李曉梅，楊 峰，雍曉平，陳 琳 ，冉 科 ，冉茂林

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院 水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.蔬菜種質(zhì)與品種改良四川省重點實驗室，四川 成都 610300；3.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130)

蘿卜為典型的異花授粉植物，自交衰退嚴重，其雜種優(yōu)勢明顯。利用細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)進行雜交制種是當前蘿卜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑，具有雜種一代純度高、制種成本低、親本不易流失等優(yōu)點[1-2]。1968年，日本學者小倉首次發(fā)現(xiàn)蘿卜細胞質(zhì)雄性不育類型Ogura CMS，后續(xù)又有UK-1、Kosena、NWB及DCGMS胞質(zhì)類型被發(fā)現(xiàn)[3-6]。2005年，韓國學者首次報道NWB CMS，與Ogura CMS相比該胞質(zhì)類型花藥上有約1/2無功能花粉，與來自多個國家的74份材料進行測交均未發(fā)現(xiàn)其恢復材料[5]。2008年，韓國學者從烏茲別克斯坦引進的蘿卜材料中發(fā)現(xiàn)DCGMS CMS，該胞質(zhì)類型花藥特征與NWB CMS相似，石蠟切片分析表明敗育發(fā)生在單核小孢子時期，藥室內(nèi)有未被染色的花粉粒，同時該胞質(zhì)可擴增出NWB CMS特異分子條帶，推測2種胞質(zhì)可能為同一類型[6]。張麗等[7]研究表明，NWB CMS敗育發(fā)生在單核小孢子時期，主要表現(xiàn)為絨氈層輕度液泡化，藥室內(nèi)仍有未染色的花粉粒空殼，進一步驗證NWB CMS與DCGMS CMS相似。Park等[8]通過線粒體基因組測序推測orf463為DCGMS CMS不育主控基因。隨后，Yamagishi等[9]發(fā)現(xiàn)orf463基因廣泛存在于黑蘿卜(普通蘿卜的一個變種)中，且同一黑蘿卜線粒體中DCGMS CMS線粒體結(jié)構(gòu)類型與已測序日本黑蘿卜線粒體結(jié)構(gòu)類型并存，只是不同材料2種類型的亞計量不同。Wang等[10]通過對NWB CMS線粒體基因組測序發(fā)現(xiàn)，NWB CMS與日本黑蘿卜線粒體基因組序列與結(jié)構(gòu)完全一致，與DCGMS CMS僅存在結(jié)構(gòu)上的差異，是同分異構(gòu)型，以上兩項研究從分子與基因組水平證實NWB CMS與DCGMS CMS屬于同一不育胞質(zhì)類型。

有關(guān)NWB CMS及DCGMS CMS恢復材料及恢復基因遺傳研究的報道較少且比較復雜，Lee等[6]從一份來自俄羅斯的材料(R171)及一份未知來源的材料(R121)中找到DCGMS CMS恢復基因。Kim等[11]進一步研究了R171與R121中DCGMS CMS恢復基因的遺傳規(guī)律，證實R171含2個以上基因，R121含1個基因。隨后，Cho、Lee等[12-13]分別利用蘿卜基因組與擬南芥的共線性，將Rfd1定位于擬南芥3號染色體，區(qū)間大小分別為220 kb及83 kb，但在區(qū)域內(nèi)未找到編碼PPR相關(guān)蛋白的基因，說明DCGMS CMS恢復基因可能不屬于編碼PPR相關(guān)蛋白的常見恢復基因類型。Yamagishi、Wang等[9-10]均證實DCGMS/NWB CMS恢復基因主要存在于黑蘿卜和歐洲蘿卜中，不同恢復材料，其遺傳規(guī)律不同，所含基因?qū)?shù)各異。

NWB CMS及其恢復基因相關(guān)研究主要集中在日韓，國內(nèi)有關(guān)研究極少，至今其不育主控基因orf463未被驗證，恢復基因也未被克隆。NWB CMS胞質(zhì)相對于Ogura CMS恢復材料較少，更易篩選保持系，對蘿卜雜交品種選育具有重要意義。但恢復材料較少限制了不育機制及核質(zhì)互作機理的研究，同時導致育種者難以利用花粉敗育的NWB CMS蘿卜資源。本研究通過對不同核背景下NWB CMS敗育特征及不同材料恢復基因的遺傳規(guī)律分析，可為國內(nèi)研究者對該胞質(zhì)及其恢復基因的深入研究與育種應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料A1～A4為4個穩(wěn)定的蘿卜細胞質(zhì)雄性不育系，其中A1為Ogura CMS，A2～A4為以韓國世農(nóng)種苗世農(nóng)301為不育源經(jīng)過連續(xù)6代回交轉(zhuǎn)育而成的NWB CMS不育系(世農(nóng)301經(jīng)認證為NWB CMS)；B1～B4為不育系相應保持系；R1～R5為具有NWB CMS育性恢復功能的恢復系(表1)；遺傳規(guī)律分析所用F1、F2、BC1群體為A2與R1～R5創(chuàng)制獲得。所有材料于2019年11月4日種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院水稻高粱研究所德陽市大同試驗基地，2020年4月進行育性鑒定及各項試驗。

表1 供試保持系及恢復系來源、類型及育性Tab.1 The origin，variety types and fertility of the maintainer and restorer lines used in the experiments

1.2 不同核背景NWB CMS不育系花器形態(tài)觀察

蘿卜盛花期觀察Ogura CMS(A1)與不同核背景下NWB CMS(A2～A4)花器形態(tài)，并拍照記錄。

1.3 石蠟切片

石蠟切片法觀察正?？捎牧螧1及4個細胞質(zhì)雄性不育系花粉粒的發(fā)育過程。選取不同大小花蕾，置于 FAA 固定液中(甲醛∶冰醋酸∶70% 酒精=5∶5∶90，體積比)，4 ℃過夜。參照張麗等[7]的方法對固定后花蕾進行脫水→透明→石蠟包埋→切片，貼片后用甲苯胺藍進行染色，最后于光學顯微鏡(Nikon Eclipse E100)下觀察并拍照。

1.4 電鏡掃描

取NWB CMS不育系A(chǔ)4花藥上無功能花粉與其相應保持系B4花藥上正?；ǚ?，用2.5%的戊二醛固定，參照衡雙平[14]的方法，對固定花粉進行抽真空→緩沖液洗滌→鋨酸再固定→緩沖液洗滌→乙醇梯度脫水→臨界點干燥等一系列處理。隨后，將樣品用少量導電膠固定在樣品臺上，進行樣品噴金，最后在塞維爾(谷歌)生物電鏡平臺用掃描電子顯微鏡(Hitachi SU8010)進行照相。

1.5 群體構(gòu)建與遺傳規(guī)律分析

2018年4月利用NWB CMS材料A2分別與不同恢復材料雜交獲得F1材料，2019年4月F1材料自交獲得F2群體，同時以F1為父本回交獲得BC1群體，2020年4月對F2及BC1群體進行育性鑒定，然后對育性調(diào)查結(jié)果進行χ2檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同核背景NWB CMS不育系花器形態(tài)特征分析

如圖1所示，不同核背景NWB CMS不育系雄蕊特征不同。保持系來源揚州圓白的不育系A(chǔ)2其花藥瘦小、干癟，花絲短縮，花藥上無肉眼可見花粉，雄蕊顯著低于柱頭與Ogura CMS不育系A(chǔ)1特征相似；保持系來源比梨甜的不育系A(chǔ)3花藥飽滿，花絲正常，但花藥上無可見花粉；保持系來源春不老的不育系A(chǔ)4花藥飽滿，花絲正常，花藥上有可見花粉，花粉量約為其保持系的1/3，花粉測交驗證無活性。雖然3個不同核背景下的NWB CMS不育系開花后花器形態(tài)特征明顯不同，但三者也具有共同特征，即與正?？捎暌粯樱陂_花前用手捏花蕾均有黃色液體溢出，隨著花蕾變大，A2與A3溢出的黃色液體逐漸減少，直至消失，而Ogura CMS不育系不同大小花蕾手捏均溢出白色透明液體。

2.2 NWB CMS不育系花粉敗育過程

通過石蠟切片法觀察4個細胞質(zhì)雄性不育系花粉敗育過程發(fā)現(xiàn)，NWB CMS不育系敗育時期及敗育方式與Ogura CMS不育系明顯不同，但3個花器形態(tài)差異的NWB CMS不育系敗育開始時期一致(圖2)?；ǚ勰讣毎麜r期4個不育系花藥與可育對照花藥沒有差異(圖2-A-E)。Ogura CMS不育系A(chǔ)1花藥在四分體時期開始敗育，表現(xiàn)為絨氈層細胞膨大，液泡化，而NWB CMS不育系(A2～A4)花藥與正常可育胞質(zhì)一樣(圖2-F-J)。在單核小孢子時期3個不同核背景的NWB CMS絨氈層細胞膨大明顯，開始液泡化，而Ogura CMS絨氈層液泡化加劇，嚴重擠壓小孢子生存空間，小孢子開始降解，僅有少量殘留在藥室內(nèi)(圖2-K-O)。隨著花藥發(fā)育時期的推進，正常胞質(zhì)絨氈層開始降解，釋放出可染色的成熟花粉粒。而Ogura CMS不育系的絨氈層與小孢子完全降解，形成空的藥室。3個不同核背景的NWB CMS不育系藥室差異明顯，花期花藥干癟無花粉的A2絨氈層徹底降解，藥室結(jié)構(gòu)皺縮變形，花粉粒內(nèi)含物降解，僅剩變形空殼緊緊擠在一起，呈條狀(導致無法散粉)；花期花藥飽滿無粉的A3藥室內(nèi)結(jié)構(gòu)正常，有極少量花粉?？諝じ街谒幨冶?；花期花藥飽滿有無功能花粉的A4藥室內(nèi)有大量未被染色的花粉粒空殼(圖2-P-T)，三者花藥發(fā)育后期藥室石蠟切片細胞學結(jié)構(gòu)差異，很好地解釋了其花藥形態(tài)差異形成的原因。

對NWB CMS不育系A(chǔ)4及其保持系B4上的花粉粒進行掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn)，不育系上花粉粒外壁雕紋與保持系沒有差異，但其沿花粉粒3個萌發(fā)溝凹陷呈多面體，而保持系花粉粒飽滿(圖3)，這與Lee等[6]的研究結(jié)果相似，只是因材料差異花粉粒形狀明顯不同。

2.3 恢復基因遺傳規(guī)律分析

表2 F2、BC1群體育性表現(xiàn)Tab.2 The fertile performance of F2 and BC1 genetic groups

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同核背景的NWB CMS不育系花藥敗育表型存在差異，花藥呈干癟無可見花粉、飽滿無可見花粉、飽滿有可見花粉3種形態(tài)，這與Nahm、Lee等[5-6]研究結(jié)果有差異，但有關(guān)胡蘿卜胞質(zhì)不育的研究也發(fā)現(xiàn)同一胞質(zhì)類型存在不同敗育特征[15]。大部分研究發(fā)現(xiàn),植物不育系花藥的敗育與絨氈層細胞有關(guān)，絨氈層細胞的過度生長與膨大及絨氈層細胞的提前解體均是導致不育的原因[16-19]。通過對3個不同花藥表型的NWB CMS不育系石蠟切片分析發(fā)現(xiàn)：3個不育系均在單核小孢子時期開始敗育，表現(xiàn)為絨氈層細胞開始膨大，液泡化，這與張麗等[7]的研究結(jié)果一致，但最后三者藥室內(nèi)花粉粒降解程度不同，導致花期表型差異。因此，通過形態(tài)觀察不能對不育胞質(zhì)類型進行有效分類，需要利用細胞學、分子學或線粒體基因組學等方式進行準確鑒定。

Lee等[6]篩選到2份對DCGMS CMS具有恢復功能的材料，其中1份來自俄羅斯的材料含有純合顯性恢復基因，1份未知來源的材料含有雜合恢復基因。隨后諸多研究均證實NWB CMS具有多個恢復基因，且材料來源主要集中在黑蘿卜、歐洲蘿卜與野蘿卜中[9-11，20]。本研究在3份黑蘿卜與2份歐洲蘿卜材料中找到NWB CMS恢復基因，且基因?qū)?shù)因材料而異，與前人研究結(jié)果相似。至今僅獲得DCGMS CMS恢復基因Rfd1的精細定位，初步分析其不屬于編碼PPR結(jié)構(gòu)蛋白的基因，相關(guān)基因仍未被克隆。

蘿卜中存在大量Ogura CMS恢復基因，選育Ogura CMS不育系較困難[20]，而NWB CMS恢復基因在蘿卜中分布極少，因此，NWB CMS可提高蘿卜雜交品種選育效率，且極易配制出花粉敗育的F1雜交品種，可很好保護育種者的知識產(chǎn)權(quán)。但與此同時，現(xiàn)今市場上流通的NWB CMS雜交品種均不育，恢復材料的缺乏導致此類品種的優(yōu)良性狀難以利用，長此以往將導致大量蘿卜種質(zhì)資源的丟失。后續(xù)應加強NWB CMS不育及恢復機制、恢復基因定位與克隆等理論基礎(chǔ)的研究，對蘿卜乃至整個十字花科作物的育種應用具有重要的意義。