夏永軍，衣振偉，梁麗紅，趙創(chuàng)謙，湯柳茜，章 羽，楊怡琳，王光強，艾連中

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

牛樟芝(Antrodiacamphorata)作為臺灣民間傳統(tǒng)的食藥用真菌[1]，具有抗腫瘤[2]、抗癌[3]、抗炎[4]等多種活性，但由于子實體自然產(chǎn)量稀少，難以滿足市場需求，因此人工培養(yǎng)成為近年來的研究熱點。固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵和段木培養(yǎng)是目前主要的人工培養(yǎng)方式[5]。其中固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵獲得的是牛樟芝菌絲體，段木培養(yǎng)獲得的是最接近野生牛樟芝活性成分的子實體。但是段木培養(yǎng)成本高、周期長、易染雜菌[6]，不適合實驗研究及大規(guī)模生產(chǎn)。因此，固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵成為目前實驗室牛樟芝培養(yǎng)的主要方式。研究表明，從牛樟芝菌絲體內(nèi)分離出的馬來酸琥珀酸衍生物能顯著抑制丙型肝炎病毒(HCV)的活性，其中Antrodin A抑制作用最為明顯[7]。KUMAR[8]等人研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝菌絲體提取物Antroquinonol提高了肝臟抗氧化能力，可以保護肝細胞免受酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激傷害。HSIAO[9]等人發(fā)現(xiàn)牛樟芝發(fā)酵液干物質(zhì)和牛樟芝子實體水提物對CCl4誘導(dǎo)的肝臟疾病具有保肝作用。此外，牛樟芝菌絲體還可以顯著抑制急性乙醇中毒大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和膽紅素的升高，對肝臟起到保護作用，但作用機制尚不明確[10]。

乙醇體內(nèi)代謝過程中發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)會誘導(dǎo)線粒體功能障礙，肝臟脂肪變性，炎癥和纖維化[11-14]。乙醇在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的活性氧也已被證明是酒精性肝病產(chǎn)生與發(fā)展過程中的關(guān)鍵成分[15]，大量活性氧可以誘導(dǎo)自由基鏈反應(yīng)，進而誘發(fā)II型糖尿病、心腦血管疾病、癌癥等一系列重大疾病[16-18]。前期研究顯示，采用不同培養(yǎng)方式所得牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)品中活性成分差異較大[19]。其中，以青稞為基質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵，菌絲體內(nèi)活性成分種類多、含量高。主要以Antrodins和Antroquinonols類化合物為主；而常規(guī)液態(tài)發(fā)酵菌絲體內(nèi)活性成分主要為Antrodins類化合物，幾乎不含Antroquinonols 類成分[20]。目前這些化合物的功能研究主要集中在抗炎、抗癌等方面[21,22]，但針對酒精性肝損傷的保護機制研究則較少。本文利用人正常肝細胞L-O2酒精干預(yù)模型，考察牛樟芝青稞固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分對肝細胞損傷的保護作用，為進一步開發(fā)牛樟芝活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

牛樟芝A.camphorataS-29來源于上海食品生物技術(shù)研究所，菌種保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC No.9590。人正常肝細胞L-O2，購于上海細胞生物學(xué)研究所。

1.1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20 g，大豆蛋白胨5 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.5 g，檸檬酸0.5 g，調(diào)節(jié)pH至5.0；

固體發(fā)酵培養(yǎng)基(1 L錐形瓶)：青稞100 g、MgSO40.5 g、KH2PO40.5 g和大豆蛋白胨0.4 g，初始含水量70%(m/v)，初始pH 5.0，固態(tài)發(fā)酵接種量為30% (v/m)，28 ℃培養(yǎng)25 d；

1.1.3儀器與試劑

酶標儀(SpectraMax i3x，MD，奧地利)；倒置顯微鏡(DMi8，Leica，德國)；細胞培養(yǎng)箱(INC108，Memmert，德國)；中高壓制備色譜(Reveleris PREP，BUCHI，瑞士)、硅膠柱(FP Si 40 g，BUCHI，瑞士)；離心機(3-18K，Sigma德國)；色譜柱HP-C18柱(Sepax，蘇州)；噻唑藍(MTT)購于上海源葉生物科技有限公司；1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素溶液購于上海維森特生物技術(shù)有限公司；ALT、AST、MDA、SOD、GSH、總蛋白等測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1牛樟芝固態(tài)發(fā)酵原料成分制備

牛樟芝固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，將瓶內(nèi)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物打碎取出，60 ℃粉碎過篩(100目)。將過篩后粉末以10∶1(g/L)的比例加入無水乙醇，55 ℃熱水浸提60 min，每隔20 min攪拌一次，使提取更加充分。提取結(jié)束后抽濾得到乙醇提取液，旋蒸濃縮后得到牛樟芝乙醇提取物。

利用Reveleris PREP純化系統(tǒng)對提取物進行硅膠柱層析分離，流動相為A：正己烷，B：乙酸乙酯，C：甲醇，梯度洗脫程序如表1所示。色譜柱為FP Si 40 g，流速35 mL/min，檢測波長為254 nm，收集的組分利用HPLC進行成分檢測。

表1 流動相梯度洗脫比例

1.2.2L-O2細胞的培養(yǎng)

從液氮罐中取出L-O2細胞凍存管，放在37 ℃浴鍋中加熱，輕微晃動使其快速解凍。按照90%RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗的比例配制完全培養(yǎng)基，將L-O2接入完全培養(yǎng)基中置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意觀察細胞狀態(tài)，細胞貼壁生長后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.3MTT法[23]確定酒精損傷L-O2細胞濃度與時間

L-O2細胞貼壁生長至皿底80%以上時進行細胞鋪板，收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL加入96孔板中培養(yǎng)。設(shè)置模型組及對照組。每組6個復(fù)孔，每孔加入200 μL細胞懸液。對照組采用正常培養(yǎng)液，模型組分別加入含有不同濃度酒精的細胞培養(yǎng)液，酒精濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、1.2%、2.4%、3.6%、5%和10%，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h，每孔加入已配制好的MTT溶液20 μL，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。吸去舊液，每孔加入150 μL DMSO，置于振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀檢測490 nm波長下的吸光度(OD490)。

細胞存活率(%)=不同酒精處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.4牛樟芝活性成分作用濃度的確定

L-O2細胞貼壁生長至皿底80%以上時，收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL加入96孔板中。設(shè)置藥物組和對照組，每組6個復(fù)孔，每孔加入200 μL細胞懸液。鋪板結(jié)束后將96孔板放于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞貼壁生長。吸去舊培養(yǎng)液，更換新培養(yǎng)液，其中對照組采用正常培養(yǎng)液，藥物組分別加入含有不同濃度化合物的細胞培養(yǎng)液，濃度分別為2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h。化合物作用結(jié)束后，每孔加入已配制好的MTT溶液20 μL，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。吸去舊液，每孔加入150 μL DMSO，置于振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀測OD490值，計算細胞存活率。

1.2.5L-O2細胞形態(tài)學(xué)觀察

收集對數(shù)期生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL加入24孔板中培養(yǎng)。組別設(shè)為空白組、模型組及牛樟芝活性成分與酒精共培養(yǎng)組，每組4個復(fù)孔，每孔加入1 mL細胞懸液，培養(yǎng)時間為48 h，培養(yǎng)期間用倒置顯微鏡觀察各組細胞，包括細胞大小、形態(tài)及貼壁生長，有無染菌等情況，拍照記錄細胞狀態(tài)變化。

1.2.6細胞外ALT和AST的活性測定

收集對數(shù)期生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL加入24孔板中培養(yǎng)。組別設(shè)為空白組、模型組及牛樟芝活性成分與酒精共培養(yǎng)組，每組4個復(fù)孔，每孔加入1 mL細胞懸液，培養(yǎng)時間為48 h，收集細胞上清液，依據(jù)南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書測定ALT和AST的活性。

1.2.7細胞內(nèi)MDA、SOD和GSH的活性測定

收集對數(shù)期生長期細胞，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL加入24孔板中培養(yǎng)。組別設(shè)為空白組、模型組及牛樟芝活性成分與酒精共培養(yǎng)組，每組4個復(fù)孔，每孔加入1 mL細胞懸液，培養(yǎng)時間為48 h，收集細胞，依據(jù)南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書測定MDA、SOD和GSH的活性。

1.2.8牛樟芝活性成分HPLC分析

色譜柱為Sepax HP-C18柱，4.6 mm×250 mm(5 μm)，梯度洗脫程序如表2所示，流速1 mL/min，進樣方式為自動，進樣量20 μL，紫外檢測波長254 nm。

表2 HPLC分析洗脫條件

1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)表示為均值±標準偏差，每組6個樣品。使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(ANOVA)及Tukey檢驗分析組間差異(p<0.05時具有顯著差異，p<0.01時具有極顯著差異)。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵成分HPLC分析

使用高效液相色譜鑒定分析硅膠柱層析收集的10組樣品。如圖1所示，牛樟芝固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中活性成分種類數(shù)量存在較大差異，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中含有更為豐富的活性成分。將各組樣品保留時間與前期從牛樟芝菌絲體中分離鑒定的馬來酸琥珀酸衍生物和泛醌類化合物的保留時間進行比對，最終確定Antroquinonol B(AqB)、Antrodin C(AdC)、Antrodin A(AdA)和Antroquinonol(Aq)這4種活性物質(zhì)(圖2)。

圖1 牛樟芝發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖譜

圖2 純化制備的4種牛樟芝活性成分HPLC分析

2.2 人正常肝細胞L-O2酒精損傷模型的建立

如表3所示，當各組培養(yǎng)時間相同時，隨著細胞培養(yǎng)液中酒精濃度的升高，L-O2細胞活力逐漸降低，表明L-O2細胞存活率與酒精濃度呈負相關(guān)；當酒精濃度相同時，培養(yǎng)48 h的L-O2細胞的存活率要低于培養(yǎng)24 h的細胞，表明酒精長時間處理對細胞活性有抑制作用，而細胞存活率也隨培養(yǎng)時間的增加而降低。根據(jù)細胞存活率半數(shù)或者接近半數(shù)為條件造模[23]，從表3可知，當酒精濃度為5%、處理48 h時，L-O2細胞活性為55.47%，接近半數(shù)。結(jié)合培養(yǎng)期間L-O2細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察，確定造模條件為乙醇濃度5%，處理48 h。

表3 不同濃度酒精處理24 h和48 h后的L-O2細胞活力

2.3 牛樟芝活性成分作用濃度確定

如表4和表5所示，隨著細胞培養(yǎng)液中牛樟芝活性物質(zhì)濃度的升高，L-O2細胞活力逐漸降低。當活性物質(zhì)的濃度小于或等于10 μg/mL時，細胞存活率與Control組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。當活性物質(zhì)的濃度大于或等于15 μg/mL時，細胞存活率與Control組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，對L-O2細胞產(chǎn)生毒性，因此選擇10 μg/mL作為誘導(dǎo)濃度。

表4 不同濃度Antroquinonol B和Antrodin C對L-O2細胞活性的影響

表5 不同濃度Antrodin A和Antroquinonol對L-O2細胞活性的影響

2.4 L-O2細胞形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)的變化可直接反映細胞狀態(tài)及受損情況。酒精誘導(dǎo)可引起細胞形態(tài)改變，原本貼壁生長的細胞會發(fā)生漂浮，甚至死亡[24]。如圖3所示，在倒置顯微鏡觀察下，正常組(NC)L-O2細胞輪廓清晰，排列緊密，形態(tài)相似，呈抱團生長趨勢，狀態(tài)良好。乙醇處理組(AL)組L-O2細胞因受酒精誘導(dǎo)刺激，出現(xiàn)細胞收縮，變亮變圓，部分細胞離壁飄起，導(dǎo)致細胞狀態(tài)較差，活力降低。從兩組細胞形態(tài)對比可直觀看出濃度5%的乙醇對正常L-O2細胞造成明顯損害。在活性物質(zhì)與酒精聯(lián)合培養(yǎng)的四組當中，AqB組和AdC組與AL組類似，部分細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)收縮變圓，貼壁性降低；AdA組和Aq組則僅少部分細胞發(fā)生形態(tài)變化，大多數(shù)細胞仍排列緊密抱團生長，細胞狀態(tài)好于AL組。

因此，通過細胞形態(tài)觀察，可以初步判定：經(jīng)AdA和Aq干預(yù)后，細胞受損量降低。但各活性物質(zhì)對酒精性肝細胞損傷的保護作用還需進一步通過檢測細胞培養(yǎng)液內(nèi)肝損傷標志酶活性和細胞內(nèi)抗氧化酶活性來進行分析。

2.5 細胞外ALT和AST的活性

肝細胞損傷后，即使細胞內(nèi)少量ALT和AST酶進入血中，也會導(dǎo)致血清中這兩種酶的活性明顯升高，因此ALT和AST是肝細胞損傷的標志酶[25]。通過檢測細胞培養(yǎng)液中ALT和AST酶的活性，可以確定L-O2細胞損傷情況。

如圖4所示，與對照組NC相比，AL組的ALT和AST酶活性顯著升高(p<0.05)，說明酒精誘導(dǎo)造成L-O2細胞損傷。

NC：未經(jīng)任何處理，作為對照組；AL(Alcohol)：酒精處理48 h圖3 牛樟芝活性物質(zhì)對酒精誘導(dǎo)的L-O2細胞損傷的影響

(a) 4種活性成分與酒精聯(lián)合培養(yǎng)48 h后細胞培養(yǎng)液中ALT酶活性；(b) 4種活性成分與酒精聯(lián)合培養(yǎng)48 h后細胞培養(yǎng)液中AST酶活性圖4 4種牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的生物活性成分對ALT和AST酶活性水平的影響

AdA和Aq組細胞培養(yǎng)液中兩酶活性與AL組相比明顯降低(p<0.05),其中，Aq組的酶活水平與對照組NC無顯著差異(p>0.05);然而，AqB和AdC組兩酶活性水平與AL組比較，并無統(tǒng)計學(xué)意義上的差異(p>0.05)。從比較結(jié)果可以看出，AdA和Aq在抵抗酒精性肝細胞損傷方面的效果優(yōu)于AqB和AdC。

2.6 細胞內(nèi)MDA、SOD和GSH的活性

酒精代謝過程中會誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞死亡或凋亡[26,27]。通過檢測細胞內(nèi)MDA、SOD和GSH的含量，可以確定L-O2細胞抗氧化能力[28]。如圖5所示，與NC組相比，AL組細胞中SOD和GSH的含量分別降低了28.9%和60.8%，且兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)，說明酒精誘導(dǎo)造成細胞抗氧化能力受損。與AL組相比，4種不同活性成分與酒精聯(lián)合培養(yǎng)48 h后，SOD和GSH含量均出現(xiàn)了不同程度的升高。與AL組相比，AdA組、AdC組和Aq組細胞中GSH的含量分別升高了89.5%、49.3%和40.3%。AdA組和Aq組細胞中SOD的含量升高了26.5%和23.4%；AqB組組雖有升高的趨勢，但與AL組相比并無顯著性差異(p>0.05)。因此，AdA和Aq能夠通過提高肝細胞抗氧化能力的方式緩解酒精性損傷。

此外，AL組細胞中MDA的含量較NC組顯著升高，說明酒精誘導(dǎo)引起L-O2細胞脂質(zhì)過氧化程度增加[29]。與AL組相比，4種活性成分與酒精聯(lián)合培養(yǎng)48 h后，細胞中MDA含量出現(xiàn)不同程度的降低。與AL組相比，AdA組、AdC組和Aq組細胞中MDA的含量顯著降低(分別為40.5%、24.3%和43.2%)；AqB組的MDA含量水平與AL組相比無顯著性差異(p>0.05)。通過培養(yǎng)期間細胞形態(tài)觀察，以及培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液中和肝細胞內(nèi)各生理指標的檢測進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)AdA和Aq在抵抗酒精性肝細胞損傷，提高細胞抗氧化能力方面的效果要明顯優(yōu)于AqB和AdC。這兩種生物活性成分可用于后續(xù)動物實驗驗證及抗酒精性肝損傷機制研究。

(a) MDA含量；(b) SOD含量；(c) GSH含量圖5 4種牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的生物活性成分對肝細胞內(nèi)MDA、SOD和GSH含量的影響

3 結(jié)論

本文從牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中成功分離獲取了4種活性成分：Antroquinonol B(AqB)、Antrodin C(AdC)、Antrodin A(AdA)和Antroquinonol(Aq)。對這4種活性成分進行了抗酒精性肝細胞損傷活性評價。結(jié)果表明，當酒精造模條件為：酒精濃度為5%、處理48 h，L-O2細胞活性為55.47%。MTT法評價顯示，當活性物質(zhì)的濃度大于或等于15 μg/mL時，細胞存活率與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。酒精誘導(dǎo)會對L-O2細胞產(chǎn)生毒性。通過細胞胞內(nèi)酶活性水平及相關(guān)指標測定，結(jié)合肝細胞形態(tài)學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)AdA和Aq在抵抗酒精性肝細胞損傷方面的效果要優(yōu)于AqB和AdC，二者能夠顯著提升肝細胞抗氧化能力，減少酒精性肝損傷。