單大鵬，王曉云，洪志鵬，王子葉，馮廣慧，孟凡立

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

大豆因富含蛋白質(zhì)和油脂等營養(yǎng)成分，在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于食品加工、動物飼料及工業(yè)原料等行業(yè)[1]。近年來，隨著人們對生活品質(zhì)和保健等方面意識增強，大豆市場需求逐漸增加。然而，我國自產(chǎn)大豆無法滿足生產(chǎn)生活需求，仍需大量進口。提高大豆產(chǎn)量、減少大豆因蟲害、病害帶來的經(jīng)濟損失已成為世界關(guān)注熱點。

鱗翅目害蟲引起玉米、大豆、油菜、棉花等作物減產(chǎn)，對我國乃至全球農(nóng)業(yè)發(fā)展造成巨大損失[2]。蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在生長過程中產(chǎn)生由cry和cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs）[3]，其對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、半翅目、直翅目、膜翅目害蟲具有特異活性[4]。2010~2012年，巴西和阿根廷先后開始商業(yè)化種植Bt大豆。2017年巴西研發(fā)一個表達Cry1Ac、Cry1F和膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）蛋白的Bt大豆品種DAS814192（ConkestaTM技術(shù)），該品種對鱗翅目昆蟲具有較高抗性[5]。過表達Cry1A蛋白轉(zhuǎn)基因大豆顯著降低鱗翅目昆蟲種群密度，尤其是大豆夜蛾、大豆尺蠖夜蛾和長須夜蛾[6]。Bernardi等發(fā)現(xiàn)Bt大豆（表達Cry1Ac蛋白的MON 87701×MON 87788）在實驗室對鱗翅目昆蟲大豆尺蠖夜蛾（夜蛾科）和大豆夜蛾（鱗翅目：直立目）具有抗性[7]。

Ruizde Escudero等研究已表明，Cry1Ia39蛋白對紅腹溞幼蟲毒性作用不顯著，但產(chǎn)生一定體重抑制作用[8]。Quemada等將Cry1Ia基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯中，成功減弱馬鈴薯麥蛾危害[9]。Silva等將Cry1Ia基因轉(zhuǎn)入棉花，提高轉(zhuǎn)基因棉花對鱗翅目害蟲棉鈴蟲和黏蟲抗性，且產(chǎn)生與受體植株同樣表型花和種子[10]。Boncheva等在生物測定中發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾對Cry1Ia1敏感性[11]。Cry1Ia7、Cry1Ia10、Cry1Ia12和Cry1Ia13對草地貪夜蛾有毒性[12]。因此，開發(fā)具有Cry1Ia蛋白轉(zhuǎn)基因植物對控制鱗翅目害蟲具有重要應用前景。本研究對轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆株系KE1分析鱗翅目害蟲抗性，為培育抗鱗翅目靶標害蟲大豆新品系提供基礎(chǔ)性材料。

1 材料與方法

1.1 供試植物材料

轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆，轉(zhuǎn)基因大豆KE1表達Cry1Ia抗蟲蛋白，同時以Bar基因為篩選標記，供試用轉(zhuǎn)基因大豆材料由東北農(nóng)業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室保存。非轉(zhuǎn)基因親本對照種子墾農(nóng)18由黑龍江省八一農(nóng)墾大學朱洪德教授提供。

1.2 供試昆蟲

本試驗中室內(nèi)和大田所用昆蟲為大豆靶標害蟲。黏蟲卵、斜紋夜蛾卵、甜菜夜蛾卵從河南省濟源白云實業(yè)有限公司購買并在實驗室孵化為一齡幼蟲；大豆食心蟲幼蟲2019年8月15日采集于東北農(nóng)業(yè)大學。

1.3 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1遺傳穩(wěn)定性分析

1.3.1 植物基因組DNA提取

將轉(zhuǎn)基因株系KE1的T3~T5代種子同時在溫室中種植，選取長勢較好再生植株幼嫩葉片，選用康為世紀生物科技有限公司DNA提取試劑盒提取葉片總DNA，用于PCR檢測陽性植株。

1.3.2 利用Primer 5.0設(shè)計引物

利用Primer 5.0設(shè)計目的基因Cry1Ia引物序列如下，Cry1Ia-F：GGCATCTGTGACTTGTCTAGAA TTCGG，Cry1Ia-R：TCAAGGAGACTTGTACCATC CCCATG，擴增產(chǎn)物長度約為200 bp。利用Primer 5.0設(shè)計篩選標記基因Bar引物序列如下，Bar-F：GCGGTACCGGCAGGCTGAAG，Bar-R：CCGCAGG AACCGCAGGAGTG，擴增產(chǎn)物長度約為238 bp。

1.3.3 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的PCR檢測

提取大豆葉片總DNA后，分別用Cry1Ia和Bar基因特異引物在Eppendorf PCR儀上擴增。模板為植物基因組總DNA，陽性對照為pCAMBIA3301-Cry1Ia質(zhì)粒，陰性對照為未轉(zhuǎn)入Cry1Ia基因植株DNA。以ddH2O為空白對照。兩個基因擴增反應體系相同。反應體系如下，Cry1Ia基因PCR擴增條件：94℃預變性5 min；35個循環(huán)；94℃變性30 min，50℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃終延伸10 min；4℃終止反應。Bar基因PCR擴增條件：94℃預變性5 min；35個循環(huán)；94℃變性30 min，58℃退火30 s，72℃延伸30 s；72℃終延伸10 min；4℃終止反應。PCR產(chǎn)物檢測：取5μL擴增產(chǎn)物，加1μL 6×loading Buffer混勻，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分析儀觀察并拍照。

1.3.4 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的Western blot檢測

從田間選取轉(zhuǎn)基因陽性植物和對照植株新鮮未成熟葉片、花、籽粒和莢皮組織，提取總蛋白。12%SDS-PAGE上分離轉(zhuǎn)基因植株總蛋白（約40μg）。分離后蛋白使用轉(zhuǎn)膜設(shè)備轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF膜）上。然后利用脫脂牛奶對PVDF膜上的非特異性位點作封閉。一抗為鼠抗Cry1Ia蛋白抗血清，稀釋濃度為1∶100；另一個為鼠抗Bar-PAT蛋白單克隆抗體，稀釋濃度為1∶10 000。二抗為辣根過氧化物酶標記兔抗鼠抗體，稀釋濃度隨一抗的稀釋濃度成倍遞增或遞減。經(jīng)蛋白雜交和洗膜后，使用化學發(fā)光蛋白質(zhì)印跡試劑盒中A、B液（1∶1）在膜上直接顯色，1 min后利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)照相。

1.3.5 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的ELISA檢測

在大豆生長結(jié)莢期，從田間采集轉(zhuǎn)基因陽性植株和對照植株新鮮葉片、花、子粒和莢皮部位組織，用錫紙包裹后立即放入液氮，用研缽將樣品充分研磨，離心并適當稀釋上清液后，按照廠商說明書作雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA法），分析外源蛋白Cry1Ia和Bar在轉(zhuǎn)基因陽性植株不同組織中表達水平。通過繪制標準曲線計算樣品中Cry1Ia和Bar蛋白濃度。

1.4 甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、黏蟲室內(nèi)抗蟲性鑒定

當室內(nèi)種植轉(zhuǎn)基因材料KE1的T3和T4代以及受體材料墾農(nóng)18第4個三出復葉完全展開時，取大豆植株頂部展開第3個三出復葉置于培養(yǎng)皿濕濾紙上，葉柄一端用濕棉花包裹，外包封口膜防止葉片失水，每個材料重復測定4次。幼蟲培養(yǎng)方式、光照周期等處理參考徐曉麗等[13]。在接蟲后3 d利用葉面積儀測定幼蟲取食大豆品種葉面積，計算葉面積損失率，同時記錄幼蟲死亡率和體重。取食3 d時，對轉(zhuǎn)基因材料KE1和受體品種葉面積損失率和抗性作分級，分級標準見表1。

表1 葉片損害鑒定分級標準Table1 Classification criteria for bladedamageidentification

食用轉(zhuǎn)基因品種KE1和墾農(nóng)18幼蟲平均校正死亡率、平均體重抑制百分率計算參考文獻[14]。采用方差分析法比較轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆品種KE1和對應非轉(zhuǎn)基因大豆品種墾農(nóng)18幼蟲平均校正死亡率和平均體重抑制百分率差異。

1.5 大豆食心蟲田間抗蟲性鑒定

2019年5 月上旬將KE1 T3代和T4代轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧蠅ㄞr(nóng)18播種于抗蟲網(wǎng)室內(nèi)。大豆食心蟲田間抗蟲性鑒定方法和單株蟲食率計算參考錢雪艷等方法[15]。

表2 大豆食心蟲田間抗性鑒定標準Table2 L.glycinivorella Matsumura resistancein thefield evaluation criteria

1.6 數(shù)據(jù)整理與分析

運用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1遺傳穩(wěn)定性分析

2.1.1 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的PCR檢測

分別利用Cry1Ia和Bar基因引物對轉(zhuǎn)基因株系KE1的T3~T5代植株作PCR檢測，在轉(zhuǎn)基因株系KE1的T3~T5代植株中均檢測到200 bpCry1Ia目的條帶和238 bpBar目的條帶（見圖1），表明轉(zhuǎn)基因株系KE1中目的基因Cry1Ia和篩選基因Bar在T3~T5代中連續(xù)穩(wěn)定遺傳。

2.1.2 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的Western blot檢測

為分析轉(zhuǎn)錄的Cry1Ia和Bar是否翻譯成蛋白質(zhì)以及在葉片、花、未成熟籽粒和莢皮等不同組織中蛋白質(zhì)表達是否存在差異，利用武漢上成公司制備的Cry1Ia和Bar蛋白多克隆抗體對T4代開花結(jié)莢期根、莖、葉、花和莢皮不同組織中目的基因及標記基因表達蛋白作Western blot雜交分析。Western blot雜交表明，外源蛋白Cry1Ia在轉(zhuǎn)基因大豆中獲得表達，Cry1Ia蛋白約為81.05 ku，與預期一致。在KE1的T4代根、莖、葉片和莢皮中均檢測到81 ku蛋白條帶，與預期Cry1Ia蛋白一致，而受體墾農(nóng)18未檢測到81 ku蛋白條帶（見圖2），說明整合到墾農(nóng)18大豆基因組上的Cry1Ia在根、莖、葉片和莢皮中均翻譯成蛋白。

圖1 轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測Fig.1 PCR detection of genetically modified soybeans

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆Cry1Ia蛋白Western blot檢測Fig.2 Detection of Cry1Ia protein in transgenic soybean by Western blot

Western blot雜交表明，外源蛋白Bar在轉(zhuǎn)基因大豆中獲得表達，Bar蛋白約為21 ku，與預期一致。在KE1的T4代根、莖、葉片、花、莢皮中均檢測到21 ku蛋白條帶，與預期Bar蛋白一致，而受體墾農(nóng)18未檢測到21 ku蛋白條帶（見圖3），說明整合到墾農(nóng)18大豆基因組上的Bar在根、莖、葉片、花、莢皮中均翻譯成蛋白。

圖3 轉(zhuǎn)基因大豆Bar蛋白Western blot檢測Fig.3 Detection of Bar protein in transgenic soybean by Western blot

2.1.3 轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1的ELISA檢測

利用ELISA試劑盒對轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1中Cry1Ia蛋白定量分析，標準曲線為y=0.2416x+0.2437（R2=0.9958）。結(jié)果表明，Cry1Ia蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆KE1生長不同時期及不同組織部位均表達（見表3）。T3代Cry1Ia蛋白在苗期（V3）根、莖和葉片中表達含量分別為0.105±0.000、1.350±0.001和1.967±0.067μg·g-1。Cry1Ia蛋白在開花結(jié)莢期（R2）根、莖、葉片、花和莢皮中分別為0.242±0.008、0.873±0.052和0.632±0.035、0.221±0.040和0.157±0.020μg·g-1。在鼓粒期（R6）根、莖、葉片和籽粒中分別為0.081±0.024、1.240±0.195、2.630±0.089和2.020±0.031μg·g-1。在成熟期（R8）根、莖、葉片和籽粒中分別為0.146±0.024、2.287±0.189、5.308±0.280和6.020±0.634μg·g-1。分析T3和T4連續(xù)2代4個時期不同組織中Cry1Ia蛋白含量，結(jié)果表明Cry1Ia蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆器官樣品中均可檢測到，不同器官中目的蛋白含量具有一定變化，總體說，大豆籽粒Cry1Ia蛋白含量相對最高，根中含量相對較低。

表3 Cry1Ia蛋白在轉(zhuǎn)基因株系KE1 T 3~T 4代4個時期不同組織表達量分析Table3 Analysis of Cry1Ia protein expression in different tissuesof transgenic line KE1 T 3-T 4 in four periods

利用ELISA分析標記蛋白Bar（PAT）表達水平表明，標準曲線為y=0.1888x+0.033（R2=0.9947）。Bar在轉(zhuǎn)基因大豆KE1生長不同時期及不同組織部位均表達（見表4）。T3代Bar蛋白在苗期（V3）根、莖和葉片中表達含量分別為0.537±0.001、0.698±0.035和0.882±0.045μg·g-1。Bar蛋白在開花結(jié)莢期（R2）根、莖、葉片、花和莢皮中分別為2.350±0.021、2.690±0.032、2.970±0.102、1.120±0.078和3.153±0.315μg·g-1。在鼓粒期（R6）根、莖、葉片和籽粒中別為1.450±0.001、2.530±0.002、2.460±0.005和3.470±0.003μg·g-1。在成熟期（R8）根、莖、葉片、花和籽粒中分別為3.450±0.357、4.950±0.561、4.490±0.256、4.050±0.376和4.160±0.236μg·g-1。分析T3和T4連續(xù)2代4個時期不同組織中Bar蛋白含量，結(jié)果表明Bar蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆器官樣品中均可檢測到，不同器官中目的蛋白含量有一定時空變化。

表4 Bar蛋白在轉(zhuǎn)基因株系KE1 T 3~T4代4個時期不同組織表達量分析Table 4 Analysis of Bar protein expression in different tissues of T 3-T 4 generation of transgenic line KE1 in four periods

2.2 甜菜夜蛾抗性分析

本試驗利用KE1 T5代陽性植株R1期離體葉片與受體墾農(nóng)18葉片分別喂食一齡甜菜夜蛾幼蟲，作甜菜夜蛾室內(nèi)生測，鑒定結(jié)果表明，甜菜夜蛾一齡幼蟲取食KE1葉片3 d后，T5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片損失率為9.76%±2.49%，表現(xiàn)為高抗性，而對照葉片損失率為81.29%±12.54%，表現(xiàn)為感性（見圖4）。KE1 T5代校正死亡率為85.57%±8.08%。同時KE1 T5代平均體重抑制百分率為26.21%±7.74%。因此，轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片對甜菜夜蛾幼蟲抗性顯著高于受體墾農(nóng)18，對甜菜夜蛾幼蟲表現(xiàn)較高抗性。

2.3 斜紋夜蛾抗性分析

本試驗利用KE1 T5代陽性植株R1期離體葉片與受體墾農(nóng)18葉片分別喂食一齡斜紋夜蛾幼蟲，作斜紋夜蛾室內(nèi)生測，鑒定結(jié)果表明，斜紋夜蛾一齡幼蟲取食KE1葉片3 d后，T5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片損失率分別為6.11%±4.56%，表現(xiàn)為高抗性，而對照葉片損失率為85.12%±14.08%，表現(xiàn)為感性（見圖5）。KE1 T5代校正死亡率為83.78%±12.18%。同時KE1 T5代平均體重抑制百分率為57.15%±19.51%。因此，轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片對斜紋夜蛾幼蟲表現(xiàn)較高抗性。

2.4 黏蟲抗性分析

本試驗室利用KE1 T5代陽性植株R1期離體葉片與受體墾農(nóng)18葉片分別喂食一齡黏蟲，作黏蟲室內(nèi)生測，鑒定結(jié)果表明，黏蟲幼蟲取食KE1葉片3 d后，T5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片損失率為6.48%±3.49%，表現(xiàn)高抗性，而對照葉片損失率為74.08%±11.08%，表現(xiàn)為感性（見圖6）。KE1 T5代校正死亡率為80.51%±8.99%。同時KE1 T5代平均體重抑制百分率為35.73%±16.27%。因此，轉(zhuǎn)基因大豆KE1葉片對黏蟲幼蟲表現(xiàn)較高抗性。

2.5 大豆食心蟲田間抗性分析

在抗蟲網(wǎng)室內(nèi)種植KE1 T2~T3代陽性植株和受體墾農(nóng)18，8月初放入大豆食心蟲成蟲，轉(zhuǎn)基因陽性植株成熟后，分析KE1株系和受體墾農(nóng)18抗蟲性狀，鑒定表明，KE1蟲食率為0.3%~2.7%，顯著低于對照受體品種（21.6%~35.6%）。表明KE1對大豆食心蟲抗性表現(xiàn)為高抗，且抗蟲水平顯著高于受體品種（見表5）。連續(xù)兩代抗蟲性鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆KE1對大豆食心蟲田間抗性穩(wěn)定遺傳。

圖4 甜菜夜蛾幼蟲取食T 5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1和墾農(nóng)18葉片情況Fig.4 Feeding statusof S.exigua larvae on theleaves of T 5 generation of transgenic line KE1 and Kennong 18

圖5 斜紋夜蛾幼蟲取食T 5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1和墾農(nóng)18葉片情況Fig.5 Feeding status of S.litura larvae on theleaves of T 5 generation of transgenic line KE1 and Kennong 18

圖6 黏蟲幼蟲取食T 5代轉(zhuǎn)基因大豆KE1和墾農(nóng)18葉片情況Fig.6 Feeding status of Mythimna separata W.larvaeon the leaves of T 5 generation of transgenic line KE1 and Kennong 18

表5 轉(zhuǎn)基因大豆KE1田間大豆食心蟲抗性分析Table 5 Analysis of L.glycinivorella Matsumura resistance in the field

3 討論與結(jié)論

隨著基因工程技術(shù)進步，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種類和耕種面積迅速增長，研究轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物安全性至關(guān)重要。轉(zhuǎn)基因作物安全性評價主要分為食品安全性和環(huán)境安全性兩個層次[16]。轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全性評價主要包括對靶標害蟲和非靶標害蟲的影響，其中對靶標害蟲的影響是環(huán)境安全評價主要內(nèi)容。

本研究對轉(zhuǎn)基因大豆KE1作ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆在生長不同時期及不同組織部位均表達，且不同器官中目的蛋白含量存在一定時空變化，與邵宇鵬等研究結(jié)果一致[17]。本文選取東北地區(qū)常見鱗翅目靶標害蟲檢測生物活性，分別統(tǒng)計葉面積損失率、平均體重抑制百分率和蟲食率等重要參數(shù)，試驗方法與宋苗等采用方法一致[18]。

本研究所用轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆KE1株系中目的基因Cry1Ia和標記基因Bar在T3~T5代中連續(xù)三代穩(wěn)定遺傳。Cry1Ia基因在葉片、花、未成熟籽粒和莢皮中均翻譯成相應蛋白。大豆籽粒Cry1Ia蛋白含量相對最高，根中含量相對較低。選用T5代轉(zhuǎn)基因與對照植株墾農(nóng)18葉片分析鱗翅目害蟲幼蟲抗性，證明轉(zhuǎn)基因大豆KE1供試鱗翅目害蟲幼蟲具有較高抗性。因此，轉(zhuǎn)基因KE1株系顯著提高受體大豆墾農(nóng)18對鱗翅目靶標害蟲抗性，可用于培育抗鱗翅目靶標害蟲大豆新品系。后續(xù)試驗可通過對非靶標昆蟲的安全性評價，通過生物素標記結(jié)合方法以及Ligand blot配給雜交方法，探究靶標昆蟲中腸BBMV蛋白是否存在Cry1Ia蛋白特異性受體，為解釋轉(zhuǎn)Cry1Ia基因大豆殺蟲機制奠定基礎(chǔ)。