張琳琳 范永召 顧瑞亭 劉燕中 吳昊 劉一平

1 運動與健康福建省高等學校重點實驗室，福建師范大學體育與科學學院（福州350007）2 國家體育總局運動能力評價與研究綜合重點實驗室，北京市運動機能評定與技術(shù)分析重點實驗室，首都體育學院運動與健康學院（北京100191）3 鄭州市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)行知小學（鄭州450016）

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是癡呆中常見的類型之一，是由一系列腦血管因素導致腦組織損傷而引起的智能損害綜合征[1]。血管性癡呆患者早期主要表現(xiàn)為健忘，且常常被人們所忽視，認為只是衰老過程的正常表現(xiàn)；中期主要表現(xiàn)為健忘加重、理解困難、睡眠紊亂等；晚期主要表現(xiàn)為嚴重的認知功能障礙，且活動受限，幾乎完全依賴他人，并可能伴隨著許多并發(fā)癥，如抑郁、焦慮等，這將會持續(xù)加重癡呆癥狀[2-4]?；铙w層次研究[5-6]表明血管性癡呆可引起腦部神經(jīng)元異常死亡，從而導致其認知功能下降。已有研究表明[9]通過對血管性癡呆大鼠進行白藜蘆醇藥物干預(yù)，可有效改善其認知功能，但血管性癡呆大鼠對藥物呈劑量依賴性。有文獻表明[7-8]適量的運動訓練可顯著改善血管性癡呆后的認知功能，但其內(nèi)在機制仍需進一步研究。神經(jīng)生物學研究表明：適量運動可促進血管再生和腦血液供應(yīng)，提高腦的抗氧化能力[9-10]。認知神經(jīng)科學研究亦證實：跑臺、游泳等預(yù)運動可提高神經(jīng)突觸的可塑性，改善相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)再生能力[11-12]。紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)的重要核團之一，被視為基底神經(jīng)節(jié)接收和整合信息的“門戶”，它不僅接受皮層、丘腦、黑質(zhì)等多個神經(jīng)元的投射和中間神經(jīng)元的調(diào)節(jié)，還受到許多重要的神經(jīng)遞質(zhì)或/和調(diào)質(zhì)的調(diào)控，如兒茶酚胺類物質(zhì)。這一系列信號在紋狀體處整合后，通過直接通路紋狀體黑質(zhì)神經(jīng)元和間接通路紋狀體蒼白球神經(jīng)元發(fā)出投射，最終通過2 條通路的平衡完成對運動的精確調(diào)控[13-14]?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究采用被動回避反射實驗評價大鼠的認知功能，并利用活體腦內(nèi)微透析技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)，觀察跑輪預(yù)運動對血管性癡呆大鼠紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)的影響，為運動改善血管性癡呆后認知功能的病理生理研究提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象與方法

1.1.1 實驗動物與分組

選取32 只健康3月齡雄性SD 大鼠，體重250～350 g，由北京市北京大學第三醫(yī)院實驗動物中心提供。動物實驗已通過動物倫理委員會的批準。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(C 組，n＝8)、癡呆組(VD 組，n＝8)、運動1周癡呆組(1w-Exe+VD組，n＝8)、運動4周癡呆組(4w-Exe+VD 組，n＝8)。1w-Exe+VD 組和4w-Exe+VD 組大鼠分別接受為期1 周、4 周的跑輪預(yù)運動后通過雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù)模擬血管性癡呆大鼠模型；VD組大鼠只接受雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù)模擬血管性癡呆大鼠模型；C組大鼠僅暴露雙側(cè)頸總動脈，不進行結(jié)扎處理。

1.1.2 跑輪運動

將跑輪預(yù)運動作為大鼠運動訓練的方法[15]。1w-Exe+VD 組和4w-Exe+VD 組大鼠分別在主動跑輪(美國Harvard公司)里單籠自由養(yǎng)1周和4周，并且能夠在主動跑輪上正常自由運動。跑輪正下方的電磁計數(shù)器記錄大鼠運動圈數(shù)，每天運動距離=3.14×跑輪直徑×圈數(shù)。VD組和C組大鼠則在正常鼠籠里面自由飼養(yǎng)，且無任何運動干預(yù)。

1.1.3 血管性癡呆模型的制備

采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎手術(shù)模擬血管性癡呆模型[16]。大鼠在造模前禁食12 h，禁水4 h。大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后呈仰臥位；消毒后于頸正中切口，用手術(shù)鑷鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，并使用醫(yī)用棉線進行結(jié)扎；術(shù)后縫合傷口，放回籠中飼養(yǎng)。1 周后，根據(jù)“Zea-Longa 5 分制評分法”對大鼠進行造模評判[17]：無功能性損傷為0 分；前爪不能完全伸展為1分；身體向一側(cè)轉(zhuǎn)動為2分；行走向一側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，并且喪失意識為4 分；死亡為5 分。評分標準在1～4分之間即為造模成功。

1.2 認知功能的評定

造模成功后采用被動回避反射來評價各組大鼠的認知功能。被動回避反射實驗分為訓練階段和重復訓練階段。在訓練階段，將大鼠放于左側(cè)明室中，讓大鼠在明室自由活動。120 s 之后，打開明暗室間隔，記錄大鼠從明暗室間隔打開到大鼠完全進入暗室的時間，作為“潛伏期Ⅰ”。當大鼠完全進入暗室后，關(guān)閉明暗室間隔，打開電刺激控制器，讓處于暗室中的大鼠足部受到來自底板通電柵條的電刺激，持續(xù)時間10 s。電刺激結(jié)束后，打開明暗室間隔，大鼠回到明室中。重復訓練階段，也就是初次訓練24 h 后，大鼠將被再一次放入穿梭箱內(nèi)自由活動30 s，然后緩慢打開明暗室間隔，觀察并記錄此時大鼠進入暗室的時間間隔，作為“潛伏期Ⅱ”。重復訓練階段不再給予電刺激。如果大鼠在300 s之后仍舊停留在明室一側(cè)而沒有進入暗室，說明大鼠已完全記住在初次訓練階段給予的電刺激，也就是說不存在認知功能障礙，則記錄該大鼠的“潛伏期Ⅱ”為300 s。反之，如果大鼠在300 s 之內(nèi)進入暗室，說明大鼠已忘記在初次訓練階段給予的電刺激，也就是說存在認知功能障礙，則將此時間作為大鼠的“潛伏期Ⅱ”。

1.3 紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)的測定

采用微透析-高效液相色譜法檢測紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)-多巴胺(dopamine，DA)、去甲腎上腺素(noradrenaline，NE)、腎上腺素(epinephrine，E)的含量。首先大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，采用腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)固定大鼠頭部；切開顱頂皮膚，暴露前囟點，結(jié)合大鼠腦立體定位圖譜將套管種于紋狀體腦區(qū)，坐標為：AP = 0 mm，L =－3.0 mm，V =－4.5 mm[18]。接下來，將微透析探針通過套管插入到紋狀體腦區(qū)。微透析泵將人工腦脊液經(jīng)微透析探針以2 μL / min 流速持續(xù)灌流90 min，待腦組織周圍透析液達到平衡穩(wěn)定后開始收集透析液。最后將所收集到的透析液放入高效液相色儀器的進樣器中檢測多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素物質(zhì)的含量。

1.4 免疫熒光觀察紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)目

大鼠灌流取腦后，將整個腦組織經(jīng)4% 多聚甲醛固定后放于30%的蔗糖PBS 溶液中脫水，再經(jīng)乙醇脫水和二甲苯固定后進行石蠟包埋，放入含有包埋劑的錫箔紙杯中。將腦組織采用冰凍切片機切片后，選擇一張約10μm 厚度的切片貼于Fisher 正電防脫載玻片上，65 ℃烤15～30 min，－20 ℃保存。從－20 ℃冰箱中取出切片。室溫封閉1～2 h 后將一抗神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)(稀釋倍數(shù)為1︰100)加在切片上，4 ℃孵育16～24 h[19]。將濕盒從4 ℃層析柜中拿出，切片放入裝有0.01 M PBS 的盒子中洗6 次，每次5 min。加入適量熒光二抗，室溫孵育1～2 h；將切片放入裝有0.01 M PBS的盒子中洗6次，每次5 min，抗熒光衰減封片劑封片。各組大鼠經(jīng)NeuN 免疫熒光染色后，在高倍鏡視野(× 400)顯微鏡下觀察紋狀體背側(cè)區(qū)域，并進行拍照計數(shù)。本實驗中，先利用熒光顯微鏡先找到紋狀體腦區(qū)后放大200倍，在此基礎(chǔ)上再放大200倍后觀察紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元，以保證各組觀察到的紋狀體腦區(qū)保持一致。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 5軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行整理和分析。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠主動跑輪運動

如圖1所示，運動1周癡呆組和運動4周癡呆組大鼠每天運動量分別為948.61 ± 162.61 m、878.73 ±203.65 m。與前人報道結(jié)果保持一致[20]。以上數(shù)據(jù)說明，本實驗中運動1周癡呆組和運動4周癡呆組大鼠運動干預(yù)成功。

圖1 大鼠在主動跑輪里的運動量

2.2 雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎誘導血管性癡呆模型可靠性評價

對雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎1周后大鼠的存活率進行統(tǒng)計，并根據(jù)“Zea-Longa 5 分制評分法”對本實驗中的血管性癡呆大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分(表1)后，得出：假手術(shù)組存活8 只，死亡0 只；血管性癡呆組存活6只，死亡2只；運動1周癡呆組大鼠存活8只，死亡0只；運動4周癡呆組大鼠存活7只，死亡1只。結(jié)扎1周后，假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)良好、飲水飲食正常，無神經(jīng)功能損傷特征；血管性癡呆組大鼠總體精神萎靡不振，飲水飲食減少，活動能力降低，反應(yīng)遲鈍，存在典型神經(jīng)功能缺損特征；運動1周癡呆組和運動4周癡呆組大鼠精神狀態(tài)較血管性癡呆組稍有所緩解。評分在1～4分之間即為血管性癡呆造模成功。以上數(shù)據(jù)說明本實驗中造模成功。

表1 神經(jīng)功能缺損評分

2.3 跑輪預(yù)運動對血管性癡呆大鼠認知功能的影響

如圖2所示，在初次訓練的學習階段，假手術(shù)組、癡呆組、運動1 周癡呆組、運動4 周癡呆組大鼠的潛伏期Ⅰ分別是71.33 ± 5.80 s、68.67 ± 6.34 s、72.16 ±18.70 s、70.27± 9.10 s。在重復訓練階段，假手術(shù)組、癡呆組、運動1 周癡呆組、運動4 周癡呆組大鼠的潛伏期Ⅱ分別是300 s、72.11 ± 16.70 s、300 s、300 s。本實驗結(jié)果表明：4 組大鼠潛伏期Ⅰ之間無顯著性差異(P＞0.05)；與假手術(shù)組相比，癡呆組大鼠潛伏期Ⅱ顯著降低(P＜0.001)；與癡呆組相比，運動1 周癡呆組、運動4周癡呆組大鼠潛伏期Ⅱ顯著升高(P＜0.001)；且運動1周組與運動4周組大鼠間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 4組大鼠在兩個階段的潛伏期

2.4 跑輪預(yù)運動對血管性癡呆大鼠紋狀體腦區(qū)多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素的影響

圖3顯示了4 組大鼠紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)水平變化，結(jié)果如下：與假手術(shù)組相比，癡呆組大鼠紋狀體腦區(qū)多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素的水平顯著下降(P＜0.001)；與癡呆組相比，運動1 周癡呆組、運動4 周癡呆組大鼠紋狀體腦區(qū)多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素的水平顯著升高(P＜0.01)；且運動1周組和運動4周組大鼠間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.5 跑輪預(yù)運動對血管性癡呆大鼠紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元的影響

由NeuN免疫熒光圖(圖4)可見：與假手術(shù)組相比，血管性癡呆組大鼠紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少；與血管性癡呆組相比，運動1周癡呆組和運動4周癡呆組大鼠紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯增加；且運動1 周組和運動4周組大鼠間無明顯差異。

圖4 各組大鼠紋狀體腦區(qū)NeuN免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

血管性癡呆是僅次于阿爾茲海默癥的第二大常見癡呆類型，其危害主要表現(xiàn)為認知功能障礙[21]。Bagc?等[22]通過被動回避反射實驗來評價血管性癡呆大鼠的認知功能，研究表明血管性癡呆大鼠的認知功能顯著下降。與前人研究結(jié)果一致，本實驗研究結(jié)果也表明血管性癡呆后認知功能下降。Brown 等[23]研究發(fā)現(xiàn)血管性癡呆后其認知功能下降與腦部微血管的損傷、丟失有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)血管性癡呆后認知功能下降與紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)水平下降有關(guān)。紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)中信息傳導的主要核團之一，主要接受來自皮層的大量神經(jīng)投射，直接或間接參與隨意運動的程序編制與執(zhí)行[24-25]。這表明紋狀體在對運動的調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用。不僅如此，紋狀體在運動促進認知功能方面也有著不可替代的作用。活體研究表明運動可通過調(diào)節(jié)紋狀體腦區(qū)多巴胺[26]、去甲腎上腺素[27]、腎上腺素[28]等神經(jīng)遞質(zhì)的水平，來改善該腦區(qū)的信息傳遞和認知功能。神經(jīng)病理學研究表明紋狀體兒茶酚胺類物質(zhì)異常與疾病的發(fā)生密不可分[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)血管性癡呆后紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)(多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素)水平下降。有文獻表明[31-32]紋狀體腦區(qū)去甲腎上腺水平的下降將可能與其合成場所(神經(jīng)元)的減少有關(guān)。而本實驗通過免疫組織化學實驗也證明血管性癡呆后其紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，損傷程度明顯增加。由此可見，血管性癡呆后認知功能下降可能與神經(jīng)元數(shù)目的減少導致紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)的合成減少有關(guān)。

因此，尋找到一種切實有效的方法改善血管性癡呆后的認知功能十分重要。分子學研究[33-35]表明：運動可促進腦部細胞的可塑性和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的水平，從而改善其認知功能。據(jù)文獻報道[36]：跑輪運動是一種主動的、自發(fā)的運動，可根據(jù)大鼠自身的生活習慣與特點來進行運動干預(yù)，因而對大鼠的認知功能具有更好的促進作用。Islam 系統(tǒng)總結(jié)了主動跑輪運動可從減小腦部神經(jīng)炎癥、增加神經(jīng)再生能力、提高突觸可塑性等方面來提高大鼠的認知功能[37]。此外，范永召探討了短期運動(1周主動跑輪運動干預(yù))和長期運動(4周主動跑輪運動干預(yù))對大鼠認知功能的影響[38]。盡管短期運動和長期運動均可以改善血管性癡呆大鼠的認知功能[39-40]，然而不同運動干預(yù)時間對改善血管性癡呆大鼠的認知功能的效果及相關(guān)機制是否存在差異仍需進一步探討。本研究將為期1 周和4 周的跑輪預(yù)運動作為血管性癡呆大鼠的預(yù)運動訓練方式。本研究還通過被動回避反射實驗評價大鼠認知功能，結(jié)果表明運動1 周組和運動4 周組大鼠的認知功能顯著優(yōu)于癡呆組。本研究結(jié)果表明：1周和4周的跑輪預(yù)運動均可顯著改善血管性癡呆后的認知功能。已有研究[41]表明運動可通過NF-κB/miR-503/BDNF通路改善血管性癡呆大鼠的認知功能。分子生物學研究[40-44]表明運動可通過激活多巴胺能、去甲腎上腺素能系統(tǒng)來改善認知功能。本研究從分子水平證實運動1 周組和運動4 周組大鼠紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)水平顯著高于癡呆組，表明1周和4周的跑輪預(yù)運動也可通過提高血管性癡呆后紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)含量來改善其認知功能。Hasegawa采用超高效液相色譜技術(shù)表明跑臺運動可以增加正常狀態(tài)下兒茶酚胺類物質(zhì)的含量[45]。此外，本研究從細胞水平通過免疫熒光實驗顯示，與癡呆組相比，運動1周癡呆組和運動4周癡呆組大鼠紋狀體腦區(qū)的神經(jīng)元顯著增加，表明為期4周和1周的跑輪預(yù)運動提高血管性癡呆后紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物含量，與其抑制血管性癡呆后大鼠紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元的丟失有關(guān)。李雪課題組研究表明運動可抑制腦疾病狀態(tài)下(如衰老)腦部神經(jīng)元丟失和修復神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)來改善腦功能[46]。綜上可見，為期1周和4周的跑輪預(yù)運動可通過抑制血管性癡呆大鼠紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)的丟失和神經(jīng)元數(shù)目的減少，從而改善其認知功能。

值得一提的是，為期1周和4周的主動跑輪預(yù)運動在行為學、分子水平、細胞水平均無顯著性差異，推測其可能與短期運動就可以達到兒茶酚胺類物質(zhì)變化的閾值有關(guān)。但其是否在其他方面存在顯著性差異仍需進一步深入探討。

4 結(jié)論

跑輪預(yù)運動干預(yù)通過抑制血管性癡呆大鼠紋狀體腦區(qū)兒茶酚胺類物質(zhì)的丟失和神經(jīng)元數(shù)目的減少，從而改善其認知功能。