葛若木，魏 翔，孫曉梅，周 青，汪 淵，張素梅

肺癌嚴(yán)重危害人類的健康，其發(fā)病率、病死率都位居世界首位。肺癌的分類有很多種，其中按照組織病理學(xué)分類可分成非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)?？谷~酸制劑培美曲塞(pemetrexed, Pe)是肺癌的常用化療藥物，這種化療藥物結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶的基團(tuán)，作用是破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過(guò)程，抑制細(xì)胞DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。并且Pe在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖有抑制作用且隨藥物濃度增加而增強(qiáng)。目前臨床上Pe作為一線抗癌藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，且化療藥物Pe對(duì)非小細(xì)胞肺癌的療效十分顯著，而化療藥物用藥過(guò)程中遇到的主要問(wèn)題就是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥。腫瘤微環(huán)境的常見(jiàn)情況是不同程度的低氧，且低氧對(duì)Pe耐藥有影響作用。該研究利用模擬物理低氧環(huán)境，研究低氧環(huán)境下非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞對(duì)化療藥物Pe耐藥的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；一抗Bax、Caspase-3、Bcl-2、p53、NF-κB購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；山羊抗鼠、山羊抗兔、兔抗山羊二抗購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀(型號(hào)：Thermo MultiskanGO，美國(guó)Thermo-Fisher公司)；低溫離心機(jī)(型號(hào)：Sorvall Legend Micro 21R，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司)；電泳儀(型號(hào)：DYY-11，北京六一儀器廠)；-80 ℃冰箱(型號(hào)：MDF-U73V，日本Sanyo公司)；CO細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)：MCO-20AIC，日本Panasonic公司)；超凈工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-1F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；正置顯微鏡(型號(hào)：DM4000B，德國(guó)Leica公司)；電子天平(型號(hào)：DC-120AS，南京蘇測(cè)計(jì)量?jī)x器有限公司)；搖床(TS-1型，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiQ4600，上海歐翔公司)。

1.3 方法

1

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3

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1

細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的A549細(xì)胞，在37 ℃水浴中復(fù)蘇，用RPMI 1640培養(yǎng)基(10%FBS、1%青鏈霉素混合液)于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代。

1

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3

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2

低氧處理 將低氧組細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO、1% O恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1

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3

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3

細(xì)胞分組 將A549細(xì)胞分為6組：常氧對(duì)照組，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)未做任何處理；常氧溶劑組，A549細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO后常氧培養(yǎng)；常氧加藥組，在完全培養(yǎng)基中加入Pe，配制成8 μmol/L Pe溶液，將A549細(xì)胞置于常氧中培養(yǎng)；低氧細(xì)胞組，A549常規(guī)培養(yǎng)，置于低氧培養(yǎng)箱中；低氧溶劑組，A549細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO后低氧培養(yǎng)；低氧加藥組，在完全培養(yǎng)基中加入Pe，配制成8 μmol/L Pe溶液，并將A549細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1

.

3

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4

四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl terazolium, MTT)比色法 用完全養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后消化細(xì)胞。1 000 r/min離心7 min，收集沉淀的細(xì)胞。用完全培養(yǎng)基重懸離心管中的細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。在96孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，每個(gè)孔大約3 000個(gè)，共計(jì)種3塊96孔培養(yǎng)板，然后置于常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁，約8 h。用完全培養(yǎng)基配置成不同藥物濃度(1、2、4、8、16、32、64 μmol/L)，然后用這些不同藥物濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行換液，另外設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，前者用不加藥物的完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液，后者用加入DMSO溶劑的完全培養(yǎng)基進(jìn)行換液。3塊培養(yǎng)板分別置于常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，然后每孔加入20 μl MTT試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。隨后取出培養(yǎng)板，將每孔中的培養(yǎng)基用槍頭吸出，然后每個(gè)孔再加入100 μl DMSO，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度。

1

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3

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5

Hoechst染色 將潔凈蓋玻片高壓滅菌后于70%乙醇中浸泡，移入超凈臺(tái)內(nèi)用酒精燈烘干。將蓋玻片夾除放于6孔板內(nèi)，然后種入細(xì)胞，大約50%的密度。再分別用完全培養(yǎng)基、加入DMSO和Pe的完全培養(yǎng)基換液培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)基吸出，加0.5 ml固定液，10 min后棄去固定液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)洗3 min，共2遍后吸出PBS。PBS洗滌時(shí)用搖床晃動(dòng)。加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min。用搖床晃動(dòng)數(shù)次，棄去染色液，PBS洗3 min，共2遍后吸出PBS。洗滌時(shí)用搖床晃動(dòng)。在載玻片上滴1滴抗熒光淬滅封片液，細(xì)胞的一面蓋向載玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，注意不要有氣泡產(chǎn)生。用熒光顯微鏡觀察，激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右。

1

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3

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6

Western blot檢測(cè) A549細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長(zhǎng)密度達(dá)80%后，PBS洗3次，將長(zhǎng)滿A549細(xì)胞的6孔板放在冰上，加100 μl含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，裂解30 min后，用細(xì)胞刮將貼壁的細(xì)胞刮下來(lái)，收集細(xì)胞蛋白于EP管中，4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)出的蛋白濃度數(shù)值，將不同分組的細(xì)胞，用蛋白裂解液配成同體積同濃度液體，再加上蛋白上樣緩沖液，混勻，然后煮沸使蛋白變性，-80 ℃保存。配制SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣進(jìn)行電泳，每組蛋白上樣量保持一致，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。置于封閉液中在搖床上室溫封閉2 h，封閉液為5%脫脂牛奶，一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h后進(jìn)行顯影。用QuantityOne軟件分析各條帶的灰度值，并計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)適宜的Pe濃度篩選

用MTT比色法篩選Pe適宜實(shí)驗(yàn)使用濃度，8 μmol/L Pe對(duì)A549細(xì)胞的增殖有抑制作用，并與作用時(shí)間和作用濃度呈正比，在8 μmol/L的藥物濃度下作用48 h后，A549細(xì)胞的抑制率達(dá)到30%左右，因此選取此濃度作為實(shí)驗(yàn)的藥物濃度。見(jiàn)圖1。

圖1 Pe分別作用A549細(xì)胞24、48、72 h后細(xì)胞的相對(duì)抑制率

2.2 A549細(xì)胞于Pe作用后在低氧環(huán)境與常氧環(huán)境下細(xì)胞凋亡率比較

常氧環(huán)境下，與常氧對(duì)照組相比，常氧加藥組A549細(xì)胞的凋亡率升高，凋亡率約為9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05 )。而在低氧環(huán)境下，低氧加藥組A549細(xì)胞的凋亡率較常氧下降低，凋亡率約為3%，與常氧對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05 )。見(jiàn)圖2。

圖2 A549細(xì)胞作用于Pe后在常氧和低氧培養(yǎng)箱48 h后細(xì)胞的凋亡率 Hoechst 33258染色 ×400

2.3 A549細(xì)胞在低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，hif-1α)蛋白表達(dá)量表達(dá)

常氧組與低氧組的各3組細(xì)胞分別置于常氧培養(yǎng)箱和低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，與常氧對(duì)照組比較：低氧培養(yǎng)箱中的3組細(xì)胞hif-1α的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=1 150.932，

P

<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后hif-1α蛋白表達(dá)量

2.4 低氧環(huán)境中，加入Pe后，A549細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax、p53表達(dá)量變化

在低氧環(huán)境下，低氧加藥組促凋亡蛋白Bax表達(dá)量較常氧加藥組減少 (

F

=860.017，

P

=0.018)。在常氧環(huán)境下，常氧加藥組Bax、p53蛋白的表達(dá)量升高(

F

=860.017、19 601.811，

P

<0.05)。而低氧環(huán)境下，低氧加藥組的p53蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常氧加藥組(

F

=19 601.811，

P

<0.05)。見(jiàn)圖4A、B。

2.5 低氧環(huán)境下，Pe作用于A549細(xì)胞后，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)量變化

常氧環(huán)境下，Pe作用于A549細(xì)胞48 h后，常氧加藥組Bcl-2蛋白較常氧對(duì)照組表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=485.856，

P

<0.05)。低氧環(huán)境下，低氧加藥組Bcl-2蛋白表達(dá)較常氧加藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是低氧對(duì)照組的Bcl-2蛋白表達(dá)量較常氧對(duì)照組降低(

F

=485.856，

P

<0.05)。見(jiàn)圖4C。提示低氧環(huán)境下，加藥后Bcl-2蛋白表達(dá)降低幅度要小于常氧環(huán)境下。

圖4 Pe作用于A549細(xì)胞48 h后，在常氧和低氧環(huán)境下Bax、p53、Bcl-2蛋白表達(dá)量

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是最常見(jiàn)的肺癌類型，約占所有肺癌的80%。化療藥物Pe是一種新型抗葉酸制劑，常用于晚期非小細(xì)胞肺癌的治療。腫瘤的內(nèi)環(huán)境常處于低氧狀態(tài)，低氧對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、遷移和凋亡都有不同程度的影響。而hif-1α是低氧反應(yīng)最關(guān)鍵的因子,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖和血管生成等。近年來(lái)，有研究表明在低氧環(huán)境下，葉酸抑制了核hif-1α的積累，且呈劑量依賴性。低氧條件下葉酸通過(guò)PI3K/AKT/hif-1α途徑促進(jìn)細(xì)胞自我保護(hù)，體內(nèi)的低氧環(huán)境會(huì)對(duì)抗葉酸制劑的作用產(chǎn)生影響，所以對(duì)Pe耐藥機(jī)制的研究必須考慮低氧環(huán)境對(duì)其影響。近年來(lái)，細(xì)胞凋亡與抗癌藥物相互作用的研究越來(lái)越多，大量研究表明凋亡是化療藥物引發(fā)細(xì)胞死亡的主要方式，凋亡成為化療藥物研究和抗腫瘤研究的新焦點(diǎn)。凋亡是多方面因素控制的過(guò)程，有多個(gè)基因參與，如

Bcl

-2家族、抑癌基因

p

53等。在人類癌癥中，約有50%以上的癌癥具有抑癌基因

p

53突變，從而導(dǎo)致p53蛋白積聚并失去激活調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的靶基因的功能。低氧與p53蛋白活性之間存在相互影響的關(guān)系，并且p53蛋白與順鉑耐藥和hif-1α之間也有聯(lián)系。除此之外，

Bcl

-2家族也參與凋亡的形成和抑制。本研究用低氧培養(yǎng)箱模擬物理低氧環(huán)境，觀察常氧和低氧環(huán)境下肺癌細(xì)胞A549的增殖以及凋亡情況。結(jié)果顯示，常氧環(huán)境下，Pe對(duì)A549細(xì)胞的增殖起到抑制作用，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549凋亡。而在低氧環(huán)境下，Pe的這些作用受到抑制，說(shuō)明低氧環(huán)境減弱了Pe的抗腫瘤作用，且這可能是造成肺癌細(xì)胞對(duì)Pe耐藥的原因之一。該研究表明，常氧環(huán)境下，促凋亡蛋白Bax、p53在Pe作用下表達(dá)量升高，而抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)減少(

P

<0.05)，說(shuō)明Pe對(duì)A549細(xì)胞有促凋亡的作用；而常氧環(huán)境下在Pe作用后，抗凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)減少(

P

<0.05)，也說(shuō)明了Pe減少了A549細(xì)胞的抗凋亡作用。但是低氧加藥組p53蛋白的表達(dá)量較常氧加藥組的表達(dá)量降低，且與低氧對(duì)照組無(wú)差異，說(shuō)明低氧環(huán)境使得Pe的促凋亡作用受到了抑制。常氧和低氧環(huán)境下，加入Pe后，抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)量均減少，但是在低氧環(huán)境中，Bcl-2蛋白表達(dá)量的減少程度小于常氧環(huán)境中，說(shuō)明了在Pe作用后，低氧環(huán)境下的A549細(xì)胞的抗凋亡作用受到了抑制。這都說(shuō)明了低氧環(huán)境可能減少A549細(xì)胞對(duì)Pe的敏感性。

綜上所述，Pe對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，而低氧環(huán)境會(huì)減弱Pe對(duì)A549細(xì)胞的促凋亡作用。低氧環(huán)境對(duì)Pe的作用，很可能是通過(guò)降低其促凋亡作用來(lái)產(chǎn)生的。低氧誘導(dǎo)的凋亡抵抗可能使A549細(xì)胞對(duì)化療藥物Pe的敏感性降低。該研究只用了1種肺癌細(xì)胞A549，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，繼續(xù)對(duì)其他的肺癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，以進(jìn)一步論證低氧環(huán)境下肺癌細(xì)胞對(duì)Pe敏感性的影響。