韓 英，藺佳文，呂曉楠，薛淑群，韓 玥

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，北京 100176）

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬于鮭形目、鮭科、大麻哈魚屬，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦的三大優(yōu)良淡水養(yǎng)殖品種之一。與普通二倍體虹鱒相比，三倍體雌性虹鱒具有不育、個(gè)體大、生長快、肉質(zhì)好等優(yōu)良品性[1]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應(yīng)用，需求量與日俱增。水中總氨氮指離子氨（NH4+）和分子氨（NH3-N）兩者含量總和，其中氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖主要脅迫因子之一。集約化養(yǎng)殖過程中，水中氨氮過量累積，對(duì)魚類造成不同程度影響，如改變體內(nèi)能量代謝[2]、降低機(jī)體免疫力[3]、抑制生長[4]。高濃度氨氮脅迫可使大口黑鱸[5（]Mi?cropterus salmoides）、 牙 鲆[6]（Paralichthys oliva?ceus）、黃顙魚[7（]Pelteobagrus fulvidraco）、鯉[8（]Cyp?rinuscarpio）發(fā)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)、機(jī)體免疫力降低甚至導(dǎo)致死亡。

傳統(tǒng)虹鱒養(yǎng)殖多采用流水養(yǎng)殖方式，近年來隨網(wǎng)箱養(yǎng)殖及陸基養(yǎng)殖迅速發(fā)展，因水體交換率不足或循環(huán)水處理效果不佳，水體氨氮含量升高而造成損失時(shí)有發(fā)生。研究表明，三倍體魚類對(duì)環(huán)境脅迫耐受性較差，辛苑茹等研究發(fā)現(xiàn)，三倍體虹鱒對(duì)高溫環(huán)境更為敏感，需要消耗更多能量用于抵抗高溫脅迫[9]；Leal等發(fā)現(xiàn)三倍體高首鱘（Acipenser transmontanus）相比二倍體對(duì)環(huán)境脅迫有更高敏感性[10]。

三倍體魚類較二倍體增加一套染色體，二者生物學(xué)特性上存在一定差異，了解這種差異對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)十分必要，而目前有關(guān)三倍體雌性虹鱒對(duì)氨氮耐受性研究尚屬空白。本研究采用組織學(xué)、生理學(xué)及分子生物學(xué)方法，通過觀察氨氮急性脅迫下二、三倍體雌性虹鱒鰓組織病理學(xué)變化，測定血液生理生化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)變化，以及免疫與應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，比較分析二、三倍體雌性虹鱒（以下簡稱2n、3n）耐受性及抗應(yīng)激能力的生理調(diào)控差異，以期為其養(yǎng)殖生產(chǎn)及應(yīng)激保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

二、三倍體雌性虹鱒來源于哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)分院，遺傳背景相同，平均體重為（200±10）g。試驗(yàn)開始前在100 cm×50 cm×50 cm（有效水體體積為200 L）水族箱中暫養(yǎng)3周。試驗(yàn)水溫（16.0±0.5）℃，溶解氧（7.8±0.2）mg·L-1，pH 7.85，氨氮（0.07±0.1）mg·L-1，光照周期為12 h∶12 h。暫養(yǎng)期間飽食投喂，每日在8:00、12:00和16:00定時(shí)投喂虹鱒商品飼料，試驗(yàn)開始前2 d停食。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司），PCR儀（美國Thermo公司），熒光定量PCR儀（美國Roche，Light Cycler 2.0），血細(xì)胞分析儀（日本NI?HONKOHDEN公司）。

試劑：SOD、CAT活力以及MDA和COR含量檢測試劑盒（購自南京建城生物工程研究所）；Bio?Fast?Simply P?Total RNA Extraction Kit試劑盒、BioRT?Master HiSensi?cDNA First Strand Synthesis kit試劑盒和BioEasy?Master Mix（SYBRGreen,High ROX）Real Time PCRKit試劑盒（購自杭州博日科技有限公司）；其他常規(guī)藥品及試劑均為國產(chǎn)。

1.3 96 h半致死濃度（96 h-LC50）

通過急性毒性效應(yīng)預(yù)試驗(yàn)，確定急性氨氮脅迫適宜濃度。根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]對(duì)虹鱒氨氮脅迫研究，總氨氮（TAN）濃度等對(duì)數(shù)間距設(shè)定為16.42、24.32、36.06、53.82和80.09 mg·L-1，即非離子氨（NH3-N）濃度為0.40、0.59、0.88、1.31和1.96mg·L-1。每隔7 h通過預(yù)配NH4Cl母液校準(zhǔn)試驗(yàn)水體氨氮濃度?？偘钡獫舛葴y定采用納氏試劑法[13]。統(tǒng)計(jì)2n、3n在不同氨氮濃度下96 h死亡率，得出96 h-LC50。

1.4 急性氨氮脅迫試驗(yàn)

以經(jīng)充分曝氣自來水為對(duì)照組，設(shè)置低、中、高3個(gè)氨氮處理組，其TAN濃度分別為16.42 mg·L-1（A組）、24.32 mg·L-（1B組）和36.06 mg·L-（1C組），NH3-N濃度分別為0.40 mg·L-（1A組）、0.59 mg·L-1（B組）和0.88 mg·L-（1C組）。每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行20尾魚。脅迫時(shí)間為96 h，試驗(yàn)期間停飼，每日更換1/3水，及時(shí)清理排泄物及死魚，用NH4Cl儲(chǔ)備液調(diào)節(jié)以穩(wěn)定養(yǎng)殖水體氨氮濃度。

1.5 樣本采集

24、48、72和96 h取樣。為避免捕撈刺激造成二次應(yīng)激，用250 mg·L-1MS-222將魚麻醉后隨機(jī)采樣，每個(gè)平行取3尾（n=9）。將魚置于無菌冰盤，采集鰓絲和肝組織，用4%多聚甲醛固定；尾靜脈取血，全血樣本置于抗凝管中4℃保存，2 d內(nèi)檢測血液生理指標(biāo)；血樣置于4℃靜置24 h后，4℃、4 000 r·min-1離心15 min，制備血清，用于檢測血液應(yīng)激指標(biāo)；采集36.06 mg·L-1組肝臟放于液氮中速凍并存儲(chǔ)于-80℃，用于相關(guān)基因檢測。

1.6 血液生理生化分析

采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測量血液樣品WBC、RBC及HGB含量。根據(jù)檢測試劑盒說明檢測血清中SOD、CAT活力以及MDA和COR含量。

1.7 組織病理學(xué)檢查

將固定在4%多聚甲醛溶液中鰓組織通過系列梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋、修整，切片厚度5~6 mm，置于37℃烘箱中烘烤過夜。切片經(jīng)蘇木精和伊紅（H&E）染色，中性樹脂膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.8 免疫與應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)

采用qRT-PCR方法檢測36.06 mg·L-1組2n、3n肝臟基因表達(dá)水平。用BioFast?Simply P?Total RNA Extraction Kit試劑盒從肝臟中提取總RNA，用BioRT?Master HiSensi?cDNA First Strand Synthesis kit試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用BioEasy?Master Mix（SYBR Green,High ROX）Real Time PCR Kit，在LightCycler 2.0中實(shí)時(shí)定量PCR。具體引物（見表1）由生工公司（上海）合成。反應(yīng)程序設(shè)置采用兩步法：95℃預(yù)變性1 min；95℃15 s，60℃1 min，35個(gè)循環(huán)。融解曲線程序設(shè)置如下：95℃1 min；65℃1 min；95℃20 s；30℃1 min。以β-Actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)其表達(dá)量作標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0雙因素方差分析，用Duncan氏法作多重比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。“*”代表同一時(shí)間2n、3n差異顯著（P<0.05），“**”代表同一時(shí)間2n、3n差異極顯著（P<0.01）；不同字母表示同一倍性不同處理組不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著（P<0.05），其中小寫字母代表2n，大寫字母代表3n。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫下二、三倍體雌性虹鱒96 h半致死濃度

通過加權(quán)回歸分析，得到氨氮對(duì)2n、3n的TAN 96 h-LC50分別為38.176和33.864 mg·L-1，二、三倍體NH3-N 96 h-LC50分別為0.931和0.825 mg·L-1（見表2）。

2.2 氨氮脅迫下二、三倍體雌性虹鱒血細(xì)胞變化

A組2n的WBC含量在48 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3n的WBC含量在24 h顯著升高，3n在24、72和96 h顯著高于2n（P<0.05）；B組2n、3n的WBC含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3n在24、48和72 h顯著高于2n（P<0.05）；C組2n、3n的WBC含量呈先升后降趨勢(shì)，24 h達(dá)到峰值，顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3n在24 h顯著高于2n（P<0.05，見圖1A）。

對(duì)照組2n的RBC含量顯著高于3n；A組2n、3n的RBC含量在72、96 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），2n在96 h顯著高于3n（P<0.05）；B組2n、3n的RBC含量在24 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），后呈下降趨勢(shì)，96 h顯著低于對(duì)照組（P<0.05），2n在24、96 h顯著高于3n（P<0.05）；C組2n、3n的RBC含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），2n在96 h顯著高于3n（P<0.05，見圖1B）。

A組2n的HGB含量在72、96 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3n的HGB含量在48 h、72 h和96 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3n在72 h顯著高于2n（P<0.05）；B組2n、3n的HGB含量呈先升后降趨勢(shì)，24 h達(dá)到峰值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），在96 h顯著低于對(duì)照組（P<0.05），3n在24、48 h顯著高于2n（P<0.05）；C組2n、3n的HGB含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），2n在24 h、48 h和72 h顯著高于3n（P<0.05，見圖1C）。

表2 96 h氨氮、非離子氨半致死濃度Table 2 96 h semi-lethal concentration of ammonia nitrogen and nonionic ammonia to 2n and 3n

2.3 氨氮脅迫下二、三倍體虹鱒血清COR及抗氧化指標(biāo)變化

A、B組2n、3n的COR含量呈先升后降趨勢(shì)（P<0.05），2n在48 h達(dá)到峰值，3n在72 h達(dá)到峰值。A組3n的COR含量在72、96 h顯著高于2n（P<0.05），B組3n的COR含量在72 h顯著高于2n（P<0.05）。C組2n、3n的COR含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05，見圖2A）。

A組2n的SOD活性在24、48和72 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），3n的SOD活性在48 h顯著高于對(duì)照組（P<0.05），2n的SOD活性在24 h顯著高于3n（P<0.05）。B組2n、3n的SOD活性呈顯著上升趨勢(shì)（P<0.05）。C組2n、3n的SOD活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05，見圖2B）。

A組2n、3n的CAT活性呈先升后降趨勢(shì)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05）；2n在24 h達(dá)到峰值，3n在48 h達(dá)到峰值，2n的CAT活性在24h顯著高于3n（P<0.05），3n的CAT活性在96 h顯著高于3n（P<0.05）。B、C組2n、3n的CAT活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05，見圖2C）。

A組2n、3n的MDA含量呈先升后降趨勢(shì)，與對(duì)照組差異顯著（P<0.05），3n的MDA含量在24、48 h顯著高于2n（P<0.05）。B、C組2n、3n的MDA含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。B組3n的MDA含量在24 h、72 h顯著高于2n（P<0.05，見圖2D）。

2.4 氨氮脅迫下二、三倍體雌性虹鱒鰓組織觀察

對(duì)照組鰓組織未顯示任何明顯病理變化（見圖3A、C）。氨氮脅迫下，2n鰓小片粘連，有較多炎性細(xì)胞聚集，細(xì)胞空泡化（見圖3B）。3n氨氮組鰓絲中央靜脈竇擴(kuò)張，可見廣泛性炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，整體損傷變形程度較大（見圖3D）。

圖1 2n、3n雌性虹鱒血細(xì)胞變化Fig.1 2n,3n female rainbow trout blood cell levels

2.5 高濃度氨氮脅迫下二、三倍體雌性虹鱒肝臟促炎因子基因表達(dá)

與對(duì)照組相比，36.06 mg·L-1組2n、3n肝臟TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.05）。3n肝臟TNF-αmRNA表達(dá)量在72 h和96 h顯著高于2n（P<0.01，見圖4A）；3n肝臟IL-1βmRNA表達(dá)量在48 h顯著高于2n（P<0.05），72 h和96 h極顯著高于2n（P<0.01，見圖4B）；3n肝臟IL-6 mRNA表達(dá)量在48、72和96 h極顯著高于2n（P<0.01，見圖4C）；3n肝臟IL-8 mRNA表達(dá)量在24、72和96 h極顯著高于2n（P<0.01，見圖4D）。

2.6 高濃度氨氮脅迫下二、三倍體雌性虹鱒肝臟熱休克蛋白基因表達(dá)

36.06 mg·L-1組2n、3n肝臟HSP70 mRNA表達(dá)量24 h后顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。2n肝臟TNF-α mRNA表達(dá)量在96 h極顯著高于3n（P<0.01，見圖5A）。36.06 mg·L-1組2n、3n肝臟HSP90 mRNA表達(dá)量均在48 h后顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；2n肝組織HSP90 mRNA表達(dá)量在72和96 h極顯著高于3n（P<0.01，見圖5B）。

圖2 2n、3n雌性虹鱒血清COR、SOD、CAT、MDA含量變化Fig.2 Levels of COR,SOD,CAT and MDA in 2n and 3n female rainbow trout serum

圖3 96 h氨氮脅迫后2n、3n雌性虹鱒鰓組織變化Fig.3 Tissue sections of 2n and 3n femalerainbow trout gill filaments under ammonia nitrogen stress for 96 h

圖4 2n、3n雌性虹鱒肝臟中促炎因子基因表達(dá)Fig.4 2n,3n femalerainbow trout cell factor geneexpression in theliver

圖5 2n、3n雌性虹鱒肝臟中HSP70、HSP90基因表達(dá)Fig.5 2n,3n female rainbow trout HSP70 and HSP90 gene expression in the liver

3 討論

養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，水體氨氮超標(biāo)，極易造成養(yǎng)殖魚類大規(guī)模死亡。研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致魚類氨中毒死亡重要因素之一[5]。3n的NH3-N 96 h-LC50低于2n，說明3n對(duì)氨氮耐受性差于2n。

水體中過量氨氮侵入魚類體內(nèi)降低其攜氧能力，影響呼吸系統(tǒng)，損傷組織黏膜，破壞鰓絲結(jié)構(gòu)，影響肝臟生理功能，引起體表及內(nèi)臟充血、腫大，最終導(dǎo)致其昏迷甚至死亡[14]。對(duì)泥鰍（Mis?gurnus anguillicaudatus）[15]和青魚（Mylopharyngodon piceus）[16]研究表明，長期或短期氨氮脅迫均導(dǎo)致鰓小片損傷、炎癥細(xì)胞增多、細(xì)胞水腫甚至壞死，鰓組織無法行使正常生理功能。本研究中，在36.06 mg·L-1氨氮濃度下3n鰓組織損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞空泡化；2n亦觀察到相似組織學(xué)變化，但損傷程度輕，說明氨氮脅迫對(duì)3n鰓組織損傷較2n更為嚴(yán)重。

血細(xì)胞是評(píng)估魚類毒性影響重要指標(biāo)[17]。Kim等研究表明，氨氮脅迫顯著降低石斑魚（Epinephelus coioides）紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白水平[18]。Yang等也提出，氨氮脅迫導(dǎo)致鯽（Carassiusauratus）血液RBC和HGB含量顯著減少[19]。Hoseini等發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫下，鯉（Cyprinus carpio）自由基累積，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜損傷，RBC數(shù)量降低[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨氨氮脅迫濃度升高，RBC、HGB含量先升后降，說明2n、3n通過提高RBC、HGB含量，抵御較低濃度氨氮脅迫；這種抗應(yīng)激能力有一定限度，過高濃度氨氮脅迫對(duì)RBC造成損傷，使HGB降低，導(dǎo)致貧血。在高濃度（36.06 mg·L-1）氨氮脅迫下，2n的RBC、HGB含量顯著高于3n（P<0.05），說明高濃度氨氮脅迫對(duì)于3n血液攜氧能力影響較2n嚴(yán)重。

WBC是動(dòng)物體內(nèi)重要免疫細(xì)胞，鰱（Hypoph?thalmichthys molitrix）[21]受到環(huán)境脅迫影響時(shí)，RBC、HGB含量顯著下降，WBC含量顯著上升。本研究中，隨氨氮脅迫濃度升高，2n、3n的WBC、RBC、HGB含量均呈先升后降。Kim等研究表明，當(dāng)氨氮濃度過高，造成石斑魚免疫抑制降低WBC含量，與本研究結(jié)果一致[18]。在低濃度（16.42 mg·L-1）、中濃度組（24.32 mg·L-1）2n最先到達(dá)峰值且低于3n，高濃度組（36.06 mg·L-1）3n的WBC含量下降速度快于2n，表明3n較2n對(duì)氨氮脅迫更敏感，應(yīng)激反應(yīng)更劇烈且持續(xù)時(shí)間更長。2n與3n的WBC變化趨勢(shì)一致，3n顯著高于2n，表明3n較2n對(duì)氨氮脅迫的應(yīng)激反應(yīng)更劇烈。

COR是魚類抗應(yīng)激反應(yīng)主要途徑HPI軸的主要介質(zhì)，被認(rèn)定為初級(jí)應(yīng)激反應(yīng)重要指標(biāo)。當(dāng)魚體受到高濃度氨氮脅迫時(shí)，導(dǎo)致魚體內(nèi)COR含量上升，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），抗氧化酶如SOD、CAT等可清除多余ROS，但清除效率受脅迫持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度影響。MDA作為脂質(zhì)過氧化最終產(chǎn)物的一種，反映組織過氧化損傷程度[22-23]。Li等報(bào)道高濃度氨氮脅迫下黃顙魚SOD、CAT活性先升高后逐漸降低結(jié)果一致，推測SOD、CAT活性下降與氧化反應(yīng)最終產(chǎn)物MDA含量累積有關(guān)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，受到氨氮脅迫后，2n、3n血清SOD和CAT活性均呈先升后降趨勢(shì)，2n、3n血清COR、MDA含量呈上升趨勢(shì)且顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。此外，在黃顙魚[7]、鯔（Mugil cephalus）[25]中MDA含量均有相同趨勢(shì)。氨氮脅迫使3n血清SOD、CAT活性低于2n，MDA含量高于2n，說明在本試驗(yàn)條件下，2n抗氧化能力強(qiáng)于3n，且應(yīng)對(duì)速度更快，MDA含量較低也表明其所受的氧化損傷較輕。

TNF-α是一種多效性促炎細(xì)胞因子，可激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥相關(guān)基因表達(dá)[26]。氨氮脅迫誘導(dǎo)黃顙魚肝臟TNF-α、IL-1-β和IL-8基因mRNA高表達(dá)[7]；氨氮脅迫誘導(dǎo)暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）肝臟BAFF，TNF-α、IL-6和IL-12基因表達(dá)量上升[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，氨氮脅迫下，2n、3n肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表達(dá)量顯著升高，且隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，與上述研究結(jié)果一致。3n促炎因子相對(duì)表達(dá)量顯著高于2n，推測相同氨氮濃度脅迫下，3n肝臟炎癥反應(yīng)較2n嚴(yán)重。

熱休克蛋白（HSPs）作為避免生物體遭受氧化應(yīng)激傷害的一種自我保護(hù)系統(tǒng)，具有抗氧化生物活性，當(dāng)暴露于環(huán)境應(yīng)激中，機(jī)體通過激活熱休克基因合成HSPs。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫下2n、3n肝臟HSP70、HSP90基因的mRNA表達(dá)量呈顯著上升趨勢(shì)，表明HSP70、HSP90基因在高濃度氨氮脅迫下能夠作出積極應(yīng)答，與對(duì)暗紋東方鲀同類研究一致[27]。辛苑茹等對(duì)急性高溫脅迫下虹鱒幼魚HSP基因表達(dá)變化檢測中也得到類似結(jié)果[9]。試驗(yàn)結(jié)果表明，氨氮脅迫下，2n肝臟HSP70、HSP90基因表達(dá)在72 h后顯著高于3n，推測2n具有更強(qiáng)應(yīng)激調(diào)節(jié)能力，對(duì)氨氮脅迫耐受程度強(qiáng)于3n。

綜上所述，隨氨氮濃度升高，與二倍體相比，三倍體雌性虹鱒血細(xì)胞變化波動(dòng)更明顯，應(yīng)激標(biāo)志物COR、脂質(zhì)氧化最終產(chǎn)物MDA含量更高，抗氧化酶SOD、CAT酶活性較弱。在36.06 mg·L-1氨氮濃度下，三倍體雌性虹鱒鰓組織病理損傷嚴(yán)重，促炎因子表達(dá)量高，熱休克蛋白基因表達(dá)量低。研究結(jié)果表明，與二倍體虹鱒相比，三倍體雌性虹鱒對(duì)氨氮脅迫更為敏感，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)能力較弱，氨氮耐受性較差。