吳雅麗，傅以鋼

（1．江蘇省徐州環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 徐州 221000；2.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092）

0 引言

作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，藻類可以通過光合作用為無脊椎動(dòng)物、魚類、鳥類和其他生物提供氧氣和食物。藻種之間以及它的初級產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上和水生生態(tài)系統(tǒng)的功能上有著直接的聯(lián)系。目前，淡水富營養(yǎng)化、藍(lán)藻出現(xiàn)和水華爆發(fā)吸引了全世界的極大關(guān)注，導(dǎo)致了廣泛的社會(huì)、環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問題，如水質(zhì)惡化、受影響水體美學(xué)價(jià)值的下降和對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的損害等[1-2]。有害的藍(lán)藻細(xì)菌如Microcystis，Anabaena，Nostoc和Aphanizomenon能夠產(chǎn)生毒素，而微囊藻毒素（microcystins：MCs）是目前檢測出最為普遍存在的毒素[3]。當(dāng)藍(lán)藻爆發(fā)時(shí)，MCs 會(huì)伴隨著大量藍(lán)藻細(xì)胞出現(xiàn)，從健康和經(jīng)濟(jì)的視角來看，這對飲用水安全造成巨大的威脅[4]。更重要的是，由銅綠微囊藻產(chǎn)生的MCs 會(huì)對魚類、鳥類、野生動(dòng)物、家畜和人類造成嚴(yán)重不良影響，與過敏、刺激反應(yīng)、腸胃炎、肝病和腫瘤發(fā)病有密切關(guān)系[5-6]。

藻毒素種類繁多，污染程度及范圍也在不斷擴(kuò)大[7]。關(guān)于如何應(yīng)對藻類的危害問題，各國的科研工作者采取了諸多不同的策略，取得了一定成就。目前，滅藻方法主要可以分為3 類，即物理方法、化學(xué)方法和生物方法?，F(xiàn)在人們更多的把目光集中到生物方法上，如種植水生植物、投入原生動(dòng)物和魚類、投放溶藻微生物等[8-9]。而分子生物學(xué)方式由于簡單、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為各國學(xué)者普遍關(guān)注的熱點(diǎn)[10]。本文采用分子生物學(xué)手段分析不同水質(zhì)水體中的種群結(jié)構(gòu)，研究確定溶藻微生物種群，以期為實(shí)際應(yīng)用溶藻微生物防治藻類水華提供有效支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

（1）樣品與培養(yǎng)條件

樣品：A 為太湖源頭水樣；B 為景觀水樣；C 為河道水樣；D 為臭水溝水樣。

培養(yǎng)條件：①富集水體微生物：在體積為100 mL LB 培養(yǎng)基中分別加入1 mL 水樣，搖床設(shè)置37 ℃，100 r/min 平行培養(yǎng)1 d；②樣品培養(yǎng)：分別添加0.01，0.02 mg/mL 銅綠微囊藻（藻干重），搖床設(shè)置37 ℃，100 r/min，與空白對照組一同培養(yǎng)2 d；③樣品預(yù)處理：樣品離心（6 000 r/min，6 min，4 ℃），去除上清液取沉淀，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）培養(yǎng)基組分

①藍(lán)藻培養(yǎng)基：NaNO3150 mg；K2HPO44 mg；MgSO4·7H2O 7.5 mg；CaCl2·2H2O 3.6 mg；Na2SiO3·9H2O 5.8 mg；檸檬酸0.6 mg；檸檬酸鐵銨0.6 mg；EDTA 0.1 mg；Na2CO32 mg；A5 溶液0.1 mL；蒸餾水99.9 mL；②A5 溶液：H3BO3286 mg；MnCl2·4H2O 181 mg；ZnSO4·7H2O 22 mg；CuSO4·5H2O 7.9 mg；Na2MoO4·2H2O 3.9 mg；蒸餾水100 mL；③LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g；酵母提取物5 g；NaCl 10 g；蒸餾水1 000 mL；pH 值為7.0～7.2。

1.2 16S 微生物種群分析

（1）DNA 提取

利用MP bio 土壤提取試劑盒（FastDNA Spin Kit for Soil），提取純化樣品DNA，提取得到的DNA 置于離心管中，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）PCR 擴(kuò)增

①確定引物534r（V3）：（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）；341f（V3）：（5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）（下劃線處為“GC”鉗）。

②樣品DNA 用16S rDNA 的V3 區(qū)引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 體系：超純水38.75 μL，dNTP（濃度為2.5 mmol/L）2μL，10×buffer5 μL，引物（濃度為10 μmol/L）為1 μL，DNA 模板2 μL，Taq 酶（大連寶生物工程有限公司）0.25 μL。

③PCR 擴(kuò)增程序：溫度94 ℃，保持3 min 預(yù)變性；溫度94 ℃，保持20 s 變性；溫度55 ℃，保持30 s退火；溫度72℃，保持30s 延伸，30 個(gè)循環(huán)；溫度72℃，保持7 min 延伸。

（3）DGGE 分析

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用DGGE（變性梯度凝膠電泳）電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，凝膠變性梯度為35%～55%，電壓200 V，溫度60 ℃，電泳時(shí)間5 min；之后電壓調(diào)為120 V，電泳時(shí)間6～7 h，電泳結(jié)束后加入30 μL SDNA-Nucleic acids stain dye（上海生工生物工程有限公司）在200 mL 1×TAE 緩沖液中染色，后在搖床上震蕩30 min 取出，紫外燈下割取目的DNA 條帶，置于微量離心管中，擠碎后加入20 μL 超純水過夜，溶出DNA 待用。

（4）克隆

DGGE 條帶再擴(kuò)增引物為534r（V3）（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）和341S（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’），PCR 體系與擴(kuò)增程序見1.2。

采用1.0%瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，割膠后進(jìn)行膠回收（BioMIGA Gel/PCR Extraction Kit），擴(kuò)增片段純化后與T-載體進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化，陽性克隆挑出后培養(yǎng)再擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物委托華大基因公司進(jìn)行測序。

1.3 蛋白分析

（1）蛋白質(zhì)提取

吸取200 μL 水樣于1.5 mL 離心管中，離心去除上清液，分別加入25 μL 蛋白Loading buffer 和100 μL 超純水，置于沸水中蒸煮3～5 min 以提取蛋白，于4 ℃保存待用。

（2）SDS-PAGE 電泳

配制12%的分離膠及5%的濃縮膠，加入1× 電泳緩沖液進(jìn)行電泳，分離膠電壓為120 V，濃縮膠電壓為80 V，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色30 min，過夜脫色，脫色完成后割取目的條帶，委托中國科學(xué)院進(jìn)行LC-MS 質(zhì)譜測定。

（3）LC-MS 質(zhì)譜測定

膠內(nèi)酶解（Trypsin）20 h，并抽提酶解肽段，利用毛細(xì)管高效液相色譜方法分析，其中A 液為0.1%甲酸的水溶液，B 液為0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈為84%）；色譜柱以95%的A 液平衡后，樣品由自動(dòng)上樣到Trap 柱。同時(shí)將樣品經(jīng)過ESI 質(zhì)譜得到的多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集20 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）。原始文件（raw file）用BIOWORKS 軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為Bacteria 蛋白質(zhì)庫，SEQUEST 結(jié)果過濾參數(shù)為：當(dāng)Charge+1，Xcorr ≥1.9；當(dāng)Charge+2，Xcorr≥2.2；當(dāng)Charge +3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同水質(zhì)采樣點(diǎn)微生物多樣性分析

作為研究對象的自然水體取自不同水質(zhì)水體，A 為太湖源頭水樣，B 為景觀水樣，C 為河道水樣，D為臭水溝水樣。A1～D1 為樣品中加入質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL（藻干重）銅綠微囊藻，A2～D2 為樣品中加入質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL（藻干重）銅綠微囊藻。經(jīng)過PCR-DGGE 技術(shù)分析，之后在紫外燈下拍照，得到DGGE 電泳圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 不同水質(zhì)自然水體微生物16S rDNA 電泳結(jié)果

由圖1 可以看出，電泳圖譜條帶均勻、較密集，微生物種群結(jié)構(gòu)豐富，加入不同濃度藻類沖擊后大部分條帶仍然與原水樣條帶保持一致，只是部分條帶明暗程度有所改變。說明加藻沖擊后對水樣中微生物組成會(huì)有一定影響，但仍和水樣原微生態(tài)基本保持一致，這是符合正常預(yù)期的。較亮的條帶代表降解過程中可能起到主導(dǎo)作用的優(yōu)勢種群，而其他種群由于處在非主導(dǎo)地位，因而在數(shù)量上處于劣勢。加藻后微生物優(yōu)劣勢種群部分發(fā)生了演替，如A 樣品中的7 號條帶在加質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL 藻后變?yōu)閮?yōu)勢菌群，B 樣品中的9 號條帶在加質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL 藻后變?yōu)閮?yōu)勢菌群，說明這2 種微生物可能對藻類有較強(qiáng)的適應(yīng)力或具有一定的耐藻性。10 號條帶則在加入不同濃度藻類后條帶均變暗，成為劣勢菌群，說明此類微生物對于藻類的沖擊沒辦法適應(yīng)，加藻后數(shù)量明顯減少。B 樣品和C 樣品中的5 號條帶和4 號條帶則在加入不同濃度藻類后沒有發(fā)生明顯變化，說明這種微生物有可能具有一定的耐藻性。

從圖1 樣品中割取15 個(gè)目的條帶，對這些條帶進(jìn)行純化后克隆、測序，獲得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過序列分析，發(fā)現(xiàn)2，12 條帶同為Lysinibacillussp.MJJ-11 菌，各序列比對結(jié)果見表1。

由表1 可以看出，所選優(yōu)勢菌基本都能在Genbank 中找到同源性較好的細(xì)菌，除1 條帶同源性為95%之外，其他條帶均在99%以上，可以確定為同一個(gè)菌種或菌屬。

用MEGA 軟件分別對自然水體中原有細(xì)菌及受到藻類沖擊后水樣進(jìn)行同源進(jìn)化分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同水質(zhì)細(xì)菌同源進(jìn)化分析結(jié)果

由圖2 可以看出，鑒定得到的細(xì)菌分為2 個(gè)家族，但家族中細(xì)菌數(shù)量相差較大，其中較大的一個(gè)家族又分為2 個(gè)細(xì)菌數(shù)量較一致的2 個(gè)分支，分別主要由Bacillus及Aeromonas所組成。結(jié)合DGGE 圖譜，自然水體中原有優(yōu)勢菌群主要是Bacteroidessp.，Pseudomonassp.，Clostridiumsp.，Salmonella entericasubsp.，Aeromonassp.，Bacillus cereus。加入不同濃度藻類沖擊后水樣種群結(jié)構(gòu)發(fā)生一些變化，優(yōu)勢菌群主要是Enterobactersp.，Clostridiumsp.，Bacteroidessp.，Pseudomonassp.，Bacteriumstr.，Aeromonas veronii，Bacillussp.，Lysinibacillussp.，Aeromonassp.。

測序結(jié)果顯示，不同取樣批次鑒定得到的微生物種類略有差別，但基本構(gòu)成高度一致，鑒定得到的主要種屬相似，2 批樣品中主要存在的微生物群落均為Aeromonas，Enterobacter及Bacillus，說明同一水體不同批次的樣品微生物菌落結(jié)構(gòu)會(huì)有差異，原有微生物體系會(huì)因加藻沖擊造成一定的影響，但最終會(huì)形成一個(gè)相對穩(wěn)定的新的微生物體系。

2.2 不同水質(zhì)樣品蛋白差異性分析

利用提取得到的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行蛋白單向電泳分析（SDS-PAGE），然后在白光下觀察拍照，得到電泳圖譜見圖3。

圖3 不同水質(zhì)采樣點(diǎn)自然水體的蛋白電泳結(jié)果

由圖3 可以看出，各泳道譜帶背景均較清晰，蛋白條帶分布較均勻，相對分子質(zhì)量范圍集中在35.0～116.0 kDa 之間，且不同水質(zhì)在加入不同濃度的銅綠微囊藻后在蛋白條帶濃度上均有一定程度的變化。電泳結(jié)果顯示水質(zhì)越差蛋白條帶相應(yīng)減少，4 種樣品在位于45.0 kDa 左右的蛋白條帶變化明顯，加藻后蛋白條帶濃度均有一定程度的增加，尤其D 樣品變化最為明顯。觀察發(fā)現(xiàn)隨著水質(zhì)的變差蛋白濃度變化也相應(yīng)變得明顯，說明有可能隨著水質(zhì)的惡化，水體原有微生物抗藻類沖擊的能力也隨之增強(qiáng)。

2.3 目的蛋白條帶質(zhì)譜鑒定分析

割取的蛋白條帶相對分子質(zhì)量位于35.0～45.0 kDa 之間，且位于35.0～45.0 kDa 之間的蛋白條帶與LEE S 等[11]從海水中分離得到的一株海洋細(xì)菌假交替單胞菌A28（Pseudoalteromonas sp.A28）中的高效溶藻酶特征比較相像，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也較吻合，故本章僅對相對分子質(zhì)量位于35.0～45.0 kDa 之間的蛋白條帶結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析討論。蛋白總質(zhì)譜圖譜結(jié)果見圖4。

圖4 質(zhì)譜Base peak 圖譜

由圖4 可以看出，通過對相對分子質(zhì)量為45.0 kDa 處目的蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析，得到蛋白覆蓋率達(dá)到10%～50%，其Delcn 相關(guān)因子及Xcorr 相關(guān)因子在鑒定的肽段中分別達(dá)到了0.1 及2 以上，說明質(zhì)譜鑒定結(jié)果較可信。根據(jù)得到的多肽序列與數(shù)據(jù)庫的匹配情況，共分析出637 個(gè)唯一肽段，鑒定得到132 種蛋白，其中已知蛋白119 種，未知蛋白13 種，已知蛋白條帶鑒定結(jié)果見表2。

表2 已知蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

續(xù)表

由表2 可以看出，目的條帶中主要存在的蛋白有A Chain A,Ef-Tu，tuf-2 gene product，elongation factor Tu，hypothetical protein，tufA gene product，DNAdirected RNA polymerase subunit alpha，gltA gene product，translation elongation factor Tu，hypothetical protein，ferredoxin，sucC gene product，gdhA gene product，cysteine desulfurase，citrate synthase IscS，protein GltA。與蛋白相對應(yīng)的宿主細(xì)菌主要包括Escherichia Coli，Aeromonas hydrophila subsp.，Aeromonas salmonicida subsp.，Klebsiella pneumoniae，Enterobacter aerogenes，Bacillus pseudofirmus，Bacillus cereus，Pseudomonas sp.，Pseudomonas aeruginosa，Pseudomonas stutzeri，Pseudomonas fluorescens，Acinetobacter baumannii，Alteromonas macleodii str.，Pseudoalteromonas rubra，Shewanella putrefaciens，Shewa-nella baltica，F(xiàn)rancisella cf.Novicida，Neisseria meningitidis，Alcanivorax borkumensis，Thiocystis violas-cens。其中已報(bào)道具有降藻作用的細(xì)菌為氣單胞菌屬（Aeromonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏桿菌屬（Klebsiella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和假交替單胞菌屬（Pseudoaltero-monas）。

3 結(jié)論

（1）自然水體中無論污染程度嚴(yán)重與否，都保有一個(gè)復(fù)雜而穩(wěn)定的微生物生態(tài)鏈。這個(gè)生態(tài)鏈在受到藻類沖擊時(shí)，其總體結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)組成基本能夠保持不變。蛋白條帶的濃度變化與藻類沖擊的強(qiáng)度有直接聯(lián)系。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可大致判斷能夠耐受或者降解藻類的蛋白酶相對分子質(zhì)量大小在35.0～45.0 kDa。

（2）結(jié)合目的蛋白條帶質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析，鑒定得到的蛋白相應(yīng)的細(xì)菌與DGGE 測序結(jié)果能夠較好吻合，如Klebsiella，Acinetobacter，Enterobacter，Bacillus和Pseudomonas等菌在樣品的蛋白鑒定結(jié)果及DGGE 條帶測序結(jié)果中均有發(fā)現(xiàn)。說明得到表達(dá)的蛋白條帶中所鑒定到的細(xì)菌能夠很好的與水體中微生物相對應(yīng)，且相對應(yīng)的細(xì)菌多數(shù)被報(bào)道與溶藻相關(guān)，Kle bsiella，Acinetobacter，Enterobacter，Bacillus和Pseudomonas均在有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中被認(rèn)為具有溶藻、降解有機(jī)物以及反硝化聚磷的作用，由此可以推測這5 種菌在水體溶藻方面發(fā)揮著重要的作用。