邱麗娟 巢雯 石安喆 閻瀾 呂權(quán)真 姜遠英

(1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433; 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

白念珠菌是與人類共生的機會性致病真菌，可以在正常人的皮膚、口腔、腸道等部位檢出[1]。由于近年來HIV感染、免疫受損患者的增多以及免疫抑制劑的使用，念珠菌黏膜感染和侵襲性感染的發(fā)病率逐年攀升[2-4]。目前，念珠菌病可以用唑類、棘白菌素類、多烯類等抗真菌藥物治療，但令人擔(dān)憂的是白念珠菌對這些常見的抗真菌藥物的耐藥性越來越高[5]，尋找具有協(xié)同抗真菌活性的化合物可以為解決真菌耐藥問題提供重要方向[6]。

脂肪酸在調(diào)控細胞生命活動和微生物菌群平衡方面發(fā)揮重要作用。許多研究表明脂肪酸類物質(zhì)具有抗瘧疾、抗結(jié)核分枝桿菌以及抗真菌活性[7]。例如，2-己癸酸可以通過抑制胞內(nèi)飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的合成以及抑制脂肪酸?；l(fā)揮抗真菌作用。十四烷酸(14∶0)類似物可以競爭結(jié)合真菌的N-肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶(N-myristoyltransferase, NMT)，干擾真菌的脂質(zhì)代謝，進而抑制和殺滅真菌[8]。本研究發(fā)現(xiàn)含有21個碳的硬脂酸單甘油酯(glyceryl monostearate， GMS)與卡泊芬凈聯(lián)合用藥后，顯著增強了卡泊芬凈的體外抗真菌效果，該研究為抗真菌藥物增敏劑研究提供了新思路。此外，硬脂酸單甘油酯是一種常見的非離子表面活性劑，具有親油性和消泡性，可以用于各種軟膏、膠囊等藥物的乳化劑，該研究也可以為卡泊芬凈的劑型改造提供新的方向。硬脂酸單甘油酯結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 硬脂酸單甘油酯結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料

潔凈工作臺(HPeafe-1200LC(A2)上海力申科學(xué)儀器有限公司)；振蕩培養(yǎng)箱(HZ-2111K-B江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)；微量加樣器(Biohit)；小型冷凍離心機(HitachiCT15RE)；蒸汽滅菌鍋(KG-SX500 KAGOSHIMA SELSAKUSYO Japan)；多功能酶標(biāo)儀，TECAN Infinite M200)；倒置相差顯微鏡(Amersham Pharmacia AMG EVOS×1)；紫外分光光度計(Amersham Biosciences Mltrospec10)。

實驗中用到的標(biāo)準菌株白念珠菌SC5314由美國Georgetown大學(xué)William A Fonzi教授贈與，臨床分離的氟康唑耐藥白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌來自上海長海醫(yī)院皮膚科，卡泊芬凈(CAS)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，硬脂酸單甘油酯(GMS)購自上海生工生物科技有限公司，酵母提取物、甘露醇、營養(yǎng)肉湯購自BD公司，蛋白胨、葡萄糖、瓊脂購自上海生工生物技術(shù)有限公司，RPMI 1640購自Gibco公司。

1.2 方法

棋盤式微量液基稀釋法 ①菌株活化：將保存在SDA固體培養(yǎng)皿的念珠菌單克隆菌株轉(zhuǎn)接到1 mL YEPD培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱(30℃、200 r/min)，培養(yǎng)16 h，使白念珠菌處于指數(shù)生長的平臺期;②洗菌：將活化好的菌株轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，用無菌PBS緩沖液洗3次，再用1 mL PBS重懸;③調(diào)節(jié)菌液濃度：先用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋菌液至濃度為1×106～5×106CFU /mL，而后再用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋1 000倍，使菌液終濃度為1×103～5×103CFU /mL;④GMS單藥處理：取6個無菌的10 mL玻璃試管，1號試管中加入3 mL上述RPMI 1640稀釋的菌液，并加GMS使得藥物終濃度為4 μg/mL；2—6號試管中加入1.5 mL上述稀釋的菌液；從1至6號試管做倍比稀釋，使得藥物終濃度分別為4 μg/ mL、2 μg/ mL，1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/ mL、0.125 μg/ mL；⑤制備藥敏實驗板：取一塊96孔板，第1列加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基做空白對照；第12列加入100 μL未加藥處理的菌液做陽性對照；第2列從A—F行分別加入上述GMS單藥處理的1—6號菌液200 μL，第3—11列從A—F行分別加入上述GMS單藥處理的1—6號菌液100 μL，在第二列A—F行中再加入CAS使得藥物終濃度為4 μg/mL；第2—11列G、H做單藥處理對照，先分別加入未加藥處理的菌液，其中第2列200 μL，第3—11列100 μL，第2列G行再加入CAS使得藥物終濃度為4 μg/mL，第2列H行再加入GMS使得藥物濃度為4 μg/mL。第2—11列進行倍比稀釋，最終使得CAS終濃度分別為4 μg/ mL、2 μg/ mL，1 μg/ mL、0.5 μg/ mL、0.25 μg/ mL、0.125 μg/ mL，0.063 μg/ mL、0.031 μg/ mL、0.016 μg/ mL、0.008 μg/ mL，GMS終濃度分別為4 μg/ mL、2 μg/ mL，1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/ mL、0.125 μg/ mL；96孔板于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用酶標(biāo)儀在λ=600 nm處測OD值，計算MIC和FICI值(FICI=A藥聯(lián)用時的MIC/A藥單用時的MIC+B藥聯(lián)用時的MIC/B藥單用時的MIC)，兩藥合用評價標(biāo)準：當(dāng)FICI>4時兩藥產(chǎn)生拮抗作用；0.5

白念珠菌菌絲形成誘導(dǎo)實驗 過夜活化的白念珠菌SC5314和904分別用Spider培養(yǎng)液和RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋1 000倍，加入CAS的終濃度為0.0313 μg/mL，而后加入GMS并進行倍比稀釋，使GMS的終濃度為4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，空白對照組加入同體積的DMSO，充分混勻，轉(zhuǎn)移至12孔板中，37 ℃，靜置培養(yǎng)3 h，倒置顯微鏡觀察菌絲形態(tài)[10]。

2 結(jié) 果

2.1 硬脂酸單甘油酯與卡泊芬凈具有顯著的協(xié)同抗念珠菌活性

為了考察硬脂酸單甘油酯對白念珠菌藥物敏感性的影響，我們在RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入不同濃度的硬脂酸單甘油酯、卡泊芬凈及氟康唑，結(jié)果表明加入1 μg/mL的硬脂酸單甘油酯后，白念珠菌標(biāo)準菌株SC5314對卡泊芬凈的敏感性增加了8倍(見表1)，兩藥具有明顯的協(xié)同作用，但對氟康唑的敏感性并無明顯影響(見表2)。之后，我們進一步考察了硬脂酸單甘油酯協(xié)同卡泊芬凈的抗念珠菌譜，結(jié)果表明低濃度的硬脂酸單甘油酯可以協(xié)同卡泊芬凈對臨床分離的氟康唑耐藥白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，結(jié)果顯示硬脂酸單甘油酯協(xié)同卡泊芬凈對80%左右的臨床致病念珠菌有協(xié)同抗真菌效果(見表1)。以上結(jié)果表明在常見的臨床致病念珠菌中，硬脂酸單甘油酯可以協(xié)同卡泊芬凈抑制念珠菌的生長。

表1 棋盤式微量稀釋法檢測硬脂酸單甘油酯(GMS)與卡泊芬凈(CAS)合用對念珠菌的體外抗真菌活性

表2 棋盤式微量稀釋法檢測硬脂酸單甘油酯(GMS)與氟康唑(FCZ)合用對白念珠菌的體外抗真菌活性

2.2 硬脂酸單甘油酯可以協(xié)同卡泊芬凈抑制白念珠菌的菌絲形成

為了進一步考察硬脂酸單甘油酯與卡泊芬凈合用的體外抗菌效果，我們研究了兩種化合物合用對白念珠菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果表明，在RPMI 1640和Spider液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)菌絲形成的過程中，卡泊芬凈抑制菌絲形成的最低濃度為0.0625 μg/mL，當(dāng)我們合用4 μg/mL 的硬脂酸單甘油酯后，卡泊芬凈在0.0313 μg/mL也能完全抑制白念珠菌的菌絲形成，這表明硬脂酸單甘油酯與卡泊芬凈可以協(xié)同抑制白念珠菌的菌絲形成，具體結(jié)果見圖2。

圖2 RPMI1640和Spider培養(yǎng)基誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成。白念珠菌SC5314在37℃培養(yǎng)3 h，各孔中分別加入4 μg/mL GMS、0.0313 μg/mL CAS和4 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS

為了考察硬脂酸單甘油酯和卡泊芬凈協(xié)同抑制菌絲的最低濃度，我們在Spider培養(yǎng)基中進一步降低了硬脂酸單甘油酯的濃度。結(jié)果顯示，2 μg/mL的硬脂酸單甘油酯即可與0.0313 μg/mL的卡泊芬凈產(chǎn)生協(xié)同效果，明顯抑制Spider 培養(yǎng)基中液態(tài)菌絲的生長，見圖3。

圖3 Spider培養(yǎng)基誘導(dǎo)白念珠菌菌絲形成。白念珠菌SC5314在37℃培養(yǎng)3 h，各孔中分別加入0.0313 μg/mL CAS、1 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS、2 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS 和4 μg/mL GMS+0.0313 μg/mL CAS

3 討 論

卡泊芬凈是臨床常用的抗念珠菌感染藥物，由于其抗菌活性強、毒性低而被廣泛使用[11]。然而，臨床使用的卡泊芬凈價格昂貴，使用成本較高，通過藥物合用的方式降低其使用劑量可以顯著減少患者的用藥成本。同時，臨床研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌可以通過靶基因FKS1突變的方式對卡泊芬凈耐受，而通過藥物合用的方式也可以降低真菌耐藥性的產(chǎn)生[5]。Lu等前期發(fā)現(xiàn)作用于卡泊芬凈上游的香葉基轉(zhuǎn)移酶抑制劑L-269289可以在體內(nèi)外增強卡泊芬凈的抗念珠菌效果，為解決卡泊芬凈耐藥問題提供了新的方法[12]。本研究中，我們通過棋盤式液基稀釋法研究發(fā)現(xiàn)，硬脂酸單甘油酯與卡泊芬凈合用具有較強的協(xié)同抗真菌效果。在不同的菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，硬脂酸單甘油酯與卡泊芬凈合用具有協(xié)同抑制菌絲形成的作用，該研究為硬脂酸單甘油酯在抗真菌中的應(yīng)用提供了新的思路，但關(guān)于硬脂酸單甘油酯與卡泊芬凈合用的協(xié)同抗菌機制尚不明確。

Rogers等研究臨床常用的唑類、多烯類、棘白菌素類和嘧啶類的藥物作用于白念珠菌的轉(zhuǎn)錄組時發(fā)現(xiàn)，除了嘧啶類藥物外，其余幾類藥物作用于白念珠菌后，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因均會發(fā)生改變，這說明脂質(zhì)代謝在白念珠菌抵御藥物殺傷過程中十分重要?？ú捶覂糇饔糜诎啄钪榫螅舅崦摎涿窸le1p、肌醇-1-磷酸合成酶Ino1p、脂肪酸合成酶Fas1p、脂肪酸延長酶Fen12p等基因表達均發(fā)生改變[13]。Jin等通過蛋白組學(xué)考察卡泊芬凈對白念珠菌的被膜的抑制作用時，也發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈作用后脂肪酸合成酶Fas1p表達增加[14]。因此我們推測，硬脂酸單甘油酯加入培養(yǎng)基后，可以改變白念珠菌的脂質(zhì)代謝途徑，進而使其對卡泊芬凈更加敏感，但具體的信號通路和作用機制需要進一步的通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等方式深入研究。此外，動物體內(nèi)的脂肪中含有大量的硬脂酸，這些硬脂酸是否影響了卡泊芬凈的體內(nèi)抗真菌效果也值得進一步考察[15]。本研究雖然尚未闡明硬脂酸單甘油酯協(xié)同卡泊芬凈抗念珠菌的具體機制，但為卡泊芬凈的增敏劑研究和藥物劑型改造中輔料的選擇提供了新的思路。