汪貝貝，劉宇軒，陸光華，王永花

(河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098）

0 引言

底泥微生物與湖泊生態(tài)系統(tǒng)密切相關(guān)。一方面，底泥微生物驅(qū)動著絕大多數(shù)生物活性元素的形態(tài)轉(zhuǎn)換和地球化學(xué)循環(huán)，調(diào)節(jié)水體環(huán)境質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)水質(zhì)凈化[1－2]；另一方面，底泥微生物群落的分布也受環(huán)境因子的影響，如溫度、pH 值、溶解氧、電導(dǎo)率、營養(yǎng)鹽等[1-4]。研究底泥微生物群落的多樣性、分布特征及其環(huán)境因子的影響對維護(hù)湖泊生態(tài)系統(tǒng)的健康、穩(wěn)定和開展修復(fù)具有重要意義。

細(xì)菌是湖泊微生物的主要組成部分，是有機(jī)化合物的主要分解者。目前，已有不少學(xué)者對太湖底泥微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)底泥微生物群落組成因湖區(qū)、季節(jié)、底泥深度的不同具有一定的差異。HUANG R 等[5]對夏季梅梁灣、胥湖、東太湖沉積物細(xì)菌群落組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同湖區(qū)的優(yōu)勢菌門表現(xiàn)不同。CHEN M J 等[4]發(fā)現(xiàn)太湖梅梁灣和湖心真核微生物群落組成顯示出明顯的季節(jié)性變化，且不同湖區(qū)對環(huán)境因子的響應(yīng)不同，梅梁灣和湖心分別受TP，TN 和EC的影響最為顯著。而WAN Y等[1]研究發(fā)現(xiàn)季節(jié)是引起底泥微生物群落差異的最顯著因素，而非湖區(qū)位置。YE W J 等[6]研究發(fā)現(xiàn)太湖梅梁灣沉積物中細(xì)菌群落垂直分布相似，但古細(xì)菌群落組成因深度的不同而差異明顯。目前關(guān)于太湖底泥微生物的研究主要集中在夏、秋兩季的特殊湖區(qū)（如富營養(yǎng)化嚴(yán)重的梅梁灣、竺山湖）和0～5 cm的表層底泥，冬季底泥微生物的文獻(xiàn)較少。以2017年冬季太湖沿岸各區(qū)及湖心10～15 cm 深度底泥為研究對象，利用高通量測序技術(shù)系統(tǒng)分析太湖底泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，探討其與水體和沉積物中環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系，揭示太湖底泥細(xì)菌群落的形成機(jī)制，為維護(hù)太湖生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據(jù)太湖水系、污染狀況、水利工程及底泥分布特征，選取了16 個采樣點(diǎn)。采樣點(diǎn)位分布見圖1。

圖1 太湖采樣點(diǎn)位示意

采樣時間：2017年12月。采樣方式：用不銹鋼抓斗采集湖底表層10～15 cm 深度的底泥，用滅菌自封口袋封裝，于4 ℃下保存并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室的新鮮底泥樣品一部分立即提取微生物DNA；另一部分經(jīng)冷凍干燥、研磨后，過d=125 μm篩后于-20 ℃保存，并在一周內(nèi)完成底泥樣品理化性質(zhì)分析。

1.2 理化指標(biāo)分析

采用YSI6600 型水質(zhì)分析儀（美國YSI 公司）對采樣點(diǎn)上覆水的水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行現(xiàn)場測定，項目包括：pH 值、溶解氧（DO）、電導(dǎo)率（EC）、溫度（T）。分別采用硫酸鉀消解紫外分光光度法、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法和比色法測定底泥中總氮（TN）、硝態(tài)氮（NO3--N）、亞硝酸鹽氮（NO2--N）和銨態(tài)氮（NH4+-N）；采用鉬酸銨分光光度法測定底泥中的總磷（TP）。

1.3 底泥微生物DNA 提取與測序

采用Illumina Miseq 平臺（美國Illumina 公司）對純化后的底泥PCR 產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，測序方案為2×250 bp 兩端測序。對于Miseq 測序獲得原始數(shù)據(jù)使用Mothur 軟件平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾、降噪、去嵌合體、去除非細(xì)菌序列等質(zhì)量控制操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 26.0 軟件通過單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)評估不同樣本數(shù)據(jù)之間的差異性，以P<0.05 為具有顯著性差異。使用QIIME平臺對測序序列進(jìn)行微生物物種分類信息注釋，按97%相似度進(jìn)行OTU 劃分。利用RDP Classifier 通過比對Greengenes 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行從門水平到屬水平的物種分類信息注釋。利用R 語言進(jìn)行樣品Alpha 多樣性計算；利用Canoco5.0 進(jìn)行典型關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 太湖水體和底泥理化性質(zhì)分析

太湖各區(qū)域水體理化性質(zhì)無較大差異，水體偏弱堿性（pH 值平均為8.22）；ρ（DO）>7.5 mg/L，達(dá)到Ⅰ類水標(biāo)準(zhǔn)，湖心區(qū)域溶解氧略高于其他區(qū)域；EC穩(wěn)定在465～696 μS/cm 之間；水溫為9 ℃左右。指標(biāo)測定值見圖2。

圖2 太湖水體理化指標(biāo)

太湖16 個采樣點(diǎn)底泥中N,P 元素指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測結(jié)果見圖3（同一組數(shù)據(jù)中不同小寫字母表示具有顯著性差異，P<0.05）。由圖3 可知，除NO3--N 外，其他元素指標(biāo)存在顯著性差異，尤其是TN，NH4+-N，總體表現(xiàn)為太湖西部、北部含量高于東部（點(diǎn)位S16除外）和南部，這與WAN Y 和石文莉等[1，8]在太湖的研究結(jié)果較為一致。相比2010年太湖湖濱帶（ω（TN）為458～5 211 mg/kg）[9]、2016年秋季太湖梅梁灣（ω（TN）=1 820±180 mg/kg）和湖心區(qū)（ω（TN）=1 310±250 mg/kg）的研究[5]，本次檢測中太湖底泥TN 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅降低，為208～960 mg/kg。但TP 含量仍較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為342～1 586 mg/kg，略高于2010年研究結(jié)果（ω（TN）為128～1 393 mg/kg）[9]。根據(jù)美國環(huán)保署（EPA）制定的底泥分類標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，多個湖區(qū)TP 仍然處于中度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為420～650 mg/kg）或重度污染（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞650 mg/kg），以竺山湖最為嚴(yán)重，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)1 586 mg/kg。藍(lán)藻水華、太湖水體和沉積物之間的磷循環(huán)，使得底泥TP 含量過高是2014年以來太湖藍(lán)藻水華呈擴(kuò)大趨勢，特別是2017年太湖再次出現(xiàn)巨大面積水華的重要誘因，又是其爆發(fā)過后的不良結(jié)果[7,11,12]。莊嚴(yán)等[13]利用3S 技術(shù)研究同樣發(fā)現(xiàn)竺山湖是近幾年來太湖底質(zhì)TP 的高值區(qū)，同時也是水華高發(fā)區(qū)。特別指出，沉積物中越冬休眠的藍(lán)藻細(xì)胞正是次年藍(lán)藻水華爆發(fā)的“種源”[14]。因此，加強(qiáng)冬季太湖底泥的生態(tài)疏浚治理尤為重要。

圖3 太湖底泥中N，P 元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過高通量測序技術(shù)在16 個采樣點(diǎn)共獲得6 954條OTUs。Shannon 指數(shù)（5.57～6.07）和Simpsion 指數(shù)（0.89～0.95）均較高，說明太湖底泥微生物多樣性高且分布均勻，其中以東太湖S16 點(diǎn)位的細(xì)菌群落最為豐富。16 個采樣點(diǎn)共篩查出32 個細(xì)菌門、362個細(xì)菌屬，結(jié)果見圖4～圖5。

圖4 太湖底泥細(xì)菌門水平相對豐度

圖5 太湖底泥細(xì)菌屬水平相對豐度

由圖4 可知，在門水平上，10 個主要門類依次為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、Latescibacteria 門和Aminicenantes 門。這10 個門的微生物基本決定了整個太湖底泥細(xì)菌群落構(gòu)成，數(shù)量合計占細(xì)菌生物總量的69.5%～81.5%。變形菌門在S3，S8，S9，S16 點(diǎn)位的數(shù)量明顯高于其他區(qū)域，酸桿菌門在梅梁湖顯著高于貢湖灣（P<0.05）。梅梁湖和東部沿岸區(qū)的厚壁菌門相對豐度高于其它湖區(qū)（P<0.05）。變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門是3 個最優(yōu)勢菌群，占細(xì)菌生物總量的51.8%～65.4%，除S1 點(diǎn)位中綠彎菌門是最優(yōu)勢菌群外，其余各位點(diǎn)中變形菌門豐度最高。

由圖5 可知，在屬水平上，居于362 種菌屬前10 的是Steroidobacter，Gp6，Gp16，Gp17，Gaiella，Bellilinea，Subdivision3，Gp7，Nitrospira和Gp23。其中Steroidobacter是S2，S3，S8，S9，S10，S16 點(diǎn)位的最優(yōu)勢菌屬，屬于變形菌門；Gp6是S4～S7，S11～S15 點(diǎn)位的最優(yōu)勢菌屬，屬于酸酐菌門；Gp16是S1 點(diǎn)位的最優(yōu)勢菌屬，同樣屬于酸酐菌門。Steroidobacter，Gp6和Gp16在所有采樣區(qū)域的豐度均很高，可以推斷其是太湖冬季底泥細(xì)菌中的優(yōu)勢菌屬，尤其是在TP 污染較為嚴(yán)重的竺山湖和西部沿岸區(qū)，數(shù)量占比為46.91%～51.90%，遠(yuǎn)高于其他湖區(qū)。

總體而言，變形菌門是冬季太湖底泥相對豐度最高的菌群，其次是綠彎菌門和酸桿菌門。變形菌門在生物脫氮、生物除磷及諸多污染物降解過程中有重要作用[15]，因此在太湖底泥中占領(lǐng)了絕對優(yōu)勢，而S1 點(diǎn)位的特殊性可能是由于望虞河引水工程的影響。薛銀剛等[16]和吳玲[2]分別在2015年、2016年對太湖梅梁灣和湖心等湖區(qū)底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的研究也發(fā)現(xiàn)了變形菌門的高豐度。SHAO K O 等[3]和HUANG R 等[5]還發(fā)現(xiàn)變形菌門是夏季梅梁灣、胥口灣和東太湖底泥豐度最高的菌群。除此之外，變形菌門也是云南13 個高原淡水湖泊[17]、我國最大淡水湖鄱陽湖[18]、德國薩克森州4 個淡水水庫[19]的優(yōu)勢菌群。綠彎菌門由于營養(yǎng)方式靈活多變，參與了碳、氮、硫等元素的重要化學(xué)循環(huán)[20]。同樣的，酸桿菌門也參與多種物質(zhì)的降解和轉(zhuǎn)化[14]，廣泛存在于各種環(huán)境，尤其是土壤環(huán)境中[21]。

2.3 太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性

典型相關(guān)分析結(jié)果見圖6。由圖6（a）可知，湖泊底泥5 種理化性質(zhì)參數(shù)解釋了數(shù)量占比61.6%的主要細(xì)菌分布和群落結(jié)構(gòu)。其中TP 顯著影響了底泥主要細(xì)菌的分布和群落結(jié)構(gòu)，其次是NO3--N。磷是淡水湖泊浮游植物生長的主要限制因子[22]，聚磷菌屬Dechlormonas與TP 具有強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系。有研究表明，TP 濃度上升是2017年太湖出現(xiàn)巨大水華的主要原因[7]，一方面，水華爆發(fā)極大地改變了生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，包括改變微生物群落結(jié)構(gòu)；另一方面，微生物活動實(shí)現(xiàn)了沉積物與藍(lán)藻水華顆粒之間的N,P 循環(huán)[17]。SONG H 等[23]在東平湖、周思聰?shù)萚24]在洪澤湖西北部濕地沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)研究中也發(fā)現(xiàn)TP 是最顯著的環(huán)境影響因子。NO3--N 同樣是云南13 個淡水湖泊沉積物細(xì)菌多樣性的重要決定性因素[17]。雖然NO3--N 含量遠(yuǎn)低于TP，NH4+-N，但由于其在水華不同時期的變化較其他環(huán)境因子顯著[25]，所以也能顯著影響太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，本研究也發(fā)現(xiàn)最優(yōu)勢細(xì)菌類群Steroidobacter直接參與了NO3--N 的代謝。

由圖6（b）可知，底泥上覆水理化指標(biāo)對底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在影響。Steroidobacter，Gp6等最優(yōu)勢菌屬與EC顯著正相關(guān)，EC能夠反映水體離子濃度，受水體中金屬離子和相應(yīng)陰離子濃度影響，含鹽量越高導(dǎo)電率越高。Nitrospira屬與DO 和pH值顯著正相關(guān)，DO 是影響水體氨氧化微生物群落組成及豐度的重要因素，pH 值則通過影響氨氧化反應(yīng)物的化學(xué)形態(tài)、濃度與有效性來影響含amoA基因微生物的群落組成及豐度[26]。本研究水體DO充足、整體偏弱堿性，有利于微生物的生長[27]，降低了DO 和pH 值的限制。溫度可以影響物質(zhì)循環(huán)和生物活動[24]，研究發(fā)現(xiàn)，近幾年冬季太湖水溫升高給藍(lán)藻提前復(fù)蘇提供了有利條件[10]。

圖6 太湖底泥細(xì)菌群落理化性質(zhì)的相關(guān)性

3 結(jié)論

（1）太湖大部點(diǎn)分位底泥中TP 處于中度污染，其中竺山湖和西太湖污染較嚴(yán)重。

（2）冬季太湖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富，變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢菌群，但不同點(diǎn)位豐度存在差異性；在屬水平上，最具代表性的微生物是Steroidobacter，Gp6和Gp16，且在TP 污染嚴(yán)重的竺山湖和西太湖相對豐度高于其他湖區(qū)。

（3）太湖底泥TP 對底泥微生物群落結(jié)構(gòu)及分布影響最為顯著，其次是NO3-N。水質(zhì)指標(biāo)的影響程度由高到低為EC>T>pH 值>DO。