楊倩 陳欣 張平冬 康向陽

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (林木育種國家工程實驗室(北京林業(yè)大學(xué)))

楊樹2n花粉形態(tài)判別方法的比較1)

楊倩 陳欣 張平冬 康向陽

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (林木育種國家工程實驗室(北京林業(yè)大學(xué)))

采用醋酸洋紅染色法，在研究胡楊和毛白楊不同無性系間花粉粒形態(tài)差異的基礎(chǔ)上，研究不同形態(tài)判別標(biāo)準(zhǔn)條件下2n花粉發(fā)生頻率調(diào)查的準(zhǔn)確性。研究結(jié)果表明，胡楊花粉粒的平均直徑為29.7 μm，比毛白楊花粉粒的平均直徑32.4 μm略小。胡楊或毛白楊無性系對花粉粒直徑影響顯著。通過調(diào)查四分體時期四分體、三分體以及二分體的比例，可估算2n花粉的理論頻率。胡楊和毛白楊各無性系2n花粉的理論頻率與以2n花粉粒直徑大于花粉粒平均直徑的1.28倍為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異不顯著，而與以2n花粉粒直徑大于37.0 μm為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異極顯著。這說明以37.0 μm作為判別胡楊或毛白楊2n花粉形態(tài)判別標(biāo)準(zhǔn)會導(dǎo)致較大的誤差。而以各無性系花粉粒平均直徑的1.28倍作為2n花粉形態(tài)判別標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)合理。

胡楊；毛白楊；2n花粉；形態(tài)判別；花粉粒直徑

Based on the differences of pollen grain shape among clones inPopuluseuphraticaandPopulustomentosa, we studied the accuracy of estimate in percentage of 2npollen determined under different standards. The average diameter was 32.4 μm forP.tomentosa, which was slightly larger than that ofP.euphratica(29.7 μm). Clonal effect was significant for diameter of pollen grains. The theoretical percentage of 2npollen could be estimated based on the rates of tetrad, triad and dyad at tetrad stage. However, the actual percentages of 2npollen could be achieved according to diameter from two standards of 2npollen beyond 37.0 μm and diameter of 2npollen as 1.28 times as that of normal pollen inP.euphraticaandP.tomentosa, respectively. Byχ2test, the estimate of the theoretical percentage of 2npollen agreed with the actual percentages of 2npollen that was estimated by the first standard. However, there was significant difference between the estimate of the theoretical percentage of 2npollen and the actual percentages of 2npollen that was estimated by the second standard. Therefore, the first standard for discrimination of 2npollen (37.0 μm) would result in great estimate error. It is more reasonable for taking the another standard in determining the percentage of 2npollen.

自1936年瑞典Nilsson-Ehle[1]發(fā)現(xiàn)巨型歐洲山楊被證明為天然三倍體以來，三倍體育種已成為楊樹遺傳改良的重要方法，日益受到樹木育種學(xué)家們的關(guān)注?，F(xiàn)已在歐洲山楊[2]、美洲山楊[3]、銀白楊[4]、香脂楊[5]以及毛白楊[6]等樹種中均發(fā)現(xiàn)了天然楊樹三倍體的存在。近年研究發(fā)現(xiàn)，我國廣泛栽培的‘I-214’、‘中林46’、‘沙蘭楊’、‘廊坊3號楊’、‘武黑1號’、‘遼河楊’等著名楊樹品種實際上都是來源于天然2n花粉的三倍體[7-8]。由此可見，楊樹三倍體已在我國工業(yè)用材林培育、生態(tài)環(huán)境保護(hù)等方面發(fā)揮了重要作用。

利用天然2n花粉與單倍性雌配子雜交是選育楊樹三倍體的一條重要途徑，實現(xiàn)了花粉染色體加倍帶來的倍性效應(yīng)與雜交產(chǎn)生的雜種優(yōu)勢的結(jié)合。目前，在毛白楊(P.tomentosa)[9-10]、響葉楊(P.adenopoda)[11]、通遼楊(P.mionii×P.nigra‘Tong liao’)[12]、香脂楊(P.balsamifera)[13]以及灰楊(P.canescens)[14]等楊屬樹種中都發(fā)現(xiàn)有天然未減數(shù)2n花粉的存在。由于楊樹花粉的離體萌發(fā)率低，致使花粉染色體計數(shù)困難，2n花粉的產(chǎn)生與否往往是通過測量花粉粒的直徑來判別[9]。但由于楊屬的不同派間或同一派內(nèi)的不同種間花粉粒直徑存在較大差異，致使天然2n花粉的發(fā)生頻率的統(tǒng)計存在困難，往往難以準(zhǔn)確統(tǒng)計。本研究針對這一難題，選用胡楊和毛白楊為研究對象，通過調(diào)查四分體時期四分體、三分體以及二分體的比例，估算天然2n花粉的理論頻率，與不同形態(tài)判別標(biāo)準(zhǔn)條件下實際統(tǒng)計出的2n花粉頻率進(jìn)行卡方檢驗(χ2)，篩選出楊樹天然2n花粉的形態(tài)判別方法，對于推動楊樹三倍體育種具有重要的理論與實踐意義。

1 材料與方法

胡楊雄花枝采自內(nèi)蒙古自治區(qū)額濟(jì)納旗東河烏蘭圖格地區(qū)的胡楊天然林；毛白楊雄花枝采自山東國有冠縣苗圃的毛白楊基因庫，塑料布包裹后運回北京林業(yè)大學(xué)。

將胡楊、毛白楊雄花枝移入北京林業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行水培，溫室溫度控制10～25 ℃。每隔3～4 h采集雄花芽,去除鱗片后用卡諾固定液進(jìn)行固定,利用醋酸洋紅壓片法,實時觀察小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程。待觀察到花粉母細(xì)胞發(fā)育至四分體時期，分別無性系固定4～8個雄花芽。胡楊和毛白楊花藥在冰箱中-4 ℃固定24 h后，轉(zhuǎn)移至70%的酒精中保存待用。

四分體時期四分體、三分體以及二分體比例的調(diào)查采用醋酸洋紅染色壓片法,制片參考康向陽[10]的方法:取在卡諾固定液(V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1)中固定的花芽中部小花,置于潔凈載玻片上,除去花盤,滴加1～2滴醋酸洋紅,用鑷子夾碎花藥制作涂片,蓋上蓋玻片，經(jīng)大拇指擠壓后進(jìn)行鏡檢、照相。分別不同無性系觀察550個以上的花粉母細(xì)胞，分別計算出四分體、三分體以及二分體所占的比例。依據(jù)公式E=((2×二分體數(shù)目+三分體數(shù)目)/(2×二分體數(shù)目+3×三分體數(shù)目+4×四分體數(shù)目))×100%便可以求得天然2n花粉的理論頻率。

當(dāng)雄花序發(fā)育成熟，花藥開裂后，收集胡楊和毛白楊花粉，經(jīng)醋酸洋紅染色后，在Olympus BX51光學(xué)顯微鏡下觀察，采用Olympus DP70照相系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)碼照相以及花粉粒直徑測量。每個無性系測量500個以上的花粉粒，試驗重復(fù)3次。天然2n花粉的頻率分別按以下方法統(tǒng)計：①花粉粒直徑大于37 μm的花粉視為天然2n花粉；②假設(shè)減數(shù)分裂過程中，花粉母細(xì)胞的體積不變，則四分體可以形成4個花粉粒，而二分體可以形成2個天然2n花粉粒，則可以計算出天然2n花粉粒的直徑約為正?；ǚ哿Ｖ睆降?.28倍，大于該無性系花粉粒平均直徑1.28倍的花粉?？梢暈樘烊?n花粉。天然2n花粉頻率為2n花粉占觀察花粉?？倲?shù)的百分比。

花粉粒直徑數(shù)據(jù)采用SPASS 18.0軟件包進(jìn)行方差分析和多重比較。變異系數(shù)=(標(biāo)準(zhǔn)差/平均值)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡楊花粉形態(tài)特征與天然2n花粉頻率

胡楊成熟花粉粒經(jīng)醋酸洋紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下測量花粉粒直徑，計算出各無性系花粉粒的形態(tài)特征值(見表1)。從表1可以看出，胡楊花粉粒的平均直徑為29.7 μm。不同胡楊無性系間花粉粒直徑存在一定的差異，其中以無性系HY14的花粉粒最大，其平均直徑為33.0 μm，花粉粒直徑的變化范圍介于23.2～44.5 μm，變異系數(shù)為10.6；無性系HY28的平均花粉粒最小，平均直徑僅26.5 μm，花粉粒直徑的變化范圍介于22.5～47.7 μm，變異系數(shù)為10.9%。不同無性系間花粉粒直徑的方差分析結(jié)果表明，無性系對胡楊花粉粒大小的影響達(dá)到了顯著水平。無性系HY14、HY20、HY34、HY23、HY33以及HY8的花粉粒直徑顯著大于無性系HY28、HY24以及HY25的花粉粒直徑。

表1 不同胡楊無性系的花粉形態(tài)特征值

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

一般來說，花粉母細(xì)胞進(jìn)入四分體時期后，四分體可以形成四個單倍性花粉粒；三分體形成一個2n花粉粒和兩個單倍性花粉粒；二分體形成兩個2n花粉粒。因此，根據(jù)胡楊減數(shù)分裂四分體時期四分體、三分體以及二分體的比率，可以計算出胡楊產(chǎn)生2n花粉的理論頻率(見表2)。不同胡楊無性系2n花粉的理論頻率在0.19%～3.85%之間變化。另外，分別根據(jù)花粉粒直徑大于37.0 μm與大于平均花粉粒直徑的1.28倍兩種標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計出胡楊各無性系花粉中天然2n花粉的實際頻率(見表2)。從表2可以看出，當(dāng)采用2n花粉粒直徑大于37.0 μm為標(biāo)準(zhǔn)時，胡楊各無性系的2n花粉發(fā)生的實際頻率在0～10.2%變動；當(dāng)采用2n花粉粒直徑大于花粉粒平均直徑的1.28倍為標(biāo)準(zhǔn)時，無性系的2n花粉發(fā)生的實際頻率稍小，介于0～4.37%之間?？ǚ?χ2)檢驗結(jié)果表明，胡楊各無性系2n花粉的理論頻率與以2n花粉粒直徑大于花粉粒平均直徑的1.28倍為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異不顯著，而與以2n花粉粒直徑須大于37.0 μm為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異極顯著。

表2 胡楊減數(shù)分裂四分體時期的小孢子群與天然2n花粉頻率

無性系編號小孢子群/%四分體三分體二分體2n花粉理論頻率/%2n花粉實際頻率/%>1.28倍>37.0μmHY198.000.990.990.750.990.99HY296.150.753.101.770.971.46HY697.372.250.380.761.431.91HY797.331.740.930.910.490.49HY898.271.360.370.531.793.14HY1490.793.585.633.854.3510.20HY1595.461.413.131.952.934.39HY1698.311.310.380.520.970.97HY1799.360.510.130.1900HY2093.104.562.342.363.819.50HY2396.801.231.971.314.334.81HY2497.571.401.030.870.480.48HY2595.073.201.731.694.374.37HY2798.620.770.610.500.951.90HY2898.091.140.770.670.490.97HY3198.161.270.570.6100HY3394.102.633.272.352.347.31HY3496.223.130.651.120.991.97平均值96.601.851.551.251.763.05

注：花粉粒平均直徑大于1.28倍時χ2=18.71；花粉粒直徑大于37.0 μm時χ2=80.18。

2.2 毛白楊花粉形態(tài)特征與天然2n花粉頻率

毛白楊成熟花粉粒經(jīng)醋酸洋紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下測量花粉粒直徑，計算出各無性系花粉粒的形態(tài)特征值(見表3)。從表3可以看出，毛白楊花粉粒的平均直徑為32.4 μm。不同毛白楊無性系間花粉粒直徑存在較大的差異，其中以無性系‘抱頭白’的花粉粒最大，其平均直徑為37.5 μm，花粉粒直徑的變化范圍介于21.6～51.6 μm，變異系數(shù)為13.6%；無性系3105的平均花粉粒最小，平均直徑僅29.4 μm，花粉粒直徑的變化范圍介于22.6～42.6 μm，變異系數(shù)為13.3%。不同無性系間花粉粒直徑的方差分析結(jié)果表明，無性系對毛白楊花粉粒大小的影響達(dá)到了顯著水平?！ь^白’以及無性系5088的花粉粒直徑顯著大于參試無性系的花粉粒直徑。

根據(jù)毛白楊減數(shù)分裂四分體時期四分體、三分體以及二分體的比率，可以計算出毛白楊產(chǎn)生2n花粉的理論頻率(見表4)。不同毛白楊無性系天然2n花粉的理論頻率在0～7.05%變化。與此同時，分別根據(jù)花粉粒直徑大于37.0 μm與大于平均花粉粒直徑的1.28倍兩種標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計出毛白楊各無性系花粉中天然2n花粉的實際頻率(見表4)。從表4可以，當(dāng)采用2n花粉粒直徑大于37.0 μm為標(biāo)準(zhǔn)時，胡楊各無性系的2n花粉發(fā)生的實際頻率在1.75%～56.46%之間變動；當(dāng)采用2n花粉粒直徑大于花粉粒平均直徑的1.28倍為標(biāo)準(zhǔn)時，無性系的2n花粉發(fā)生的實際頻率介于0～4.48%?？ǚ?χ2)檢驗結(jié)果表明，毛白楊各無性系2n花粉的理論頻率與以2n花粉粒直徑須大于花粉粒平均直徑的1.28倍為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異不顯著，而與以2n花粉粒直徑須大于37.0 μm為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異極顯著。

表3 不同毛白楊無性系花粉形態(tài)特征值

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

表4 毛白楊減數(shù)分裂四分體時期的小孢子群與天然2n花粉頻率

無性系編號小孢子群/%四分體三分體二分體理論2n花粉頻率/%實際2n花粉頻率/%>1.28倍>37.0μm414587.877.834.304.124.215.81310594.572.143.292.222.192.99508880.6212.426.967.056.6041.71501491.25.743.063.052.995.39501787.96.445.664.714.4818.32503996.531.611.861.361.551.755105100.0000001.97131697.271.830.390.660.7915.02‘抱頭白’95.921.582.501.671.7956.46平均值92.434.403.112.762.7316.60

注：花粉粒平均直徑大于1.28倍時χ2=0.10；花粉粒直徑大于37.0 μm時χ2=2 322.60。

3 討論與結(jié)論

天然2n花粉在植物界中普遍存在。由于2n花粉比正常單倍性花粉多一套染色體，因此判別2n花粉最為直接的方法就是進(jìn)行花粉染色體計數(shù)。但因楊樹花粉離體萌發(fā)率低的問題至今沒有解決[15]，致使通過花粉染色體計數(shù)來判別的2n花粉的發(fā)生難以實現(xiàn)。李鳳蘭等[16]借助熒光染料，對花粉細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行染色，然后通過檢測細(xì)胞內(nèi)熒光的相對強弱來判別毛白楊2n花粉。證實了毛白楊大花粉的DNA含量約為單倍性花粉的2倍。

一般來說，隨著花粉染色體數(shù)目的成倍增加，花粉粒直徑也會隨之增大，花粉粒大小與其倍性水平往往呈正相關(guān)[17]。因此，花粉粒的大小可作為判別植物多倍性花粉的重要形態(tài)學(xué)標(biāo)志[18]。植物育種學(xué)家利用這一標(biāo)志，已發(fā)現(xiàn)馬鈴薯[19]、秋海棠[20]、玫瑰[21]、毛白楊[9-10]、響葉楊[11]、通遼楊[12]以及香脂楊[13]等物種中廣泛存在天然2n花粉。Orjeda等[19]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯2n花粉直徑大約是單倍性花粉直徑的1.30倍。朱之悌等[6]曾利用37 μm作為判別毛白楊2n花粉的閾值，花粉粒直徑大于37 μm的花粉?？梢暈?n花粉。

在本研究中，作者以胡楊和毛白楊不同無性系為材料，對不同無性系間花粉粒大小以及不同判別標(biāo)準(zhǔn)條件下的2n花粉發(fā)生頻率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)胡楊花粉粒的平均直徑為29.7 μm，比毛白楊花粉粒的平均直徑32.4 μm略小，無性系對花粉粒直徑影響顯著。胡楊和毛白楊各無性系2n花粉的理論頻率與以2n花粉粒直徑須大于花粉粒平均直徑的1.28倍為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異不顯著，而與以2n花粉粒直徑大于37.0 μm為標(biāo)準(zhǔn)時統(tǒng)計的2n花粉實際頻率差異極顯著。這說明以37.0 μm作為判別胡楊或毛白楊2n花粉形態(tài)判別標(biāo)準(zhǔn)會導(dǎo)致較大的誤差。而以各無性系花粉粒平均直徑的1.28倍作為2n花粉形態(tài)判別標(biāo)準(zhǔn)更加科學(xué)合理。

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Discrimination Methods in 2nPollen inPopulus

Yang Qian, Chen Xin(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Zhang Pingdong, Kang Xiangyang(National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(2)：33-35,46.

Populuseuphratica;Populustomentosa; 2npollen; Discrimination in shape; Diameter of pollen grain

1) 國家自然科學(xué)基金項目(31370659)。

楊倩，女，1992年8月生，北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，在讀本科生。 E-mail:caoye11yq@163.com。

張平冬，林木育種國家工程實驗室(北京林業(yè)大學(xué))，副教授。E-mail:zhangpd@bjfu.edu.cn。

2014年5月15日。

S791.223

責(zé)任編輯：潘 華。