夏 玉，王 維，鄧鉑林，高玉英，李 靜

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)是兒童最常見(jiàn)的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，典型表現(xiàn)為白眼或斜視。Rb的治療是多模式的，包括化療 (靜脈內(nèi)化療和動(dòng)脈內(nèi)化療)、放射治療、手術(shù)治療及病灶治療包括經(jīng)瞳孔熱療、冷凍治療和激光光凝等。越來(lái)越多的證據(jù)表明，微小RNA(MicroRNA,miRNA)在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起著抑癌基因或致癌基因的作用。研究表明miR-30、miR-let-7e、miR-21和miR-320在Rb中表達(dá)失調(diào)，是診斷Rb的生物標(biāo)志物。miR-188-5p 在Rb組織中表達(dá)量上調(diào)，并抑制DNA結(jié)合抑制因子(DNA binding 4，ID4)的表達(dá)，從而加快Rb的發(fā)展進(jìn)程。該文主要通過(guò)檢測(cè)異澤蘭黃素對(duì)miR-188-5p的表達(dá)影響及對(duì)Rb的細(xì)胞侵襲、細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1

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1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

Rb Y79細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院的細(xì)胞庫(kù)，并用含10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)進(jìn)行培養(yǎng)于37 ℃生長(zhǎng)。miR-188-5p mimic和miR-NC根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)轉(zhuǎn)染到SU-DHL-4細(xì)胞。

1.2 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物比色 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法檢測(cè)細(xì)胞活性

在96孔板中，將Rb Y79細(xì)胞分別用不同濃度異澤蘭黃素(1、2.5、5、10、20、40、100、200、300 μmol/L)處理24 h時(shí)，再用10 μl MTT染料處理細(xì)胞，然后與100 μl二甲基亞砜孵育15 min，用酶免疫分析儀在490 nm處測(cè)量吸光度。用各濃度處理組細(xì)胞吸光度值與1 μmol/L組細(xì)胞吸光度值的比值表示細(xì)胞活性。

1.3 miR-188-5p mimic轉(zhuǎn)染及分組

將Y79細(xì)胞分為3組：① Control組：Y79細(xì)胞不做任何處理；② mimic-NC組：通過(guò)Lipofectamine? 2000將mimic-NC轉(zhuǎn)染到Y(jié)79細(xì)胞；③ miR-188-5p mimic組(mimic轉(zhuǎn)染組)：通過(guò)Lipofectamine? 2000將miR-188-5p mimic轉(zhuǎn)染到Y(jié)79細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后， RT-qPCR檢測(cè)miR-188-5p轉(zhuǎn)染效率。然后將Y79細(xì)胞分為4組， ① Control組：Y79細(xì)胞不做任何處理；② 40 μmol/L異澤蘭黃素組：Y79細(xì)胞用40 μmol/L濃度的異澤蘭黃素處理24 h時(shí)；③ mimic轉(zhuǎn)染組：通過(guò)Lipofectamine? 2000將miR-188-5p mimic轉(zhuǎn)染到Y(jié)79細(xì)胞；④ mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組：通過(guò)Lipofectamine? 2000將miR-188-5p mimic轉(zhuǎn)染到Y(jié)79細(xì)胞，然后用40 μmol/L濃度的異澤蘭黃素處理24 h時(shí)。

1

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4 Western blot

用異澤蘭黃素10、20、40 μmol/L分別處理Y79細(xì)胞后，將細(xì)胞用裂解緩沖液裂解在4 ℃并以14 000 r/min離心15 min濃縮蛋白質(zhì)。然后用BCA試劑盒(上海碧云天生物有限公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取20 μg總蛋白經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜在37 ℃下用1 h封閉5%的牛血清白蛋白，然后與抗E-cadherin、N-cadherin、Bax和Bcl-2在4 ℃過(guò)夜。用TBS緩沖液(含Tween-20的Tris緩沖鹽溶液)洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反應(yīng)1 h；洗膜后ECL曝光成像并應(yīng)用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.5 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量

使用TRIzol從Y79細(xì)胞提取總RNA，提取的總RNA首先去除基因組中的DNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以上步驟根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作。熒光定量檢測(cè)反應(yīng)體系：5 μl的SYBR Premix，各0.5 μl的上游引物和下游引物，3 μl的RNase Free dHO，1 μl的cDNA。程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行熔解曲線分析：95 ℃維持10 s，65 ℃處理1 s,此后從65 ℃開(kāi)始，每個(gè)循環(huán)溫度增加0.5 ℃，時(shí)間為1 s。miR-188-5p引物是5′-CCCTCTCTCACATCCCTTGCAT-3′ (上游)和5′-ATCCTGCAAACCCTGCATGTG-3′ (下游)。

1

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6 克隆形成試驗(yàn)

將Y79細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-188-5p mimic和miR-NC進(jìn)行處理，在無(wú)毒培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約14 d。并用40 μmol/L異澤蘭黃素處理轉(zhuǎn)染miR-188-5p mimic Y79細(xì)胞24 h時(shí)用冷的甲醇-冰醋酸固定細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫染色。

1

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7 流式細(xì)胞術(shù)

采用Annexin Ⅴ-熒光素(AV)和碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組Y79細(xì)胞的凋亡率。刺激后，用PBS洗滌細(xì)胞，5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI在室溫、黑暗中孵育15 min。使用FACScan流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)進(jìn)行流式分析，使用FlowJo軟件(美國(guó)Tree Star公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)

用不含血清的DMEM將接種5×10/200 μl Y79細(xì)胞在Transwell室上部,下室充滿500 μl 10%FBS DMEM。孵育24 h后，將下室中的細(xì)胞固定在95%乙醇中，然后用蘇木精染色。在倒置顯微鏡下計(jì)算進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 異澤蘭黃素對(duì)Rb Y79細(xì)胞存活率的影響

隨著異澤蘭黃素濃度的增加，Rb Y79細(xì)胞活性明顯下降。當(dāng)異澤蘭黃素濃度為5、10、20、40 μmol/L時(shí)，Rb Y79細(xì)胞活性>70%，毒性較低。因此，本研究選擇異澤蘭黃素10 μmol/L (低劑量組)、20 μmol/L (中劑量組)、40 μmol/L (高劑量組) 作后續(xù)研究。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法檢測(cè)Rb Y79細(xì)胞活性

2.2 異澤蘭黃素對(duì)Rb Y79細(xì)胞凋亡和遷移的影響

通過(guò)Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin蛋白的含量，結(jié)果顯示，與Control組比較，Bax/Bcl-2的比值在異澤蘭黃素中劑量組(

t

=9.653,

P

<0.05)和高劑量組(

t

=15.730,

P

<0.01)中上調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Control組比較，E-cadherin蛋白的表達(dá)量在異澤蘭黃素中劑量組(

t

=4.750,

P

<0.05)和高劑量組(

t

=10.922,

P

<0.01)中上調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Control組 比較，N-cadherin蛋白的表達(dá)量在異澤蘭黃素中劑量組(

t

=9.894,

P

<0.05) 和高劑量組(

t

=13.649,

P

<0.01)中下調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；尤其在異澤蘭黃素高劑量組中蛋白表達(dá)量的變化差異更大。見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、E-cadheri和N-cadherin蛋白的變化

2.3 異澤蘭黃素對(duì)Rb miR-188-5p表達(dá)量的影響

Y79細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染mimic-NC和miR-188-5p mimic，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)miR-188-5p的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與Control組比較, 轉(zhuǎn)染miR-188-5p mimic組中miR-188-5p的表達(dá)量上調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=12

.

516,

P

<0.01)。 與Control組比較, 異澤蘭黃素中劑量組(

t

=12.413,

P

<0.05)和高劑量組 (

t

=38.634,

P

<0.01)中Y79細(xì)胞內(nèi)miR-188-5p的表達(dá)量下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用40 μmol/L濃度異澤蘭黃素處理轉(zhuǎn)染后的Y79細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果顯示，與mimic轉(zhuǎn)染組比較, mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組miR-188-5p的表達(dá)量下調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=12.603,

P

<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-188-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 異澤蘭黃素抑制miR-188-5p表達(dá)量對(duì)Y79細(xì)胞增殖和凋亡影響

克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組比較，40 μmol/L異澤蘭黃素組中異澤蘭黃素能抑制Y79細(xì)胞, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (

t

=7.925,

P

<0.01)；與mimic轉(zhuǎn)染組比較，在mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組中異澤蘭黃素也抑制Y79細(xì)胞克隆率, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (

t

=7.159,

P

<0.01)； 然而，與Control組比較，mimic轉(zhuǎn)染組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=6.001,

P

<0.01)。見(jiàn)圖4A、B。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與Control組比較，40 μmol/L異澤蘭黃素組異澤蘭黃素能促進(jìn)Y79細(xì)胞凋亡, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=8.831,

P

<0.01)；與mimic轉(zhuǎn)染組比較，mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組中異澤蘭黃素也促進(jìn)Y79細(xì)胞凋亡, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=10.142,

P

<0.01)；然而，與Control組比較，mimic轉(zhuǎn)染組miR-188-5p過(guò)表達(dá)抑制Y79細(xì)胞凋亡, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=3.163,

P

<0.05)。見(jiàn)圖4C、D。

圖4 Y79細(xì)胞胞增殖和凋亡的測(cè)定

2.5 異澤蘭黃素抑制miR-188-5p表達(dá)量對(duì)Y79細(xì)胞侵襲的影響

Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，結(jié)果顯示，與Control組比較，40 μmol/L異澤蘭黃素組異澤蘭黃素能抑制Y79細(xì)胞侵襲力, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.977,

P

<0.01)；與mimic轉(zhuǎn)染組比較， mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組異澤蘭黃素也抑制Y79細(xì)胞侵襲力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=6.246,

P

<0.01)。然而，與Control組比較，在mimic轉(zhuǎn)染組miR-188-5p過(guò)表達(dá)促進(jìn)Y79細(xì)胞侵襲力, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=7.844,

P

<0.01)。見(jiàn)圖5A、B。Western blot檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin蛋白的含量，結(jié)果顯示，與mimic組比較，mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組E-cadherin蛋白的表達(dá)量上調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=9.827,

P

<0.05)，而與mimic組比較，mimic轉(zhuǎn)染+40 μmol/L異澤蘭黃素組N-cadherin蛋白的表達(dá)量下調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=20.940,

P

<0.01)。見(jiàn)圖5C、D。

圖5 細(xì)胞侵襲力及相應(yīng)蛋白的測(cè)定

3 討論

異澤蘭黃素 (5,7-二羥基-3,4,6-三甲氧基黃酮) 是一種從青蒿中提取的黃酮類化合物，具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗癌作用。異澤蘭黃素能夠抑制食管癌TE1細(xì)胞的增殖，同時(shí)還能誘導(dǎo)TE1細(xì)胞在G/G期細(xì)胞周期阻滯。異澤蘭黃素誘導(dǎo)骨肉瘤U-2OS細(xì)胞G/M期的阻滯和凋亡，同時(shí)能夠觸發(fā)線粒體凋亡通路，抑制癌細(xì)胞的增殖。該研究顯示在異澤蘭黃素處理Rb Y79細(xì)胞后，Bax /Bcl-2的比值增加，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡率增加；克隆形成試驗(yàn)中Y79細(xì)胞增殖下調(diào)；Transwell實(shí)驗(yàn)表明Y79細(xì)胞的侵襲力下調(diào)，E-cadherin蛋白的表達(dá)量上調(diào)，而N-cadherin蛋白的表達(dá)量下調(diào)。以上研究表明，異澤蘭黃素能抑制Rb Y79細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Rb 是兒童最常見(jiàn)的眼內(nèi)癌，在亞洲和非洲，近40%～70%的兒童死于Rb ，而在歐洲和美國(guó)，這一比例僅為3%。miRNA的異常調(diào)節(jié)也參與著Rb 的發(fā)展。有研究表明miR-221/222的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了Rb Y79細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-188-5p 在Rb 組織中表達(dá)量上調(diào)，而miR-188-5p的過(guò)表達(dá)抑制ID4的表達(dá)，從而加快Rb 的發(fā)展進(jìn)程。并且已經(jīng)有研究表明異澤蘭黃素抑制miR-21的表達(dá)量，而miR-21通過(guò)抑制YAP1蛋白的表達(dá)促腎癌細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)抗氧化作用。也有研究表明異澤蘭黃素通過(guò)促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞系HeLa和Caski細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖的作用。本研究顯示異澤蘭黃素抑制miR-188-5p的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，同時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)染miR-188-5p的Y79細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖和侵襲。以上研究表明異澤蘭黃素通過(guò)抑制miR-188-5p的表達(dá)抑制Rb 的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

該研究?jī)H為體外細(xì)胞試驗(yàn)和機(jī)制的初步探討，體內(nèi)試驗(yàn)有待進(jìn)一步進(jìn)行研究；該研究?jī)H僅表明異澤蘭黃素抑制miR-188-5p過(guò)表達(dá)，但通過(guò)什么機(jī)制，或者靶向作用何種蛋白還有待進(jìn)一步研究。