保留時間以及紫外譜圖判定該物質(zhì)。定性結(jié)果見圖1A、B。Glu、GABA標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間分別為2.186、3.437 min。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖A：Glu標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；B：GABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 中縫核注射NG2抗體對GABA 和Glu含量變化的影響

與對照組相比，NG2-Ab組GABA含量在注射后第80 min 和第100 min時間段降低，Glu含量在注射后40 min降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)(表1、2)。結(jié)果表明中縫核NG2-Ab能影響GABA和Glu含量。

2.4 中縫核注射PCPA對GABA和Glu含量變化的影響

與對照組相比，PCPA組第80 min、第100 min和第120 min GABA含量降低，Glu含量在注射后100 min和120 min升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1、2。

2.5 中縫核注射5-HT對GABA和Glu含量變化的影響

與對照組相比：5-HT組GABA含量在注射后第40 min、第100 min和第120 min 升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；Glu含量在第20 min、第40 min降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05，

P

<0.01)。見表1、2。

表1 各組大鼠給藥前后中縫核GABA含量的變化

3 討論

NG2細(xì)胞廣泛分布于成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的灰質(zhì)及白質(zhì)中，NG2細(xì)胞不能被其它類型的膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)志物所標(biāo)記，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記，也不被神經(jīng)元的標(biāo)志物MAP2所標(biāo)記。因此，NG2細(xì)胞被認(rèn)為是一種新的膠質(zhì)細(xì)胞類型。NG2細(xì)胞具有高度分化潛能，主要分化成參與髓鞘形成的少突膠質(zhì)細(xì)胞。NG2細(xì)胞能表達(dá)離子型Glu受體和GABA受體，還能與神經(jīng)元形成興奮性和抑制性突觸聯(lián)系，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞中起到重要作用。

5-HT能神經(jīng)元胞體主要集中在中縫核，發(fā)出上行纖維投射到大腦皮質(zhì)、紋狀體、間腦、邊緣系統(tǒng)和小腦等腦區(qū)。中縫核群的5-HT能神經(jīng)元投射到間腦和大腦皮質(zhì)，主要形成慢波睡眠(SWS)，中縫核尾部的神經(jīng)元則與腦橋背內(nèi)側(cè)被蓋相聯(lián)系，負(fù)責(zé)觸發(fā)快波睡眠(FWS)。中縫核內(nèi)的神經(jīng)元包括5-HT能神經(jīng)元和非5-HT能神經(jīng)元，除神經(jīng)元外，中縫核內(nèi)還含有大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它們能被外界刺激因素影響從而改變其組織形態(tài)，改變與神經(jīng)元的信息交流和相互作用。

PCPA是色氨酸羥化酶不可逆抑制劑，可以有效阻止5-HT的合成，顯著降低腦內(nèi)的5-HT濃度。為了進(jìn)一步了解中縫核NG2細(xì)胞與5-HT的功能關(guān)系，本研究向中縫核內(nèi)微量注射PCPA及5-HT,分別造成5-HT含量下降和5-HT含量升高，觀察GABA和Glu含量變化情況;同時注射NG2細(xì)胞抗體，觀察NG2細(xì)胞興奮性下降后5-HT含量下降或上升導(dǎo)致的GABA和Glu含量變化情況。研究顯示單獨給予PCPA造成5-HT含量下降后，能引起中縫核GABA含量下降、Glu含量上升；而同時給予PCPA和NG2細(xì)胞的抗體，中縫核GABA含量無明顯變化，而Glu含量則下降，表明NG2細(xì)胞興奮性被抑制后PCPA引起的GABA含量和Glu含量變化發(fā)生了改變，提示NG2細(xì)胞參與了5-HT含量下降導(dǎo)致的GABA和Glu含量的變化過程。中縫核單獨微量注射5-HT導(dǎo)致5-HT含量上升后，GABA含量上升，Glu含量下降；同時給予5-HT和NG2-Ab后，中縫核GABA含量無明顯變化，Glu含量下降；提示NG2細(xì)胞參與了5-HT上升引起的GABA含量變化。

表2 各組大鼠給藥前后中縫核Glu含量的變化

研究顯示NG2細(xì)胞與缺血、低氧、外傷、炎癥及毒性物質(zhì)作用等諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，NG2細(xì)胞是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有害刺激迅速作出反應(yīng)的細(xì)胞類型之一，其反應(yīng)往往比神經(jīng)元發(fā)生早，甚至早于其它神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這些研究說明NG2細(xì)胞在神經(jīng)病理學(xué)中發(fā)揮積極作用；NG2細(xì)胞可能與神經(jīng)元構(gòu)成一個獨特的神經(jīng)元—膠質(zhì)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種生理和病理過程，極有可能成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些疾病治療的靶點。本研究表明NG2細(xì)胞可以調(diào)節(jié)中縫核GABA和Glu含量，同時參與5-HT含量變化引起的GABA和Glu含量變化的調(diào)控。GABA和Glu是腦內(nèi)重要的抑制性遞質(zhì)和興奮性遞質(zhì)，在皮質(zhì)興奮和抑制調(diào)節(jié)機(jī)制中起著重要作用，但NG2通過何種途徑調(diào)控GABA和Glu的含量，還需進(jìn)一步研究。正常的睡眠覺醒功能依賴于皮層興奮和抑制的動態(tài)平衡，中樞5-HT可能通過改變Glu能和GABA能神經(jīng)元的興奮性，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放量，調(diào)控大腦皮質(zhì)興奮和抑制過程，NG2細(xì)胞在其中發(fā)揮了重要的作用。該研究為睡眠調(diào)節(jié)藥物的研發(fā)提供了實驗依據(jù)。