張曉宇，王 慧，楊昳津，熊智強(qiáng)，夏永軍，王光強(qiáng)，艾連中，宋 馨

上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

唾液乳桿菌(L.salivarius)是美國FDA認(rèn)證的GRAS(generally recognized as safe)微生物，存在于人的口腔、腸道、陰道、糞便，以及部分動物(如雞、豬等)的腸道內(nèi)[1-3]。作為益生菌，唾液乳桿菌耐酸、耐膽鹽、高產(chǎn)胞外多糖，對腸道上皮細(xì)胞有較強(qiáng)粘附作用，能促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的形成，增強(qiáng)腸道屏障功能[4-8]。唾液乳桿菌還對宿主健康具有重要意義。通過產(chǎn)生類細(xì)菌素，可抑制金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的咽炎損傷，避免食源性致病菌單增李斯特菌的感染等；通過拮抗作用可抑制致病菌在腸道內(nèi)定殖，降低幽門螺桿菌活性,減少胃炎發(fā)生[9-12]。

目前的研究大多針對唾液乳桿菌的分離鑒定及益生特性，通過分子生物學(xué)解析其代謝物和代謝途徑的研究相對較少，這在一定程度上限制了唾液乳桿菌的開發(fā)利用，其主要原因是缺乏遺傳操作工具。唾液乳桿菌為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁厚，這導(dǎo)致外源DNA轉(zhuǎn)入唾液乳桿菌的效率較低[13]。為便于從基因水平對唾液乳桿菌進(jìn)行研究，需要對其電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化。

本研究使用單因素法，分別從細(xì)菌的培養(yǎng)狀態(tài)，甘氨酸濃度、蔗糖濃度，電壓及復(fù)蘇時間等方面對唾液乳桿菌的電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行優(yōu)化，從而提高唾液乳桿菌的電轉(zhuǎn)化效率，為唾液乳桿菌基因工程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

唾液乳桿菌(LactobacillussalivariusAR612)由本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

pNZ44質(zhì)粒(乳桿菌穿梭質(zhì)粒)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2培養(yǎng)基和緩沖液

MRS培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白胨 10、牛肉浸出粉 10、酵母浸粉5、葡萄糖 20、磷酸氫二鉀 2、檸檬酸氫二銨 2、三水乙酸鈉 8.3、七水硫酸鎂 0.58、一水硫酸錳 0.25、吐溫-80 1，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20。

SGMRS培養(yǎng)基：含10 g/L甘氨酸和0.3 mol/L蔗糖的MRS培養(yǎng)基。

復(fù)蘇培養(yǎng)基：含MgCl220 mmol/L和CaCl22 mmol/L的MRS培養(yǎng)基。

緩沖液Ⅰ：蔗糖0.3 mol/L、MgCl21 mmol/L、KH2PO45 mmol/L。

緩沖液Ⅱ：蔗糖0.3 mol/L、MgCl21 mmol/L、KH2PO45 mmol/L、150 mL/L甘油。以上緩沖液均用去離子水配置。

1.1.3儀器與試劑

質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen公司)；電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad公司)；超微量分光光度計(NanoDrop 2000c，Thermo Scientific公司)；電轉(zhuǎn)儀(MicroPulser，Bio-Rad公司)；生化培養(yǎng)箱(美藍(lán)飄爾(上海)過濾設(shè)備有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-2600，尤尼柯(上海)儀器有限公司)；分析天平(ML104/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電子天平(G2202L-1SCN，賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司)；冷凍離心機(jī)(3-18K，Sigma公司)；離心機(jī)(1-14，Sigma公司)；全自動生長曲線分析儀(Bioscreen C，Bioscreen公司)。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒提取

pNZ44質(zhì)粒提取按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用超微量分光光度計測定質(zhì)粒濃度。

1.2.2菌種活化及生長曲線繪制

唾液乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)?；罨蟮木喊?%接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h，使用生長曲線分析儀測定并繪制生長曲線。

1.2.3唾液乳桿菌感受態(tài)制備

唾液乳桿菌挑取單菌落接入MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。按1%接種量接入50 mL SGMRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)一定時間后將菌液移入預(yù)冷的50 mL離心管，4 ℃ 6 000 g，離心10 min，收集菌體，棄上清。緩沖液Ⅰ洗滌菌體，4 ℃，6 000 g，離心10 min，棄上清。該步驟重復(fù)2次。用1 mL緩沖液Ⅱ重懸菌體，按每管100 μL分裝至1.5 mL EP管，-80 ℃凍存。

接種于SGMRS培養(yǎng)基的菌液分別培養(yǎng)至OD600為 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5時，按上述方法制備唾液乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞。SGMRS培養(yǎng)基中，甘氨酸濃度分別為0 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L和30 g/L時，以及蔗糖濃度分別為0 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L和0.5 mol/L時，分別按上述方法制備感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4唾液乳桿菌電轉(zhuǎn)化

唾液乳桿菌的電轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)方法并作適當(dāng)修改[14]。具體如下：從-80 ℃箱中取出唾液乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍，100 ng pNZ44質(zhì)粒與100 μL 感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，輕敲電轉(zhuǎn)杯，確?；旌衔镞M(jìn)入電轉(zhuǎn)杯底部。設(shè)定電壓為7.5 kV/cm，電擊后迅速加入900 μL復(fù)蘇培養(yǎng)基，于37 ℃復(fù)蘇，取適量復(fù)蘇后菌液涂布于抗性平板上。37 ℃靜置培養(yǎng)2 d后菌落計數(shù)。

不同生長狀態(tài)時制備的感受態(tài)細(xì)胞，按上述方法與質(zhì)粒pNZ44混合，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。在電轉(zhuǎn)化效率最高的生長狀態(tài)下，分別對采取不同甘氨酸及蔗糖濃度的SGMRS所培養(yǎng)的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。

選擇電轉(zhuǎn)效率最高的細(xì)胞狀態(tài)、以及相應(yīng)的SGMRS培養(yǎng)基中甘氨酸和蔗糖濃度來制備感受態(tài)細(xì)胞。按照上述方法，分別在電壓7.5 kV/cm、10 kV/cm和12.5 kV/cm時將pNZ44質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞。之后選擇轉(zhuǎn)化效率最高的電壓進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，分別復(fù)蘇1 h、2 h、3 h和4 h后涂布于抗性平板，計算電轉(zhuǎn)效率。

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。按照下面的公式計算電轉(zhuǎn)化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)對電轉(zhuǎn)效率的影響

唾液乳桿菌(LactobacillussalivariusAR612)的生長曲線見圖1。培養(yǎng)狀態(tài)對電轉(zhuǎn)化效率的影響見圖2。唾液乳桿菌生長至OD600為0.1時，電轉(zhuǎn)效率最高，為6.29×107CFU/μg DNA。隨著OD600值升高，電轉(zhuǎn)效率逐漸降低。OD6000.3時，電轉(zhuǎn)化效率為2.33×105CFU/μg DNA，與OD6000.1相比，降低了2個數(shù)量級。

圖1 唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius AR612)的生長曲線

圖2 唾液乳桿菌培養(yǎng)狀態(tài)對電轉(zhuǎn)效率的影響

現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的唾液乳桿菌感受態(tài)制備OD600通常為0.3～0.6[15-17]。洛雪等[18]制備嗜熱鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞時，細(xì)菌生長至穩(wěn)定期，即OD6000.8時電轉(zhuǎn)效率最高。在乳酸菌感受態(tài)制備的方法中，很少有使用生長至OD6000.1的細(xì)胞制備感受態(tài)。乳酸菌胞外多糖一般大量產(chǎn)生于穩(wěn)定期[19]。LIU C T等[4]研究表明，唾液乳桿菌的胞外多糖產(chǎn)量在13株乳桿菌中最高，胞外多糖可能限制了外源分子進(jìn)入細(xì)胞。本文研究的唾液乳桿菌生長至OD6000.1時，為對數(shù)生長初期，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，胞外多糖產(chǎn)量較低，更利于外源分子轉(zhuǎn)入；細(xì)胞活力較高，經(jīng)過電擊后也更容易存活[20]。

2.2 甘氨酸濃度對電轉(zhuǎn)效率的影響

革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖。甘氨酸是細(xì)菌感受態(tài)制備最常用的細(xì)胞弱化劑，能取代細(xì)胞壁肽鏈上的L-丙氨酸和D-丙氨酸，影響N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸組成的雙糖單位、短肽鏈和肽橋組成的肽聚糖的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞合成過程中形成較為松散的肽聚糖層，起到弱化細(xì)胞壁的作用，利于外源DNA的轉(zhuǎn)入[21,22]。但過高的甘氨酸濃度會抑制細(xì)菌生長[23]。

甘氨酸濃度對唾液乳桿菌電轉(zhuǎn)化效率的影響見圖3。當(dāng)甘氨酸濃度從0增加到5 g/L，電轉(zhuǎn)效率略有降低，這可能是因?yàn)楦拾彼釢舛仍龈邔晟L造成抑制。當(dāng)甘氨酸濃度增加到10 g/L，電轉(zhuǎn)效率最高，達(dá)到6.74×107CFU/μg DNA，此時甘氨酸對電轉(zhuǎn)效率的增強(qiáng)作用超過了對細(xì)菌生長的抑制作用。隨著甘氨酸濃度繼續(xù)增加，電轉(zhuǎn)化效率降低。

圖3 甘氨酸濃度對電轉(zhuǎn)效率的影響

2.3 蔗糖濃度對電轉(zhuǎn)效率的影響

蔗糖是滲透穩(wěn)定劑，電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中加入蔗糖可顯著提高轉(zhuǎn)化效率[24]。研究表明，這可能是因?yàn)檎崽谴嬖诰徑饬烁拾彼嵋鸬募?xì)胞裂解[25]。蔗糖濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響見圖4。隨著蔗糖濃度增加，電轉(zhuǎn)化效率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)蔗糖濃度為0.3 mol/L時，電轉(zhuǎn)效率最高，為1.59×108CFU/μg DNA。

圖4 蔗糖對電轉(zhuǎn)效率的影響

2.4 電壓對電轉(zhuǎn)效率的影響

電轉(zhuǎn)化是在電壓的作用下，使細(xì)胞膜上的電荷分離，產(chǎn)生高強(qiáng)度的跨膜電位差，電位差超過臨界水平時，細(xì)胞膜表面形成暫時的孔道，外源分子得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[20]。電壓過低，細(xì)胞膜上難以形成足夠大小的孔洞，外源分子難以轉(zhuǎn)入；提高電壓，細(xì)胞膜上產(chǎn)生的孔洞增多，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，外源分子更易進(jìn)入細(xì)胞；但電壓過大超過細(xì)胞承受能力時，會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[26]。

電壓對電轉(zhuǎn)化效率的影響見圖5。當(dāng)電壓在7.5至10 kV/cm范圍時，可獲得較高的電轉(zhuǎn)化效率(2.11～2.12×107CFU/μg DNA)。由于考慮到電壓提高會對細(xì)胞造成損傷，因此選擇電壓為7.5kV/cm-1進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 電壓對電轉(zhuǎn)效率的影響

2.5 復(fù)蘇時間對電轉(zhuǎn)效率的影響

感受態(tài)細(xì)胞電擊后，在不含抗生素的復(fù)蘇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，有利于細(xì)胞恢復(fù)活性[27]。若復(fù)蘇時間較短，細(xì)胞膜上由于電擊產(chǎn)生的孔洞來不及閉合，影響細(xì)胞正常生長；復(fù)蘇時間過長，缺少抗性選擇壓力，容易造成質(zhì)粒丟失[28]。復(fù)蘇時間對電轉(zhuǎn)化效率的影響見圖6。隨著復(fù)蘇時間增加，電轉(zhuǎn)化效率逐漸增大，3 h后電轉(zhuǎn)效率的增長幅度趨于平緩。為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間，選擇復(fù)蘇時間為3 h。

圖6 復(fù)蘇時間對電轉(zhuǎn)效率的影響

3 總結(jié)與討論

唾液乳桿菌作為可食用益生菌，對人體健康具有重要意義。由于其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，尚無高效的外源基因?qū)敕椒?，制約了該菌株在功能基因、益生機(jī)制等方面的基礎(chǔ)研究。采用電轉(zhuǎn)化方法，可以較高轉(zhuǎn)化效率使外源DNA穩(wěn)定的轉(zhuǎn)入唾液乳桿菌細(xì)胞中，這是對其進(jìn)行遺傳操作的基礎(chǔ)。

影響乳酸菌電轉(zhuǎn)化效率的因素比較復(fù)雜，如菌體的培養(yǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)基成分、緩沖液成分、電壓、復(fù)蘇時間、質(zhì)粒濃度等。本文優(yōu)化了一株唾液乳桿菌L.salivariusAR612的電轉(zhuǎn)化參數(shù)，確保外源質(zhì)粒能高效轉(zhuǎn)入細(xì)胞，滿足了后續(xù)遺傳操作的需要。試驗(yàn)確定唾液乳桿菌的最佳電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：OD6000.1，甘氨酸濃度10 g/L，蔗糖濃度0.3 mol/L，電壓7.5kV/cm，復(fù)蘇時間3 h。在該條件下，唾液乳桿菌AR612的電轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)1.16×108CFU/μg DNA。與優(yōu)化前相比，轉(zhuǎn)化效率提高了3個數(shù)量級。其中細(xì)菌生長狀態(tài)和電壓對電轉(zhuǎn)化效率的影響遠(yuǎn)大于甘氨酸濃度、蔗糖濃度和復(fù)蘇時間。據(jù)文獻(xiàn)中已報道的唾液乳桿菌電轉(zhuǎn)化效率，最高為103～105CFU/μg DNA[29]，本文優(yōu)化后的方法在效率上更具優(yōu)勢。

質(zhì)粒濃度也會影響乳酸菌電轉(zhuǎn)化效率。在一定濃度范圍內(nèi)，電轉(zhuǎn)化效率隨質(zhì)粒濃度提高而提高，超過一定范圍后，轉(zhuǎn)化效率出現(xiàn)不同程度的降低[23,30-32]。但本研究所用唾液乳桿菌AR612，質(zhì)粒濃度從10 ng增加至1 μg，轉(zhuǎn)化效率未見差異。前人研究結(jié)果也顯示，質(zhì)粒濃度在一定范圍內(nèi)，質(zhì)粒濃度對電轉(zhuǎn)化效率影響不大[33,34]，這與本文的發(fā)現(xiàn)一致。

乳酸菌具有較強(qiáng)的菌株特異性，不同乳酸菌的最佳電轉(zhuǎn)化方法存在差異。將本文優(yōu)化所得參數(shù)用于實(shí)驗(yàn)室保藏的另一株唾液乳桿菌AR809，電轉(zhuǎn)化效率可提高至102～103CFU/μg DNA，但與本研究所用的唾液乳桿菌AR612相比，轉(zhuǎn)化效率存在明顯差異。唾液乳桿菌AR809的胞外多糖產(chǎn)量高于AR612，這可能是限制AR809轉(zhuǎn)化效率的主要原因之一。通過比較基因組雜交方法證明唾液乳桿菌具有較高的基因多樣性。與對照基因組相比，高達(dá)23.6%的基因是可變的[35]。此外，研究還顯示某些乳酸菌中存在限制性修飾機(jī)制，該機(jī)制相當(dāng)于原核生物的免疫系統(tǒng)，可抵御外源DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，從而降低了電轉(zhuǎn)化效率[36]。另有研究者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入植物乳桿菌時，無法穩(wěn)定獲得轉(zhuǎn)化子，但通過植物乳桿菌的無細(xì)胞提取物對質(zhì)粒DNA進(jìn)行體外修飾后，可成功繞過限制性修飾機(jī)制，將轉(zhuǎn)化效率提高至5.8×105CFU/μg DNA[37]。綜上所述，乳酸菌的電轉(zhuǎn)化仍需具體問題具體分析，針對特定菌株找出最有效的轉(zhuǎn)化方法。