馬春英，王美皓，馬 花，佛生福，喬自林，馬忠仁，王家敏

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；4.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010)

CHO細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell)由Puck TT于1957年從成年中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織分離、培養(yǎng)、建立的，呈上皮樣貼壁生長(zhǎng).該細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于各種診斷性、治療性蛋白質(zhì)的表達(dá)，包括重組抗體、重組單體蛋白及重組融合蛋白等，CHO細(xì)胞已經(jīng)成為了生物制品領(lǐng)域最主要的生產(chǎn)細(xì)胞[1-5].貼壁型的傳代細(xì)胞可用細(xì)胞工廠和微載體技術(shù)規(guī)?；囵B(yǎng)，生產(chǎn)中可將細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)控制在最適條件范圍內(nèi)，提高細(xì)胞密度和蛋白表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)大批次量、小批間差，產(chǎn)品更具有穩(wěn)定性和安全性，節(jié)省大量的勞動(dòng)力、生產(chǎn)場(chǎng)地和能源消耗，降低生產(chǎn)成本[6-7].血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).在動(dòng)物血清中牛血清又是最常用、最合適、最有效的培養(yǎng)基成分.在培養(yǎng)基中加入適量的牛血清，不僅可以有效促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，還能夠縮短細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，從而加快生物制品的生產(chǎn)，提高生物制品的產(chǎn)量，為生物制品生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)更多的利潤(rùn)[8].目前市場(chǎng)上血清種類(lèi)繁多，質(zhì)量參差不齊，因此研究不同種類(lèi)血清對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，建立快速有效的血清篩選方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[9].本文通過(guò)蘭州民海生物工程有限公司生產(chǎn)的不同批號(hào)國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)新生牛血清對(duì)CHO細(xì)胞復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)的對(duì)比試驗(yàn)研究，尋找對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)效果最佳的國(guó)產(chǎn)新生牛血清，從而為生物制品的研發(fā)節(jié)約成本、節(jié)省時(shí)間.

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：貼壁培養(yǎng)型CHO細(xì)胞從ATCC引進(jìn)，引進(jìn)后由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心凍存.

培養(yǎng)基：F12購(gòu)自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20170115.

血清：6個(gè)批號(hào)的新生牛血清，購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司，使用時(shí)按10%(V/V)添加到培養(yǎng)基中，編號(hào)及批號(hào)信息見(jiàn)表1.

表1 新生牛血清編號(hào)及批號(hào)信息表

微載體：Cytodex1，GE Healthcare Cytodex-1；貨號(hào)：17-0488-03；批號(hào)：10225274；產(chǎn)地：瑞典；包裝：5kg；有效期：2022.04.

微載體處理方法：稱(chēng)取10 g微載體至2 L微載體處理瓶中，加入1.0 L(10 g)新鮮配制的PBS(無(wú)Ca2+、Mg2+，pH7.2)溶脹3h，再用PBS(無(wú)Ca2+、Mg2+，pH7.2)清洗3遍，定容至1.0 L(10 g)，121 ℃、60 min高壓滅菌，滅菌結(jié)束后，待載體放置室溫用F12清洗3遍后定容至475 mL，最后補(bǔ)加25 mL新生牛血清(10% NBS)，配制成20 g/L濃度的微載體懸液，取樣菌檢.

主要試劑及儀器：0.25%胰蛋白酶、0.2%臺(tái)盼藍(lán)、結(jié)晶紫染液、T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶、60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、250 mL雙側(cè)臂懸浮培養(yǎng)瓶、磁力攪拌器、生物微倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等.

1.2 方法

1.2.1 靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞傳代穩(wěn)定性觀察

用含有10% 新生牛血清的F12完全培養(yǎng)基復(fù)蘇CHO細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至致密單層時(shí)，分別用含有6個(gè)批號(hào)新生牛血清的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)傳代5代，傳代時(shí)細(xì)胞均按照1∶4比例，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每代細(xì)胞在24 h、48 h拍照觀察細(xì)胞形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)、致密程度.

1.2.2 靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞克隆形成率分析

克隆形成率是指貼壁細(xì)胞在低細(xì)胞密度下的集落形成，也就是克隆效率，是判斷細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)之一.取第3代、第4代、第5代的6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的CHO細(xì)胞，消化，制成細(xì)胞懸液，按照100個(gè)細(xì)胞/皿的細(xì)胞量接種細(xì)胞培養(yǎng)皿，并做平行3皿.將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)8天，出現(xiàn)集落后，用吸管吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗，無(wú)水甲醇固定，結(jié)晶紫染色.觀察并對(duì)細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值.

克隆形成率(%)=(所形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%

1.2.3 微載體懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

取第5代6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿單層的CHO細(xì)胞，分別用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，在250 mL雙側(cè)臂懸浮培養(yǎng)瓶中，按細(xì)胞15個(gè)/球，接種至200 mL 2 g/L Cytodex1微載體懸液內(nèi)，50 rpm、5%CO2、37 ℃培養(yǎng)，每24 h取樣觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)晶紫計(jì)數(shù).按照此方法，對(duì)培養(yǎng)至第6代、第9代的CHO細(xì)胞重復(fù)上述試驗(yàn)，計(jì)算三次平均值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線.并比較6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞的平均最大増殖密度、平均倍增時(shí)間[10]、平均比生長(zhǎng)速率[11].

倍增時(shí)間=T/A，A=log2(Y/X)

X為初始接種細(xì)胞數(shù)，Y為細(xì)胞最大増殖密度前一天的細(xì)胞數(shù)，T為培養(yǎng)時(shí)間.

比生長(zhǎng)速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X為活細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)時(shí)間，n和n-1為2個(gè)取樣計(jì)數(shù)時(shí)間點(diǎn).

1.2.4 使用Graphpad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞傳代穩(wěn)定性觀察

分別用含有10%血清復(fù)蘇CHO工作庫(kù)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)良好(圖1)，傳代2代后轉(zhuǎn)為分別含有6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，均能較好促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，細(xì)胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列.6個(gè)批號(hào)新生牛血清分別培養(yǎng)CHO細(xì)胞至第5代效果(見(jiàn)圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)無(wú)明顯差異.

圖1 CHO細(xì)胞復(fù)蘇靜置培養(yǎng)狀態(tài)(A:24h,40×；B:48h,40×)

圖2 6個(gè)批號(hào)新生牛血清靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞(第5代)效果比較(40×)

2.2 靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞克隆率分析

6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞均形成了有效的集落數(shù)，平均集落形成率從高到低依次為D、F、B、E、C、A血清組，分別為103.67±2.33%，93.67±2.33%，84.00±2.00%，57.00±6.00%，51.33±3.33%，37.67±1.67%，且D、F、B組顯著高于E組，A組顯著低于E組(P<0.05).集落形成效果見(jiàn)圖3，克隆形成率分析結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖3 6個(gè)批號(hào)新生牛血清靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞形成集落

圖4 6個(gè)批號(hào)新生牛血清靜置培養(yǎng)CHO細(xì)胞克隆率比較

2.3 微載體懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)曲線及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

6個(gè)批號(hào)新生牛血清微載體懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞效果比較見(jiàn)圖5，生長(zhǎng)曲線分析見(jiàn)圖6，平均比生長(zhǎng)速率分析見(jiàn)圖7，平均最大增殖密度和平均倍增時(shí)間比較分析見(jiàn)圖8、圖9和表2.6個(gè)批號(hào)新生牛血清均能實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)B、D、F優(yōu)于A、C，E最差；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈“S”型，但D、F、B試驗(yàn)組能較好促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)平均比生長(zhǎng)速率、平均倍增時(shí)間和最大增殖濃度從高到低依次為D、F、B、E、A、C血清組，且D、F組顯著高于E組(P<0.05).

圖5 6個(gè)批號(hào)新生牛血清分別微載體懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞效果比較(100×)

圖6 6個(gè)批號(hào)新生牛血清微載體懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖7 6個(gè)批號(hào)新生牛血清微載體懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率(*P<0.05)

圖8 6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞微載體懸浮平均倍增時(shí)間

圖9 6個(gè)批號(hào)新生牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞微載體懸浮平均最大增殖密度

表2 6個(gè)批號(hào)新生牛血清CHO細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)平均倍增時(shí)間和平均最大增殖密度

3 討論與結(jié)論

CHO 細(xì)胞系在生物制藥領(lǐng)域備受矚目，主要原因：首先，CHO 細(xì)胞系具有很高的安全性(CHO基因組內(nèi)不攜帶任何人源性病毒)；其次，CHO細(xì)胞系表達(dá)的重組蛋白能夠獲得類(lèi)似于人源蛋白的翻譯后修飾，表達(dá)的重組蛋白更具生物活性[12].

在培養(yǎng)貼壁型CHO細(xì)胞時(shí)，血清是最常用、最合適、最有效的培養(yǎng)基成分.血清選擇不當(dāng)，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)不穩(wěn)定，而且由于血清價(jià)格昂貴，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)成本高.血清的選擇直接關(guān)系到研發(fā)進(jìn)度和生物制品生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[13].本研究針對(duì)以上問(wèn)題，分別用靜置培養(yǎng)傳代穩(wěn)定性觀察、克隆形成率和微載體懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析評(píng)價(jià)了國(guó)產(chǎn)新生牛血清對(duì)CHO貼壁細(xì)胞的促生長(zhǎng)效果的影響.結(jié)果顯示，6個(gè)批次血清中，CHO細(xì)胞在3組新生牛血清中能連續(xù)傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)較穩(wěn)定.

本試驗(yàn)通過(guò)研究不同批次的新生牛血清對(duì)CHO細(xì)胞培養(yǎng)效果的影響，不僅在短時(shí)間內(nèi)成功篩選出了培養(yǎng)CHO細(xì)胞的最佳血清，而且也為生物制品生產(chǎn)中CHO細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)提供試驗(yàn)依據(jù).這種快速有效的血清篩選方法縮短了疫苗研發(fā)、生產(chǎn)的時(shí)間，節(jié)省了疫苗企業(yè)的生產(chǎn)成本.

本研究中6個(gè)批號(hào)的國(guó)產(chǎn)新生牛血清培養(yǎng)CHO細(xì)胞均形成了有效的集落數(shù)，平均集落形成率從高到低依次為D、F、B、E、C、A血清組，分別為103.67±2.33%，93.67±2.33%，84.00±2.00%，57.00±6.00%，51.33±3.33%，37.67±1.67%.6個(gè)批號(hào)新生牛血清均能實(shí)現(xiàn)CHO細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)B、D、F優(yōu)于A、C，E最差，且D、F、B組顯著高于E組，A組顯著低于E組(P<0.05)；生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)平均比生長(zhǎng)速率、平均倍增時(shí)間和最大增殖濃度從高到低依次為D、F、B、E、C、A血清組，且D、F組顯著高于E組(P<0.05).這可能與不同批次新生牛血清中所含的激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同有關(guān)[14-15].如纖維粘連素、胰島素、α2巨球蛋白、胎球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板促生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等在細(xì)胞培養(yǎng)中各自發(fā)揮的生理功能，還有待進(jìn)一步研究.另外，胎牛血清的免疫球蛋白含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新生牛血清，胎牛的血清相對(duì)來(lái)說(shuō)比較純，所以培養(yǎng)細(xì)胞的效果會(huì)更佳[16].除此之外還可能是由于牛血清中存在大量的脂蛋白，貯存不當(dāng)會(huì)造成血清營(yíng)養(yǎng)流失，導(dǎo)致給細(xì)胞供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)的能力減弱，造成了細(xì)胞的生長(zhǎng)緩慢[17-18].