劉文凱，王家敏，喬自林，郭鵬輝，王明明

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030)

天然產(chǎn)物在新藥研發(fā)過(guò)程中起著舉足輕重的作用，而土壤是其開(kāi)發(fā)的主要來(lái)源.駐留在植物組織內(nèi)的微生物，稱為內(nèi)生菌，而放線菌產(chǎn)生天然產(chǎn)物的比重較大.目前發(fā)現(xiàn)的放線菌雖然有20 000多種，但對(duì)于避免重復(fù)檢測(cè)卻變得越來(lái)越困難，還耗費(fèi)時(shí)間、資源.因此研究者就從植物中分離放線菌及次級(jí)代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤物質(zhì)、保護(hù)激素、生長(zhǎng)激素等.近年來(lái)，從放線菌次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了很多具有商業(yè)價(jià)值的活性物質(zhì)，但無(wú)較大研發(fā)進(jìn)展，原因是放線菌傳統(tǒng)篩選方法效率低.為了提高生產(chǎn)效率，需將基因工程、代謝工程等運(yùn)用到放線菌的生產(chǎn)中.本文就植物內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物的功能及生產(chǎn)效率加以綜述，以期為研究和生產(chǎn)有益菌提供參考.

1 植物內(nèi)生放線菌代謝產(chǎn)物生物學(xué)活性

微生物是抗生素的主要來(lái)源，而耐藥性卻是影響藥物的主要因素，也是影響人類公共衛(wèi)生和動(dòng)物健康的一個(gè)主要問(wèn)題.人類對(duì)抗生素的生產(chǎn)和使用促進(jìn)了耐藥病原菌的產(chǎn)生，而只有1%～3%的天然產(chǎn)物抗菌劑是已知的.為解決天然的未知的抗菌劑，人們?cè)诓粩嗵角髮ふ倚碌目股仡惢衔?

1.1 抑菌作用

作為天然抗生素最主要的來(lái)源，無(wú)論是人類病原菌還是植物病原菌、植物內(nèi)生放線菌均展現(xiàn)出杰出的抗菌活性.Long H從Solawam sp.根中分離到73個(gè)內(nèi)生菌株對(duì)被測(cè)植物致病菌有廣泛的抑制作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病性菌的抑制作用最強(qiáng).這些菌株具有抑制各種致病性細(xì)菌生長(zhǎng)的能力，是潛在的生物防治劑[1].Solecka J等也從植物中發(fā)現(xiàn)的398株放線菌，10%～20%的代謝產(chǎn)物對(duì)原蟲(chóng)有少量抗性[2].放線菌產(chǎn)生的抗菌劑具有對(duì)病原菌的毒害作用，卻對(duì)人體無(wú)害等特點(diǎn).有研究者用紙片法探究了植物發(fā)酵液樣品產(chǎn)生抑菌和抗真菌化合物的能力.研究表明，放線菌可通過(guò)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物來(lái)控制病原性入侵的抗性機(jī)制.從柑橘果實(shí)中分離到的TQR12-4菌株具有抑菌活性，對(duì)試驗(yàn)病原菌、白地霉菌、尖孢鐮刀菌和鐮刀菌均有抑制作用.2019年從同地區(qū)藥用植物中提取的放線菌，培養(yǎng)出的LGMB471對(duì)枸櫞酸有明顯的抑制作用，且只對(duì)柑橘果實(shí)具有顯著的抗菌活性[3].表 1提供了近10年來(lái)植物內(nèi)生放線菌的抑菌活性，以供研究者參考.

表1 2010—2020年間植物內(nèi)生放線菌抑菌性研究情況

1.2 抗瘧疾作用

瘧疾是公共衛(wèi)生全球性的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)，每年報(bào)告的新感染病例和死亡人數(shù)達(dá)百萬(wàn).由于寄生蟲(chóng)對(duì)已有的抗瘧疾藥物會(huì)產(chǎn)生耐藥性，這就使得瘧疾的傳播不能及時(shí)阻斷.Baba M.S分離的提取物(SUK8、SUK10和SUK27)具有抗瘧疾活性.他從卵圓索樹(shù)樹(shù)皮中得到的鏈霉菌(Streptomyces SUK10)對(duì)試驗(yàn)菌有抑制作用，并對(duì)感染貝爾赫瘧原蟲(chóng)的小鼠進(jìn)行了抗瘧試驗(yàn).鏈霉菌的核苷酸序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，SUK10可能是鏈霉菌屬中的一個(gè)新種[4].Streptomyces hygroscopicus Hygroscopicus是放線菌家族中的一員，F(xiàn)itri L E將小鼠分為1個(gè)對(duì)照組(白芍感染后不治療組)和3個(gè)治療組(白芍感染后腹腔內(nèi)給藥)，從第一天的瘧疾誘導(dǎo)到最后一次誘導(dǎo)與治療進(jìn)行測(cè)量.結(jié)果表明，代謝物中的伊潘霉素可抑制其UPS功能，引起應(yīng)激和死亡，是潛在的新型瘧疾藥物[5].

1.3 保護(hù)作用

內(nèi)生放線菌代謝產(chǎn)物能有效抑制植物病原菌，從而保護(hù)寄主植物免受病菌的侵襲.Tena A R從叢枝菌根真菌(AMF)對(duì)辣椒植物生長(zhǎng)和枯萎病的抑制作用進(jìn)行了研究.她在溫室條件下進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，并對(duì)Cerro del Metate菌根結(jié)合物和ABV 39和ABV 02放線菌進(jìn)行了鑒定.結(jié)果表明，AMF與放線菌共接種在辣椒植株上能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)并具有抵抗枯萎病的協(xié)同作用[6].在一項(xiàng)涉及260株內(nèi)生放線菌的研究中，發(fā)現(xiàn)80%的可抑制植物病原體.Kaur T從旁遮普邦和喜馬恰爾邦的不同植物中分離出321株菌株.在初步篩選(雙培養(yǎng)法)中，83株菌株拮抗一種或多種植物病原真菌.對(duì)植物生長(zhǎng)促進(jìn)活性的研究表明，12株具有產(chǎn)生吲哚乙酸的能力，10株產(chǎn)生鐵磷，12株具有產(chǎn)氨能力.這些菌株可作為生物防治和植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑[7].Haque M A從大白菜品種(SS、HN、TP)葉片中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌群落，分離出的(TPL 08)和枯草芽孢桿菌(SSL 16，HNL 10)可通過(guò)抑制病原菌對(duì)大白菜幼苗的感染起到保護(hù)作用[8].

1.4 抗腫瘤作用

根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，癌癥是全球危害人類健康且導(dǎo)致死亡的十大主要原因之一.因人體對(duì)化療藥物耐藥性的不斷增強(qiáng)，且化療藥物具有毒性和副作用，所以尋找新型藥物減少化療的不良反應(yīng)是癌癥治療的優(yōu)先目標(biāo).20世紀(jì)40年代至2006年間批準(zhǔn)的175種抗癌藥物中，42%是天然產(chǎn)物或由其衍生的化合物[9].1993年Stierle等第一次從短葉紫杉的樹(shù)皮中提取紫杉類化合物.這一發(fā)現(xiàn)為利用紫杉醇生產(chǎn)藥物提供了途徑，從而掀起了放線菌抗腫瘤研究的熱潮.Caruso等從紅豆杉植株中提取抗腫瘤物質(zhì)，得出紅豆杉烷類物質(zhì)的合成途徑，但其調(diào)控機(jī)制尚待研究.Xiao J從福建漳州紅樹(shù)林沉積物中分離出163株放線菌，并用枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和3株腫瘤細(xì)胞(BEL 7402、A 549和HL 60)對(duì)分離菌株的抗微生物活性和抗腫瘤活性進(jìn)行了檢測(cè).研究發(fā)現(xiàn)，42.3%的放線菌發(fā)酵液具有抗菌活性，37.4%的放線菌發(fā)酵液具有抗腫瘤活性[10].Vochysia divergens是一種常見(jiàn)于潘塔納爾地區(qū)的巴西藥用植物.Haminiuk C從Vochysia divergens中分離出的兩個(gè)菌株能夠產(chǎn)生具有抗氧化活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)成釉瘤細(xì)胞具有抵抗活性[11].

1.5 促生長(zhǎng)作用

放線菌具有產(chǎn)生多種高價(jià)值抗生素、有機(jī)酸、植物激素、胞外酶和生物活性化合物的次生代謝物的能力.多種放線菌能直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，保護(hù)植物免受植物病原和害蟲(chóng)的侵害.Liotti R G從泡菜中分離出11種內(nèi)生放線菌，可促進(jìn)辣椒植株生長(zhǎng)，能使莖的質(zhì)量增加42%.紅鏈霉菌R132是辣椒采前和收獲后促進(jìn)生長(zhǎng)和病原生物防治的有效工具[12].El-Tarabily K A在溫室條件下測(cè)試了29種內(nèi)生菌.當(dāng)單獨(dú)或組合使用時(shí)，它們能夠顯著地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，還可減少黃瓜的根冠與根腐病.與單獨(dú)暴露在單個(gè)菌株的情況相比，三種分離株的組合可顯著地抑制疾病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)[13].Long H H從甘蔗植物中分離出83種內(nèi)生放線菌，均具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性，包括吲哚-3-乙酸(IAA)和鐵載體的產(chǎn)生、磷的增溶和對(duì)植物病原真菌的拮抗作用[14].Jog等人從小麥內(nèi)生菌中分泌的植酸酶以及磷活性物質(zhì)可顯著改善植物的生長(zhǎng)狀態(tài).除了磷，植物也可依靠磷鐵復(fù)合物的形式提高鐵的利用率.小麥放線菌代謝產(chǎn)物可顯著提高植株生長(zhǎng)量和礦物質(zhì)(Fe、Mn、P)的含量.

2 放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量研究

突變和重組的研究對(duì)于提高放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量仍然有效，分子遺傳學(xué)方法可減少步驟，并提供基因調(diào)控和次級(jí)代謝物生物合成.這些信息可用于指導(dǎo)菌株改良策略，并將隨機(jī)誘變、選擇和重組與分子克隆相結(jié)合，以優(yōu)化產(chǎn)品產(chǎn)量.在長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐中，逐漸積累了提高放線菌次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，主要有基因工程技術(shù)優(yōu)化、維生素優(yōu)化及發(fā)酵工藝優(yōu)化等.

2.1 基因工程技術(shù)優(yōu)化

20世紀(jì)70年代興起了基因工程技術(shù)，而現(xiàn)階段在分子水平上逐步對(duì)微生物進(jìn)行改造，并通過(guò)基因重組來(lái)提高產(chǎn)量.其原理主要為改良分子遺傳方法(見(jiàn)圖1).FK 520(Ascomycin)是一種大環(huán)內(nèi)酯，具有免疫抑制活性.Yu Z使得丙二酰輔酶的乙酰輔酶(ACCase)在SFK-6-33中的過(guò)表達(dá)，使FK 520的產(chǎn)率提高到3 320.1 mg/L，但對(duì)FK 523的合成沒(méi)有明顯的抑制作用.為進(jìn)一步提高FK 520的產(chǎn)量，構(gòu)建了FkbS和ACCase的過(guò)表達(dá)組合菌株SFK-OASN.FK 520產(chǎn)量比SFK-6-33提高了44.4%，達(dá)到3 511.4 mg/L.這些結(jié)果表明，傳統(tǒng)誘變結(jié)合代謝工程是提高FK 520產(chǎn)量的有效策略.Tn5099和Tn5096為編碼外向閱讀啟動(dòng)子活性元素.這些反式子能夠激活鄰近插入位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄.對(duì)S.roseosporus中的插入研究表明，某些突變體過(guò)量會(huì)產(chǎn)生紅色素(一種次級(jí)代謝產(chǎn)物)，另一些突變體過(guò)量會(huì)產(chǎn)生脂肽抗生素如達(dá)托霉素，而有些情況還會(huì)使兩者都產(chǎn)生.這種次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的增加可能是因便攜式啟動(dòng)子的活性或負(fù)調(diào)控元件的失活而發(fā)生.Tn5099可以與側(cè)翼的DNA一起克隆到大腸桿菌中增加產(chǎn)量.而Tn5096和Tn5099都具有廣泛的宿主范圍，可通過(guò)接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)在大腸桿菌的載體上引入鏈霉菌[15].紅霉素產(chǎn)量的提高一直受到基因工程方法的限制.Benjamin Kirm利用蛋白組學(xué)方法篩選了參與紅霉素生物合成的調(diào)節(jié)蛋白.有學(xué)者已鑒定出一種調(diào)節(jié)蛋白SCE-5599.鑒定出的這種合成蛋白與野生型相比，該蛋白在紅霉素高產(chǎn)菌株中的表達(dá)水平顯著提高.除此之外，SACE-5599對(duì)紅霉素產(chǎn)率有積極影響，BldD和SACE-5599參與了次生代謝產(chǎn)物的生物合成.雖然SACE-5599的作用機(jī)制尚未闡明，但已顯示出具有提高紅霉素生產(chǎn)的潛力[16].

圖1 菌株改良的分子遺傳方法

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.3 維生素優(yōu)化

就抗生素產(chǎn)量提高而言，目前常采用的方法是優(yōu)化發(fā)酵工藝，但也可通過(guò)添加維生素提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量.IStreptomyces/I是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，對(duì)許多抗生素和次生代謝物的生產(chǎn)具有重要意義.脫鐵胺(亦稱去鐵胺B、DFO-B、DFOA、DFB或Desferal)是由多種放線菌產(chǎn)生和分泌的低分子量鐵螯合物，包括IStreptomyces/I、Incartomyces/I和IMicromonospora/I.IStreptomyces pilosus/I合成的鐵螯合物B，臨床上用于治療與鐵超載和病理鐵沉積有關(guān)的疾病.Vijayakumar R將大豆作為添加劑，如NaSUB 2/SUBHPOSUB 4/SUB.12HSUB2/Subo，NaHSUB 2/SUBPOSUB 4/SUB 4等，氨基酸產(chǎn)量與對(duì)照相比提高了8倍左右[20].紫杉醇是從紅豆杉皮中提取的一種高效而罕見(jiàn)的抗腫瘤藥物，但其提取方法成本高、產(chǎn)率低，限制了它的廣泛應(yīng)用.Qiao W發(fā)現(xiàn)NaOAc是紫杉醇的重要前體，可在培養(yǎng)基中引入NaOAc、Cu2+和水楊酸，Cu2+可增強(qiáng)氧化酶活性，能催化紫杉醇的形成.水楊酸可作為誘導(dǎo)子信號(hào)[21].

2.4 其他微生物優(yōu)化

植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生需要葉綠體和膜功能的作用，更需要其他微生物的調(diào)節(jié).Raupach[22]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)7種根桿菌(PGPR)菌株處理的黃瓜都具有顯著生長(zhǎng)，且所有經(jīng)過(guò)PGPR治療的黃瓜都顯著地降低了葉病的嚴(yán)重程度，進(jìn)而提高生產(chǎn)效率.Vijayakumar R[23]對(duì)采集的25份放線菌樣品進(jìn)行了分離，獲得68株形態(tài)不同的菌株，其中37%具有抗菌活性，取名為鏈霉菌VPTS3-1.其對(duì)細(xì)菌和真菌病原體具有抗菌效果.此外制備工藝參數(shù)表明，在淀粉-酪蛋白培養(yǎng)基中，適宜的pH值為7～8，培養(yǎng)時(shí)間為9 d，適宜的碳源為淀粉，氮源為KNO3，可為大規(guī)模生產(chǎn)提供培養(yǎng)條件.

3 總結(jié)與展望

放線菌及其代謝產(chǎn)物是維持生命的關(guān)鍵，也是自然過(guò)程的驅(qū)動(dòng)力.將放線菌及其代謝次生物用于抵抗各種病原體的侵入和生物蟲(chóng)害，還可參與納米材料的大規(guī)模生產(chǎn)并能促進(jìn)生產(chǎn)效率的優(yōu)化.他們的生物合成潛力已被充分認(rèn)識(shí)，不再被認(rèn)為是無(wú)研究?jī)r(jià)值的放線菌群，還具有無(wú)限的發(fā)展?jié)撃?隨著生物與化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型篩選技術(shù)將更具有針對(duì)性，并能減少重復(fù)概率，還可使代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量進(jìn)一步提高，達(dá)到可控的效果.

目前對(duì)放線菌及其代謝產(chǎn)物的研究應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還需要關(guān)注新的菌種，如鏈球菌、乳桿菌在代謝產(chǎn)物方面的應(yīng)用；新領(lǐng)域微生物資源的開(kāi)發(fā)，對(duì)植物相關(guān)菌種在不同條件下的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)能和應(yīng)用，以及對(duì)新型代謝途徑的研究；還如鏈球菌在脫硫方面的不同代謝途徑是否可產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物等等.這些不同方面的探索可促進(jìn)對(duì)放線菌代謝產(chǎn)物的深入研究.無(wú)論在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療還是工業(yè)領(lǐng)域，放線菌屬都有廣闊的應(yīng)用前景和開(kāi)發(fā)空間，值得深入研究.