袁瑞 李帆 胡桂霖 孫曉明 舒秋嬡 李卓群 弓浩宇 胡浩

1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部2016級(jí)侯宗濂實(shí)驗(yàn)班（西安710061）2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（西安710061）

1921年Wilder首先提出“生酮飲食”(高脂肪、低碳水化合物飲食)用以治療兒童難治性癲癇[1]。20 世紀(jì)70年代，由于這種飲食方法減少體重而被廣泛知曉，其中最為著名的就是“阿特金斯飲食法”，其控制體重的有效性已被大量研究所證實(shí)[2，3]。近些年來(lái)，生酮飲食被廣泛應(yīng)用于涉及體重級(jí)別的體育運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目(如柔道、摔跤等)，許多運(yùn)動(dòng)員希望能通過(guò)這種飲食方法在短時(shí)間內(nèi)迅速減輕體重，從而獲得更好的運(yùn)動(dòng)成績(jī)。有研究顯示[4，5]，一段時(shí)間的生酮飲食能夠改變機(jī)體利用能量的方式，從以利用碳水化合物為中心轉(zhuǎn)變?yōu)槔弥井a(chǎn)能為主，即“脂肪適應(yīng)”。但有多項(xiàng)人體干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，受試者在接受生酮飲食后出現(xiàn)體能下降、疲勞等不良癥狀[4，5]。生酮飲食作為一種特殊的飲食模式，是否會(huì)影響機(jī)體骨骼肌力量及運(yùn)動(dòng)耐力，目前仍沒(méi)有明確的研究報(bào)道。本研究分別以生酮飼料和標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)小鼠4 周，觀察并測(cè)定小鼠運(yùn)動(dòng)耐力以及腓腸肌力量，以探究生酮飲食對(duì)骨骼肌力量及運(yùn)動(dòng)耐力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性ICR小鼠20只，體重18～22 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。生酮飼料(D12358)購(gòu)于北京博泰宏達(dá)生物有限公司，標(biāo)準(zhǔn)飼料(D12450B)購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。血酮儀購(gòu)于美國(guó)雅培公司，血糖儀購(gòu)于三諾生物傳感股份有限公司，BL-420F生物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)購(gòu)于成都泰盟軟件有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

表1 生酮飼料與標(biāo)準(zhǔn)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 動(dòng)物分組及喂養(yǎng)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，小鼠隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)飲食(standard diet，SD)組和生酮飲食(ketogenic diet，KD)組，每組10 只。所有動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由飲水，每天記錄體重和進(jìn)食量。SD 組動(dòng)物自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，KD 組根據(jù)SD 組前24 h 內(nèi)進(jìn)食量的平均值給予等能量的生酮飼料，共喂養(yǎng)4周。

1.3 血糖和血酮的測(cè)定

生酮飲食4 周后，小鼠尾靜脈采血，檢測(cè)血糖、血酮水平。負(fù)重游泳前以及負(fù)重游泳后3 min 內(nèi)檢測(cè)小鼠血糖、血酮水平。

1.4 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第4 周末，小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。將均質(zhì)鐵環(huán)負(fù)于離鼠尾尖2 cm 處，有效負(fù)重為體重的10%(已扣除鐵環(huán)產(chǎn)生的浮力)。將小鼠從離水面30 cm處，頭朝下釋放入水中，水深50 cm，水槽四壁光滑，水溫控制在25℃± 1℃。觀察小鼠游泳情況，記錄小鼠從釋放到沉入水中5 s內(nèi)不能浮出水面的時(shí)間。

1.5 在體腓腸肌收縮實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物手術(shù)：動(dòng)物飼養(yǎng)4 周后，待血糖、血酮測(cè)定及負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，次日對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于手術(shù)板上，剃去后肢及軀干后背部的毛，剪開(kāi)皮膚，游離右側(cè)腓腸肌，跟腱處用手術(shù)線結(jié)扎后離斷。分離坐骨神經(jīng)并切斷脛神經(jīng)外的其他分支。將腓腸肌結(jié)扎線與張力換能器相連，并給予4 g前負(fù)荷。

單收縮和強(qiáng)直收縮最大收縮幅度：將刺激電極與坐骨神經(jīng)干接觸。選擇刺激參數(shù)：波寬0.2 ms，延遲0.05 ms，從0.2 V開(kāi)始尋找閾刺激強(qiáng)度，逐步增加刺激強(qiáng)度至引起單收縮最大幅度的最小刺激強(qiáng)度(Umin)。在2Umin(最小刺激強(qiáng)度的2倍)條件下觀察并記錄腓腸肌單收縮的最大收縮幅度。在2Umin的條件下，從30 Hz開(kāi)始連續(xù)刺激，尋找引起完全強(qiáng)直收縮的最小頻率，在最小頻率下刺激坐骨神經(jīng)，觀察并記錄肌肉完全強(qiáng)直收縮的最大收縮幅度。

連續(xù)串刺激至最大收縮幅度后下降至最大幅度50%所用時(shí)間(T50)：在2Umin的條件下，以2 Hz 的頻率給予坐骨神經(jīng)連續(xù)單刺激，觀察并記錄T50。

1.6 腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量測(cè)定

在體腓腸肌收縮實(shí)驗(yàn)后處死小鼠，取右側(cè)腓腸肌稱重。準(zhǔn)確稱取0.02 g腓腸肌肌肉組織，加入300 μL裂解液，制成組織勻漿，12000 rpm/min，4℃下離心20 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。兩組小鼠體重、血酮水平、血糖水平、負(fù)重游泳時(shí)間、腓腸肌單收縮和強(qiáng)直收縮的最大收縮幅度、腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。T50比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。負(fù)重游泳前后血糖、血酮水平比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生酮飲食對(duì)小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩組小鼠對(duì)飼料的接受程度良好，未出現(xiàn)明顯異常。小鼠體重變化趨勢(shì)如表2所示，分組喂養(yǎng)前小鼠體重?zé)o顯著性差異(t=0.438，P=0.667)，但從第3 周開(kāi)始，生酮飲食組小鼠的體重顯著低于標(biāo)準(zhǔn)飲食組(t=2.445，P=0.024＜0.05)。這提示在等能量飼養(yǎng)的情況下，生酮飲食可降低小鼠體重。

表2 兩組小鼠體重比較(g)

2.2 生酮飲食對(duì)小鼠血糖和血酮水平的影響

如表3所示，分組喂養(yǎng)4 周后，兩組小鼠的血糖水平無(wú)顯著性差異(t=0.674，P=0.509)。而生酮飲食組的血酮水平顯著高于標(biāo)準(zhǔn)飲食組(t=4.674，P=0.001＜0.05)，提示生酮飲食升高小鼠血酮水平，但對(duì)血糖水平無(wú)顯著影響。

表3 兩組小鼠血糖和血酮水平比較

2.3 生酮飲食對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

如表4所示，兩組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間無(wú)顯著差異(t=0.424，P=0.676＞0.05)，且表5顯示，兩組小鼠負(fù)重游泳前后，血糖水平均無(wú)顯著變化(標(biāo)準(zhǔn)飲食組：t=1.071，P=0.312＞0.05；生酮飲食組：t=0.897，P=0.393＞0.05)，提示生酮飲食對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力無(wú)顯著影響，運(yùn)動(dòng)前后血糖水平始終維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。標(biāo)準(zhǔn)飲食組小鼠負(fù)重游泳后血酮水平高于游泳前(t=2.631，P=0.027＜0.05)，提示標(biāo)準(zhǔn)飲食組小鼠運(yùn)動(dòng)前酮體較少參與供能，運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了酮體的生成和機(jī)體對(duì)酮體的利用；而生酮飲食組負(fù)重游泳后血酮水平無(wú)明顯變化(t=0.432，P=0.676＞0.05)，提示酮體可能在運(yùn)動(dòng)前后均為生酮飲食組小鼠的主要供能物質(zhì)。以上結(jié)果說(shuō)明生酮飲食改變了小鼠對(duì)能量物質(zhì)的利用方式或代謝方式。

表4 兩組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間比較

表5 生酮飲食對(duì)小鼠負(fù)重游泳的影響

2.4 生酮飲食對(duì)小鼠在體腓腸肌收縮的影響

如表6所示，兩組小鼠腓腸肌單收縮和強(qiáng)直收縮最大收縮幅度均無(wú)顯著差異(單收縮：t=1.999，P=0.061＞0.05；強(qiáng)直收縮：t=1.141，P=0.269＞0.05)。兩組小鼠腓腸肌連續(xù)串刺激的T50無(wú)顯著性差異(Z=I0.529，P=0.597＞0.05)，提示生酮飲食對(duì)小鼠腓腸肌收縮無(wú)顯著影響。

表6 兩組小鼠在體腓腸肌收縮幅度及T50值比較

2.5 生酮飲食對(duì)小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量的影響

由表7可知，兩組小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量均無(wú)顯著性差異(質(zhì)量：t=0.334，P=0.743；總蛋白含量：t=1.614，P=0.126＞0.05)，提示生酮飲食對(duì)小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量無(wú)顯著影響。

表7 兩組小鼠腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量比較

3 討論

生酮飲食是指低碳水化合物且脂肪相對(duì)增加的飲食。已有大量研究顯示，生酮飲食能夠在為機(jī)體提供足夠能量的前提下控制體重，因此生酮飲食在涉及體重級(jí)別的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目(如柔道、摔跤等)中可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但對(duì)于生酮飲食和運(yùn)動(dòng)之間關(guān)系的研究仍十分有限。本研究以小鼠為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)4 周的分組喂養(yǎng)后，結(jié)果顯示生酮飲食降低了小鼠體重，這與其他研究結(jié)果一致[6，7]。生酮飲食可使小鼠血液血酮水平增高，但血糖水平?jīng)]有明顯變化。這一結(jié)果提示，4周的低碳水化合物、高脂肪飲食不會(huì)對(duì)小鼠血糖造成影響，而作為供能物質(zhì)的酮體增高是生酮飲食動(dòng)物模型的主要表現(xiàn)之一[8]。酮體是脂肪酸在肝臟氧化的中間產(chǎn)物，血液酮體的變化可能會(huì)對(duì)機(jī)體能量代謝方式產(chǎn)生影響，有相關(guān)研究指出，正常飲食的小鼠運(yùn)動(dòng)后肝外組織器官對(duì)酮體的利用水平明顯低于酮體的產(chǎn)生水平，因此會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后血酮水平升高[9]。而在本研究中，標(biāo)準(zhǔn)飲食組小鼠游泳后的血酮水平顯著高于游泳前，符合運(yùn)動(dòng)后血酮水平升高的情況，而生酮飲食組小鼠游泳前后的血酮水平并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明4 周生酮飼料的喂養(yǎng)改變了生酮飲食組小鼠機(jī)體利用酮體的能力，即“脂肪適應(yīng)”。

負(fù)重游泳是評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的重要指標(biāo)[10]，在本研究中，生酮飲食組和標(biāo)準(zhǔn)飲食組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明生酮飲食對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力并無(wú)顯著影響。小鼠在體實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)串刺激誘發(fā)小鼠腓腸肌持續(xù)收縮，隨著時(shí)間的推移，肌肉疲勞會(huì)導(dǎo)致收縮幅度逐漸下降，通過(guò)比較從肌肉最大收縮幅度到降至50%最大收縮幅度所用時(shí)間(T50)，可以看出兩組小鼠的T50無(wú)明顯差異，也同樣說(shuō)明生酮飲食對(duì)小鼠肌肉耐力沒(méi)有明顯影響。在負(fù)重游泳過(guò)程中，心臟功能起著重要作用，當(dāng)心功能受損，如心衰發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞供能會(huì)以脂肪酸為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐云咸烟菫橹鱗11]，屬于心肌細(xì)胞代謝異常。研究顯示[12]，生酮飲食可改變心肌細(xì)胞能量代謝方式，維持脂肪酸供能可以更好地保護(hù)心肌細(xì)胞。單收縮與強(qiáng)直收縮幅度能夠反映骨骼肌力量的大小，而兩組小鼠腓腸肌單收縮和強(qiáng)直收縮的最大收縮幅度均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明生酮飲食對(duì)骨骼肌力量無(wú)顯著性影響。生酮飲食小鼠運(yùn)動(dòng)耐力及骨骼肌力量的相對(duì)穩(wěn)定，可能與血糖的相對(duì)穩(wěn)定以及酮體代謝利用的改變有關(guān)。有研究報(bào)道[13]，生酮飲食增強(qiáng)了小鼠脂肪的運(yùn)輸與代謝能力，其運(yùn)動(dòng)能力不會(huì)減弱。此外，生酮飲食誘導(dǎo)的酮體升高可上調(diào)骨骼肌細(xì)胞線粒體多種蛋白的表達(dá)，增加線粒體生物活性，這些均與維持運(yùn)動(dòng)能力的穩(wěn)定有關(guān)。本研究中所使用的生酮飼料蛋白含量低于普通飼料，在等能量喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，生酮飲食組小鼠的進(jìn)食量為標(biāo)準(zhǔn)飲食組小鼠的60%左右，因此生酮飲食組小鼠的蛋白攝入量遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)飲食組，但兩組小鼠的腓腸肌質(zhì)量和總蛋白含量均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明低蛋白含量的生酮飲食并不會(huì)導(dǎo)致骨骼肌質(zhì)量和總蛋白含量降低。研究顯示，大量酮體的產(chǎn)生能夠抑制糖異生，從而減少了肌肉中蛋白質(zhì)的分解[14，15]，這也是生酮飲食小鼠運(yùn)動(dòng)能力保持不變的可能原因。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：(1)為期4周的生酮飲食降低小鼠體重，升高血酮水平，該飲食模式增加了生酮飲食小鼠在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中對(duì)酮體的利用，但對(duì)血糖水平無(wú)明顯影響；(2)生酮飲食對(duì)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間、T50時(shí)間、腓腸肌單收縮和強(qiáng)直收縮最大幅度以及腓腸肌重量和蛋白含量均沒(méi)有顯著影響，該飲食模式不會(huì)影響小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力和肌肉收縮力。

本研究為生酮飲食減輕體重、保持肌肉力量與運(yùn)動(dòng)能力的飲食模式提供了參考依據(jù)，但更長(zhǎng)期的生酮飲食是否會(huì)對(duì)骨骼肌力量等方面造成影響仍有待進(jìn)一步研究。