姜 威，馬銀鵬，陸 佳，孟利強(qiáng)，胡基華，閻更軒，田 緣，張淑梅*

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江省能源環(huán)境研究院，黑龍江 哈爾濱 150027)

芽孢桿菌(Bacillus)是人類較早發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌之一，易于分離和純化，種類多，分布廣，是病害植物生物防治中的優(yōu)勢微生物種群[1]。芽孢桿菌在生長過程中產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的能力較強(qiáng)，可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，如脂肽類、抗菌蛋白類和聚酮類等化合物[2]。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)是芽孢桿菌屬中的新種屬，是由Madhaiyan等[3]于2010年率先從水稻的根際土壤中分離到的,其與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的16S rRNA基因序列同源性為98.2%～99.2%[4]，能利用非共價(jià)鍵低碳化合物[5]，代謝產(chǎn)物豐富，具有對外界環(huán)境條件的抗逆性和無毒無害無污染等優(yōu)勢，近年來被廣泛應(yīng)用于商業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[6]。

隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，以甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌抗菌蛋白基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建抗病基因工程植株或生防工程菌株已成為研究熱點(diǎn)。目前，已有部分生防芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物作為微生物源農(nóng)藥進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，如低分子量多肽類抗生素類[7-9]和抗菌蛋白類[10-12]。生防細(xì)菌的生防機(jī)制主要包括誘導(dǎo)機(jī)制、拮抗機(jī)制和競爭機(jī)制等，在抗菌過程中產(chǎn)生抗菌蛋白類、脂肽類和聚酮類等抗菌活性物質(zhì)[13]，其中抗菌蛋白是生防細(xì)菌作為生防制劑和植物抗病基因改良的基礎(chǔ)[14]。因此，對生防甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌產(chǎn)抗菌蛋白特性的研究和純化方法的摸索尤為重要。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Hg18是從玉米根部周圍的凍土中分離到的一株低溫生防菌株，作者對其所產(chǎn)抗菌蛋白進(jìn)行分離、純化和分析，以揭示其抗菌活性，為其作為一種潛在的生防資源提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

供試菌株：甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus) Hg18，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

1.2 生防甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Hg18抗菌蛋白的分離純化

1.2.1 抗菌粗蛋白的制備

將在LB固體培養(yǎng)基中活化好的Hg18菌株按2%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)液于4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，取上清液6份，分別加入20%、30%、40%、50%、60%、80%的(NH4)2SO4飽和溶液；將混合液置于4 ℃冰箱中靜置24 h，以析出蛋白沉淀；再于4 ℃、10 000 r·min-1離心20 min，棄上清液，沉淀用0.02 mmol·L-1(pH=8.0)的PBS緩沖液充分溶解，并用0.01 mmol·L-1(pH=7.0)的PBS緩沖液透析除鹽24 h，期間每隔4 h換一次緩沖液；冷凍干燥，即得不同濃度(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白。

取上述不同濃度(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白，用0.01 mmol·L-1PBS緩沖液溶解，以尖孢鐮刀菌為指示菌株，通過無菌發(fā)酵液抑菌活性實(shí)驗(yàn)測定抗菌粗蛋白的抑菌活性，以確定(NH4)2SO4飽和溶液的濃度。

1.2.2 抗菌蛋白的分離純化

1.2.2.1 凝膠過濾層析

參照王彪等[15]方法，將50%(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白在100 ℃水浴中加熱20 min，以去除雜蛋白；然后于12 000 r·min-1離心5 min；取上清液上樣于Sephadex S-75分子篩層析柱，用50 mmol·L-1(pH=7.0～7.4)的PBS緩沖液洗脫，流速為0.5～1.0 mL·min-1；測定洗脫液在280 nm處吸光度，收集各峰洗脫液，經(jīng)透析、濃縮、凍干后進(jìn)行抑菌活性檢測；對有抑菌活性的蛋白峰洗脫液進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，判斷是否需要進(jìn)行離子交換層析進(jìn)一步分離純化。

1.2.2.2 離子交換層析

將凝膠過濾層析得到的凍干樣品用20 mmol·L-1(pH=7.6)的Tris緩沖液溶解；上樣于DEAE Sepharose Fast Flow層析柱，先用Tris緩沖液洗脫，再用0～1.0 mol·L-1NaCl溶液進(jìn)行梯度不連續(xù)洗脫，流速為0.5～1.0 mL·min-1；測定洗脫液在280 nm處吸光度，收集各峰洗脫液，濃縮凍干后檢測抑菌活性。

1.2.2.3 SDS-PAGE

將離子交換層析得到的有抑菌活性的蛋白峰洗脫液用超濾管過濾濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE檢測。參照Laemmli等[16]方法，選擇12%的分離膠和5%的濃縮膠，用考馬斯亮藍(lán)G250染色1 h后用脫色液在搖床上輕搖脫色，直至條帶清晰、背景干凈為止。

1.3 生防甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Hg18抗菌蛋白的性質(zhì)研究

1.3.1 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

參照熊國如等[17]方法，采用牛津杯法檢測抗菌蛋白的熱穩(wěn)定性。將5份抗菌蛋白分別溶于0.2 mol·L-1(pH=7.0)的PBS緩沖液中，其中4份分別在40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下加熱處理60 min，1份在121 ℃加熱處理30 min；將100 μL尖孢鐮刀菌菌液涂布于PDA固體培養(yǎng)平板上，牛津杯放置在平板上；取50 μL加熱處理的抗菌蛋白加入到牛津杯中，將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果。以未加熱處理的抗菌蛋白作為空白對照。

1.3.2 酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將10份抗菌蛋白分別溶于0.2 mol·L-1(pH=7.0)的PBS緩沖液中，每份8 mL，然后用1 mol·L-1HCl溶液和1 mol·L-1NaOH溶液將pH值分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，終體積為10 mL；37 ℃水浴加熱4 h后將pH值調(diào)至中性，采用平皿打孔法檢測抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌效果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以自然pH值的抗菌蛋白作為空白對照。

1.3.3 紫外線穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將7份抗菌蛋白分別溶于0.2 mol·L-1(pH=7.0)的PBS緩沖液中，于超凈工作臺上用紫外燈分別照射3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、20 h、24 h，采用平皿打孔法檢測抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌效果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以未經(jīng)紫外燈照射的抗菌蛋白作為空白對照。

1.3.4 光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

參照李忠等[18]方法，將7份抗菌蛋白分別溶于0.2 mol·L-1(pH=7.0)的PBS緩沖液中，取2 mL于培養(yǎng)皿中，置于40 W日光燈(距光源40 cm)下分別照射3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、20 h、24 h，采用平皿打孔法檢測抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌效果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以未經(jīng)日光燈照射的抗菌蛋白作為空白對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌粗蛋白的抑菌活性

經(jīng)不同濃度(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白的無菌發(fā)酵液抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 經(jīng)不同濃度(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白的抑菌活性

由圖1可知，經(jīng)20%、40%、50%、60%、80%(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白對尖孢鐮刀菌均有很強(qiáng)的抑菌活性，而經(jīng)30%(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽的抗菌粗蛋白沒有抑菌活性。

2.2 抗菌粗蛋白的分離純化

通過50%(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽后的抗菌粗蛋白經(jīng)Sephadex S-75分子篩柱層析，共得到2個(gè)主吸收峰(圖2)；將2個(gè)吸收峰的洗脫液濃縮凍干后檢測抑菌活性，發(fā)現(xiàn)峰1有抑菌活性，峰2沒有抑菌活性(圖3左)；經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)峰1顯示單一條帶(圖3右)，表觀分子量約為25 kDa，說明抗菌蛋白獲得了有效分離。

圖2 抗菌粗蛋白Sephadex S-75分子篩柱層析純化結(jié)果

圖3 峰1和峰2的抑菌效果(左)及峰1的SDS-PAGE圖譜(右)

2.3 抗菌蛋白的性質(zhì)

2.3.1 熱穩(wěn)定性

溫度對抗菌蛋白抑菌率的影響如圖4所示。

由圖4可知，在100 ℃以下處理60 min，隨著溫度的升高，抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌率與對照相比變化不明顯；在121 ℃處理30 min，抑菌率較對照下降了24.4%。表明該抗菌蛋白對100 ℃以上的溫度比較敏感。

圖4 溫度對抗菌蛋白抑菌率的影響

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性

pH值對抗菌蛋白抑菌率的影響如圖5所示。

由圖5可知，在pH值為3.0～10.0范圍內(nèi)，抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌率與對照相比變化不明顯；在pH值為11.0和12.0時(shí)，抑菌率較對照分別下降了18.6%和19.4%。表明該抗菌蛋白在中性和酸性環(huán)境中穩(wěn)定，對強(qiáng)堿環(huán)境比較敏感。

圖5 pH值對抗菌蛋白抑菌率的影響

2.3.3 紫外線穩(wěn)定性

抗菌蛋白經(jīng)紫外線照射不同時(shí)間后，其對尖孢鐮刀菌的抑菌率如圖6所示。

由圖6可知，經(jīng)紫外線照射不同時(shí)間后，抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌率與對照相比無顯著變化，抑菌率為76.1%～79.2%。表明該抗菌蛋白對紫外線照射不敏感，具有較強(qiáng)的抗紫外線能力。

圖6 紫外線照射時(shí)間對抗菌蛋白抑菌率的影響

2.3.4 光穩(wěn)定性

抗菌蛋白經(jīng)日光燈照射不同時(shí)間后，其對尖孢鐮刀菌的抑菌率如圖7所示。

圖7 日光燈照射時(shí)間對抗菌蛋白抑菌率的影響

由圖7可知，經(jīng)日光燈照射不同時(shí)間后，抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌的抑菌率與對照相比無顯著變化，抑菌率為77.3%～79.6%。表明該抗菌蛋白對日光燈照射不敏感，具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

通過50%(NH4)2SO4飽和溶液沉淀透析除鹽，從生防甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Hg18中分離到抗菌粗蛋白，經(jīng)凝膠過濾層析、離子交換層析、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化得到抗菌蛋白，該抗菌蛋白對尖孢鐮刀菌有很強(qiáng)的抑菌活性，且抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，可以作為潛在的生防資源進(jìn)行開發(fā)與應(yīng)用。后續(xù)可基于該抗菌蛋白活性物質(zhì)的代謝角度和基因?qū)用孢M(jìn)行深入系統(tǒng)研究，明確其作用機(jī)制。