楊肖杰,黃卉,李來(lái)好,楊賢慶,趙永強(qiáng),岑劍偉,郝淑賢*
1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306) 2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東 廣州,510300)
南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)富含蛋白質(zhì)、纖維素、礦物質(zhì)元素、維生素和多種對(duì)人體有益的氨基酸,肉質(zhì)鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,深受廣大消費(fèi)者喜愛[1-2]。去殼蝦仁是蝦加工的主要產(chǎn)品,但外殼通過(guò)表皮內(nèi)纖維緊密地附著在表皮上,同時(shí)表皮內(nèi)纖維通過(guò)微管相互交叉牢固地連接在肌肉上[3],使得鮮蝦殼難以剝離。因此,剝殼前需進(jìn)行預(yù)處理使殼肉間的緊密連接松動(dòng)。常用的殼肉松動(dòng)方法是速凍后進(jìn)行解凍再剝殼或采用超高壓技術(shù),但都易造成蝦仁品質(zhì)劣變,限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[4]。
近年來(lái),常用酶解蝦殼或蝦頭來(lái)回收蛋白質(zhì),或得到富含多肽的酶解產(chǎn)物[5-7]。羅春燕等[8]通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了魷魚須胰酶脫皮的工藝參數(shù),得到的樣品白度值較好,原料保留率高,且質(zhì)構(gòu)特性與肌纖維組織均無(wú)顯著變化;DANG等[10]報(bào)道了Endocut-03L和Exocut-A0復(fù)合蛋白酶促進(jìn)凍蝦(Pandalusborealis)剝殼的效果,蝦殼和表皮的大分子蛋白質(zhì)降解破壞殼肉連接,是酶法便捷剝殼的主要原因[11]。但關(guān)于酶法預(yù)處理促進(jìn)鮮蝦便捷剝殼的研究及其對(duì)蝦肉品質(zhì)的影響則鮮有報(bào)道。本研究以鮮活南美白對(duì)蝦為原料,基于質(zhì)構(gòu)儀以剝殼單位功為響應(yīng)值,優(yōu)化酶促剝殼的工藝參數(shù);并探討酶法前處理對(duì)蝦仁品質(zhì)的影響,為機(jī)械剝殼的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)支持。
鮮活南美白對(duì)蝦,于2019年8~10月購(gòu)于廣州超市,蝦體規(guī)格長(zhǎng)11~13 cm,20 min內(nèi)運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。固定液:4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.3)、中性蛋白酶(≥200 U/mg)、堿性蛋白酶(≥200 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(≥15 U/mg)和動(dòng)物蛋白水解酶(≥90 U/mg),博美生物技術(shù)有限公司;中性蛋白酶活性測(cè)定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;NaCl為食品級(jí),其他試劑均為分析純。
QTS-25質(zhì)構(gòu)儀,英國(guó)CNS FARNEL有限公司;IKA-T25組織勻漿機(jī),德國(guó)IKA公司;CR-400色差計(jì),日本KONICA MINOLTA公司;3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Sigma公司;Sunrise-basic吸光酶標(biāo)儀,德國(guó) TECAN 公司;BX53顯微鏡,日本OLYMPUS。
1.3.1 樣品的處理
鮮蝦洗凈,加冰猝死,去除蝦頭、蝦足,放入自封袋備用[9]。酶處理過(guò)程如下:以20 g/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽水溶液配制不同質(zhì)量濃度的酶溶液,取酶液倒入燒杯中,放入12只蝦(3節(jié)蝦身),約(50±5)g,完全浸沒。為保證酶液的均勻分布和蝦肉品質(zhì),以280 r/min的速度攪拌,酶液的溫度為(5±2) ℃,直至剝殼。取出樣品,濾去多余的水分,稱重并記錄質(zhì)量(m)。一批置于-20 ℃冰箱中冷凍24 h,流水解凍后剝殼。以冷凍24 h后脫殼的蝦仁和新鮮蝦仁為對(duì)照,對(duì)酶促剝殼的蝦肉品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1.3.2 剝殼效果測(cè)定
參考YANG等[11]的方法,如圖1所示用質(zhì)構(gòu)儀分析蝦體剝殼效果。將頂部探針穿過(guò)蝦體背部殼肉之間(圖1-b),底部基座上的針插入蝦身肌肉中間(圖1-c),進(jìn)行張力測(cè)試,同時(shí)將殼從蝦體剝離(圖1-d),測(cè)定條件:測(cè)試速度 2.5 mm/s;目標(biāo)距離 60 mm;觸發(fā)力5.0 g。剝殼后,分為完全剝殼的蝦(蝦殼完全剝掉)和未完全剝殼的蝦(蝦殼沒有剝掉或有部分破碎蝦殼粘連在肉上),只有完全剝殼的蝦用于計(jì)算蝦的剝殼用功,記為剝殼單位功(mJ/g,下同)。
圖1 剝殼方法及過(guò)程Fig.1 The method and procession of shrimp peeling
1.3.3 蛋白酶的篩選
選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和動(dòng)物蛋白水解酶,為保證酶液的作用活性一致,酶添加量分別為0.500、0.500、6.667、1.111 g/500 mL,自然pH值,樣品與酶液之比為1∶10(g∶mL),酶液的溫度為(5±2) ℃,酶解時(shí)間2 h。對(duì)照處理采用20 g/L標(biāo)準(zhǔn)鹽水浸泡。
1.3.4 單因素試驗(yàn)
在酶處理溫度(5±2) ℃,自然pH下,分別研究不同質(zhì)量濃度的酶液(0.25、0.5、0.75和1.00 mg/mL)、酶解時(shí)間(1、2、3、4和5 h)和料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12,g∶mL)對(duì)蝦體剝殼單位功的影響。
1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取酶解時(shí)間(A)、酶質(zhì)量濃度(B)、料液比(C)為響應(yīng)因素,以剝殼單位功(mJ/g)為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。
表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken
1.3.6 酶液的重復(fù)利用
為探究酶液的重復(fù)利用問(wèn)題,每輪實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取出3節(jié)蝦身,測(cè)定剝殼單位功,同時(shí)測(cè)定酶活性(初始和每輪處理后酶活性)和酶液的顏色。中性酶活性的測(cè)定采用中性酶活性檢測(cè)試劑盒,每組測(cè)2次,結(jié)果用U/mL表示。
1.3.7 蝦肉品質(zhì)測(cè)定
pH值:參考GB 5009.237—2016《國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中pH值的測(cè)定方法》。每組取5 g蝦肉,加入45 mL蒸餾水,充分均質(zhì)后,靜置30 min過(guò)濾,取濾液測(cè)pH值,平行3次。
色澤的測(cè)定:根據(jù)XU等[12]的方法,測(cè)量蝦仁第2節(jié)腹側(cè)的L*、a*、b*值。每組6個(gè)平行,色差計(jì)事先用標(biāo)準(zhǔn)白板校正。
質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定:參考LI等[13]方法對(duì)蝦仁第2腹節(jié)做質(zhì)地多面分析(texture profile analysis,TPA)測(cè)試。將樣品置于平臺(tái)上,用直徑為4 mm的TA44圓柱形探頭進(jìn)行兩循環(huán)咀嚼試驗(yàn),軸向壓縮距離(應(yīng)變):5 mm;觸發(fā)力,5 g;恒速測(cè)試,1.0 mm/s;返回速度為1.0 mm/s。獲取硬度(N)、彈性(mm)、咀嚼性和內(nèi)聚性等TPA參數(shù)。每組樣品8個(gè)平行。
肌肉組織微觀結(jié)構(gòu):參考LIN等[14]的方法,取蝦第1腹節(jié)肌肉切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊。4 ℃條件下固定24 h,梯度乙醇(30%、50%、70%、90%和100%)脫水,用二甲苯浸泡至透明后浸蠟,切片(橫截面和縱截面)。將切片平貼于載玻片上,烘干后進(jìn)行蘇木精和伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察其肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)并拍照。
使用SPSS Statistics 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組處理3次平行,結(jié)果為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。以one-way ANOVA法及 Duncan 檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較和差異顯著性分析,顯著性水平定義為P<0.05。
所用4種酶的適宜pH范圍均在6.5~8.0之間[15-16],考慮到pH對(duì)蝦肉品質(zhì)的影響,選擇自然pH,不同蛋白酶預(yù)處理后所需剝殼單位功如圖2所示。加酶處理能促進(jìn)蝦剝殼,特別是中性蛋白酶,剝殼所用功為2.14 mJ/g,明顯低于對(duì)照和其他3種蛋白酶處理組(P<0.05)。中性蛋白酶是自然pH條件下具有很強(qiáng)活力的內(nèi)切酶,可催化殼、表皮及殼肉連接的蛋白質(zhì)肽鍵水解且催化反應(yīng)速度快,破壞殼-肉之間的連接[9]。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本,選用中性蛋白酶對(duì)酶處理輔助剝殼工藝進(jìn)行優(yōu)化。
1-對(duì)照;2-風(fēng)味蛋白酶;3-動(dòng)物蛋白水解酶;4-堿性蛋白酶;5-中性蛋白酶圖2 不同蛋白酶對(duì)剝殼單位功的影響Fig.2 Effect of different proteases on the peeling work注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)
2.2.1 酶質(zhì)量濃度對(duì)剝殼的影響
中性蛋白酶的質(zhì)量濃度對(duì)蝦體剝殼的影響如圖3所示,質(zhì)量濃度從0.25 mg/mL增加到1 mg/mL時(shí),剝殼所需單位功由6.24 mJ/g降低至1.37 mJ/g。說(shuō)明隨著質(zhì)量濃度的增加,單位體積內(nèi)蛋白酶與蝦殼、表皮及殼肉連接的蛋白質(zhì)的接觸機(jī)會(huì)增加,水解作用增強(qiáng)[17],殼肉之間的緊密連接發(fā)生松動(dòng),剝殼所需的功減小。當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)0.5 mg/mL時(shí),剝殼用功下降幅度減弱;質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),剝殼用功雖然減少(P<0.05),但實(shí)驗(yàn)中觀察到蝦殼變脆弱,蝦殼是否完全剝掉,不僅依賴于殼肉連接的緊密性,而且與蝦殼的性質(zhì)相關(guān)[9],酶解過(guò)度會(huì)使蝦殼的強(qiáng)度降低,剝殼時(shí)蝦殼易破碎,部分蝦殼仍留在蝦肉上,影響剝殼的完整性。綜合經(jīng)濟(jì)效益考慮,確定合適的酶質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。
圖3 酶的質(zhì)量濃度對(duì)于剝殼單位功的影響Fig.3 Effect of concentrations of protease on the peeling work
2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)剝殼的影響
如圖4所示,在2 h內(nèi),蝦剝殼單位功顯著減少(P<0.05),其剝殼單位功為4.21 mJ/g,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),剝殼所需單位功差異不顯著(P>0.05)。初始酶液中的酶量相對(duì)較高,與底物的充分接觸,使蝦殼-肉間松動(dòng)的增加幅度較大,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,酶被消耗,酶活力開始下降,剝殼單位功的減小趨于平緩(P>0.05),與酶解時(shí)間對(duì)秘魯魷魚環(huán)齒的脫離的影響具有相似性[18],所以合適的酶解時(shí)間為2 h。
圖4 酶解時(shí)間對(duì)于蝦剝殼單位功的影響Fig.4 Effect of enzymalysis time on the peeling work
2.2.3 料液比對(duì)剝殼的影響
在酶質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,處理時(shí)間為2 h的條件下,不同的料液比下對(duì)蝦剝殼影響如圖5所示,料液比為1∶2和1∶4(g∶mL)時(shí),酶解對(duì)蝦殼-肉連接部分的作用有限,蝦殼基本不能完整地被剝除。此后,隨著料液比的減小,即酶液體積的增加,作用于樣品底物的酶量增加,酶解作用接觸位點(diǎn)增多,剝殼單位功減小,料液比超過(guò)1∶8時(shí)(g∶mL),剝殼用功差異不顯著(P>0.05),因此確定料液比為1∶8(g∶mL)。
圖5 料液比對(duì)蝦剝殼單位功的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on the peeling work
2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對(duì)酶解時(shí)間(A)、中性蛋白酶的質(zhì)量濃度(B)、料液比(C)進(jìn)一步優(yōu)化,采用 Box-Behnken 原理,以剝殼單位功(Y)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),根據(jù) Design-Expert 10設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,結(jié)果見表2。
表2 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results
2.3.2 響應(yīng)面模型的建立及方差分析
表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model
2.3.3 響應(yīng)曲面交互作用分析
由圖6可知,酶解時(shí)間(A)和酶質(zhì)量濃度(B)交互作用的響應(yīng)面坡度較陡,說(shuō)明因素間的交互作用對(duì)剝殼單位功影響顯著,其等高線呈橢圓形,表示這2個(gè)因素間交互作用顯著;酶解時(shí)間(A)和料液比(C)、酶質(zhì)量濃度(B)和料液比(C)交互作用的響應(yīng)面坡度較平緩,其等高線呈圓形,說(shuō)明AC、BC因素間的交互作用剝殼單位功影響較弱,分析結(jié)果與表3具有一致性。
圖6 各因素交互作用對(duì)剝殼單位功影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour lines of interactions of various factors on the peeling work
2.3.4 模型的優(yōu)化和驗(yàn)證
根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的操作和成本,確定的優(yōu)化值為:處理時(shí)間3.5 h、酶質(zhì)量濃度0.7 mg/mL、料液比1∶10(g∶mL),此時(shí)預(yù)測(cè)得到的剝殼單位功為2.61 mJ/g。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,用此優(yōu)化條件重復(fù)試驗(yàn)3次,實(shí)際得到的蝦剝殼單位功為2.65 mJ/g,非常接近該二次回歸模型的預(yù)測(cè)值(>0.05),充分驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性,因此,采用Design-Expert 10響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的酶促脫殼條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠。
酶液循環(huán)使用對(duì)剝殼單位功的影響如圖7所示。隨使用次數(shù)的增加,酶液活性呈下降趨勢(shì),循環(huán)使用4次后,由初始的62.34 U/mL降為9.77 U/mL,而剝殼用功則由2.25 mJ/g增加為5.94 mJ/g,兩者的變化具有一致性;循環(huán)使用4次均無(wú)殼破碎粘連在蝦肉上,但循環(huán)使用3次后,酶液活性顯著下降至24.62 U/mL(P<0.05),剝殼單位功明顯增加。且隨循環(huán)使用次數(shù)增加,酶液顏色變黑,建議此酶液循環(huán)使用3次。
圖7 酶液循環(huán)使用輪數(shù)對(duì)酶活性和剝殼單位功的影響Fig.7 Effect of reusing of enzyme solution on proteolytic activity and peeling work
2.5.1 pH值和色澤
蝦體死后,體內(nèi)糖原降解影響肌肉pH值,所以通常把pH值作為判斷蝦體新鮮度的指標(biāo),且在pH值達(dá)到7.7前認(rèn)為蝦肉質(zhì)量良好[19]。鮮蝦死后pH值為6.88,這與XU等[12]測(cè)定的蝦初始pH值 6.92相似。與鮮蝦相比,冷凍和酶解處理后的蝦仁pH值分別為6.80和6.78,差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明酶解剝殼對(duì)蝦肉鮮度影響不明顯,且得到的蝦肉質(zhì)量良好。色澤是影響消費(fèi)者購(gòu)買的主要因素[20]。冷凍和酶法剝殼處理可增加蝦仁L*,說(shuō)明冷凍和酶處理均能增加蝦仁的亮度,這是由于冷凍-解凍過(guò)程中,肌肉組織細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶融化、水分溢出引起的光吸收和光散射的變化[21];部分蝦仁表皮可能被酶解,同樣殘留在表面的酶液也增加了光的反射作用。酶法處理對(duì)a*和b*影響與鮮蝦無(wú)異,冷凍后的蝦仁表面b*值為-2.61,與對(duì)照相比顯著增加(P<0.05)。綜合來(lái)看,酶處理對(duì)色澤的影響較小,可能是因?yàn)槠涮幚頃r(shí)間相對(duì)較短且蝦體無(wú)凍結(jié),能保留產(chǎn)品原有的色澤。
表4 剝殼預(yù)處理對(duì)蝦pH值和色澤的影響Table 4 Effect of pretreatment on the pH and color of shrimps
2.5.2 對(duì)蝦仁質(zhì)構(gòu)的影響
質(zhì)構(gòu)特性極大地影響了消費(fèi)者的可接受性,因此在產(chǎn)品的加工中起重要作用[22]。冷凍和酶處理剝殼后蝦仁的質(zhì)構(gòu)參數(shù)如表5所示,蝦仁的硬度、彈性、內(nèi)聚性咀嚼性均有不同程度的變化。與鮮蝦相比,冷凍24 h后,蝦仁的硬度和咀嚼性顯著下降,彈性和內(nèi)聚性無(wú)明顯變化,可能是冷凍后解凍,大冰晶的形成及融化造成蝦肉纖維組織結(jié)構(gòu)被破壞[23],且由冷凍引起的肌原纖維蛋白的降解或結(jié)締組織的變化使持水性下降,蝦肉變軟[24-25];而酶處理的蝦仁硬度只略微降低(P>0.05),這表明蛋白酶沒有過(guò)度水解蝦肉的肌原纖維和膠原蛋白,因?yàn)榧≡w維和膠原蛋白水解很大程度上會(huì)導(dǎo)致肌肉質(zhì)地軟化[26];彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性均顯著低于鮮蝦,咀嚼性和冷凍24 h相差不明顯,咀嚼性是硬度、黏性、彈性結(jié)合起來(lái)的綜合性質(zhì),猜測(cè)是在處理過(guò)程中2%的鈉鹽的作用,能夠輕微降低肌肉的硬度并較大程度地降低咀嚼性[27]。
表5 剝殼預(yù)處理對(duì)蝦仁質(zhì)構(gòu)的影響Table 5 Effect of pretreatments on the texture of shrimps
2.5.3 對(duì)肌肉組織微觀結(jié)構(gòu)的影響
肌肉的微觀結(jié)構(gòu)是對(duì)蝦肌肉品質(zhì)變化的微觀表現(xiàn),能直接反映肌肉組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性[28]。新鮮蝦仁的肌肉組織排列整齊彼此緊密相連,肌內(nèi)膜表面光滑,呈典型的多邊型;肌束呈縱向排列,肌纖維排列致密,肌節(jié)豐滿,肌纖維束呈狹長(zhǎng)柱狀(圖8-a1,圖8-a2)。冷凍24 h后剝殼的蝦仁,肌肉纖維之間的細(xì)胞外空間明顯增加,肌纖維的橫截面呈不同的碎裂形狀,肌內(nèi)膜和肌束膜破裂;此外,一些肌肉纖維不連貫,甚至出現(xiàn)斷裂,肌節(jié)受到機(jī)械損傷明顯(圖8-b1,圖8-b2),這表明由于冷凍形成的冰晶大分子對(duì)肌肉組織結(jié)構(gòu)的損傷較大。酶處理后的蝦仁,雖然肌肉細(xì)胞間的縫隙增大,但變化程度小于冷凍組;肌肉縱切面,肌纖維空隙略有增大,但并無(wú)出現(xiàn)大量斷裂現(xiàn)象,細(xì)胞維持著較好的完整性(圖8-c1,圖8-c2)。綜合來(lái)說(shuō),冷凍處理后剝殼對(duì)蝦仁肌肉結(jié)構(gòu)破壞較為明顯,酶處理后剝殼則相對(duì)較為輕微。
a1-鮮蝦橫切片;a2-鮮蝦縱切片;b1-冷凍剝殼橫切片;b2-冷凍剝殼縱切片;c1-酶促剝殼橫切片;c2-酶促剝殼縱切片圖8 剝殼預(yù)處理對(duì)蝦仁微觀結(jié)構(gòu)的影響(40×)Fig.8 Effect of pretreatments on microscopy of shrimp tissue
自然pH值下,中性蛋白酶在對(duì)蝦便捷剝殼過(guò)程中發(fā)揮良好的酶促效果,所需剝殼單位功最少且剝殼效果好。優(yōu)化得到酶促剝殼條件為:酶質(zhì)量濃度0.7 mg/mL,料液比1∶10(g∶mL),酶解時(shí)間 3.5 h,在此條件下實(shí)驗(yàn)得到的剝殼單位功為2.65 mJ/g,與理論預(yù)測(cè)值2.61 mJ/g基本一致,說(shuō)明在該實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)建立的二次線性回歸模型準(zhǔn)確有效,有一定的實(shí)用價(jià)值。該條件下酶液可重復(fù)使用3次,之后酶液活性減小至較低水平,且酶液顏色變暗。與鮮蝦仁相比,酶促剝殼對(duì)蝦仁pH及硬度影響不明顯,與冷凍剝殼后的蝦仁相比,b*與鮮蝦類似,顯著好于冷凍剝殼后的蝦仁,酶處理更能保持蝦肉的原有的色澤。微觀結(jié)構(gòu)觀察表明冷凍處理對(duì)蝦仁纖維破壞較為明顯,酶處理后的蝦肉肌纖維較為完整,排列相對(duì)緊密,沒有出現(xiàn)肌內(nèi)膜和肌纖維束斷裂的情況,說(shuō)明酶促剝殼可顯著提高鮮蝦剝殼便捷性,保持蝦仁較好的品質(zhì),為促進(jìn)對(duì)蝦機(jī)械剝殼的應(yīng)用提供參考依據(jù)。