武彬，柏澤柳，張健，郭傳會(huì)，張道雷

(山東職業(yè)學(xué)院 生物工程系，濟(jì)南 250104)

0 引 言

凝乳酶是制作乳酪必需的酶制劑[1]，還用于兒童消化不良的臨床治療[2]，其對(duì)熱敏感，易失活[3]。多羥基化合物作為酶穩(wěn)定劑操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣，應(yīng)用最為廣泛[4-6]。熒光光譜常用于研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。氨基酸殘基所處微環(huán)境極性增加則熒光強(qiáng)度降低、發(fā)射峰紅移，疏水性增加則熒光強(qiáng)度升高、發(fā)射峰藍(lán)移[7]。多羥基化合物的種類、濃度等對(duì)酶熱穩(wěn)定性影響的研究大多集中于單一成分對(duì)酶的保護(hù)作用[8]。少量保護(hù)劑配方優(yōu)化的研究中，多羥基化合物是過量添加的，而且各實(shí)驗(yàn)組總濃度并不一致[9]。因此，有必要分析不同多羥基化合物的熱保護(hù)作用是否存在協(xié)同效應(yīng)，為蛋白酶制劑熱穩(wěn)定劑配方優(yōu)化提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

凝乳酶，北京多艾特生物科技有限公司進(jìn)口分裝，使用前用磷酸緩沖液透析平衡去除小分子，其余為分析純；島津RF-6000熒光分光光度計(jì)；山東職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)研發(fā)中心自有儀器。

1.2 凝乳酶活力的測(cè)定方法

凝乳酶活力測(cè)定采用Arima法[10]，酶活力測(cè)定采用0.02 mol/L pH 6.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖體系，底物脫脂牛乳溶液中CaCl2濃度為1.0%。

1.3 熒光光譜分析

采用島津RF-6000熒光分光光度計(jì)以波長(zhǎng)掃描方式測(cè)定熒光發(fā)射光譜，設(shè)定激發(fā)光為295 nm，發(fā)射光掃描范圍為305～500 nm，激發(fā)光和發(fā)射光狹縫校正寬度均為5 nm，掃描速度為6 000 nm/min。

1.4 凝乳酶熱處理

配置600 U/mL（用于殘余酶活力測(cè)定）或質(zhì)量濃度1 mg/mL（用于熒光光譜）凝乳酶溶液或含有不同質(zhì)量濃度葡萄糖、海藻糖、甘油或其混合物的凝乳酶溶液，放入54℃水浴鍋中立即開始計(jì)時(shí)，水浴一定時(shí)間，立即轉(zhuǎn)入冰水中快速降溫至0℃，測(cè)定殘余酶活力或熒光光譜。

1.5 多羥基化合物混合溶液的配制

凝乳酶磷酸緩沖溶液和總質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.0%葡萄糖、海藻糖和甘油混合溶液的凝乳酶磷酸鹽緩沖溶液共22組，測(cè)定54℃熱處理15 min前后各組樣品熒光發(fā)射光譜。多羥基化合物的配置情況如表1所示。

表1 多羥基化合物混合溶液的組成 %

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 4.0軟件，進(jìn)行酶活力數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、線性回歸分析與熒光發(fā)射光譜差譜305～369 nm曲線下面積(Area under curve,AUC305nm-369nm)計(jì)算；采用Excel2007進(jìn)行葡萄糖、海藻糖和甘油混合物對(duì)熱處理凝乳酶殘余酶活力和熒光光譜差譜的AUC305nm-369nm進(jìn)行三元線性回歸分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以P＜0.01作為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 多羥基化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)殘余酶活力的影響

圖1為葡萄糖、海藻糖和甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凝乳酶熱穩(wěn)定性影響的結(jié)果。配制一系列分別含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～5.0%的葡萄糖、海藻糖和甘油的凝乳酶溶液，54℃保溫15 min，測(cè)定其殘余活力并與多羥基化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)擬合線性方程，其斜率分別為13.080±0.542，8.525±0.492和5.419±0.406（R2＞0.98）。因此，上述3種多羥基化合物對(duì)凝乳酶的保護(hù)作用從強(qiáng)到弱依次為葡萄糖＞海藻糖＞甘油。

圖1 葡萄糖、海藻糖和甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)凝乳酶熱穩(wěn)定性的影響

2.2 多羥基化合物對(duì)熱處理凝乳酶熒光光譜的影響

選取葡萄糖作為研究對(duì)象，探討其對(duì)熱處理凝乳酶熒光光譜的影響。圖2（a）為不同熱處理時(shí)間下含5.0%葡萄糖的凝乳酶溶液的熒光發(fā)射光譜，不含糖的酶溶液為對(duì)照樣。未經(jīng)熱處理的含糖凝乳酶熒光發(fā)射峰略低于凝乳酶。隨著熱處理時(shí)間延長(zhǎng)，含糖組的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組。熱處理30 min，凝乳酶分子結(jié)構(gòu)接近完全松散，兩組熒光強(qiáng)度又趨于一致。圖2(b)為含糖凝乳酶與其對(duì)照樣的熒光差譜圖。

圖2 葡萄糖對(duì)熱處理凝乳酶熒光光譜的影響

2.3 多羥基化合物對(duì)凝乳酶熱穩(wěn)定性作用

將凝乳酶分別溶于磷酸緩沖液和總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%的葡萄糖、海藻糖和甘油的多羥基化合物混合溶液共22組，分別測(cè)定其熱處理后的殘余酶活力和熱處理前后的熒光發(fā)射光譜。各組熱處理前后的熒光發(fā)射光譜及差譜如圖3所示。圖3（a）為不同構(gòu)成的多羥基化合物對(duì)凝乳酶熱處理前后熒光發(fā)射光譜的影響，圖3（b）為其差譜。

圖3 多羥基化合物混合溶液的組成對(duì)熱處理凝乳酶熒光光譜的影響

熒光光譜的差譜可以反映酶分子結(jié)構(gòu)變化情況。各組熒光差譜在305～369 nm為正值，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，以該波長(zhǎng)范圍內(nèi)熒光差譜的曲線下面積AUC305nm-369nm為指標(biāo)，表征凝乳酶的結(jié)構(gòu)變化。與酶活力變化的結(jié)果相結(jié)合，可以分析凝乳酶結(jié)構(gòu)和功能的變化情況。表2顯示了多羥基化合物對(duì)熱處理凝乳酶殘余酶活力與熒光發(fā)射光譜的影響結(jié)果，其中殘余酶活力每組4個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)誤差（Standard Error of Mean,SEM）。

表2 不同多羥基化合物組合對(duì)凝乳酶殘余活力和熒光差譜曲線下面積的影響

以表1中葡萄糖、海藻糖和甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為X1，X2和X3，分別以殘余酶活力和熒光差譜AUC305nm-369nm為Y1和Y2，擬合三元線性方程，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，兩組方程的R2值分別為0.8898和0.9266，標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為5.1616和26317。三元線性回歸分析結(jié)果見表3，3種多羥基化合物濃度對(duì)熱處理凝乳酶的殘余活力和熒光光譜差譜的影響均極顯著（P＜0.01）。

表3 多羥基化合物組成對(duì)熱處理凝乳酶活力和熒光差譜三元線性回歸分析結(jié)果

3 討 論

3.1 多羥基化合物濃度與凝乳酶熱穩(wěn)定性的線性關(guān)系

關(guān)于葡萄糖、海藻糖和甘油對(duì)凝乳酶熱穩(wěn)定性的作用顯示，在0～5.0%的濃度范圍內(nèi)，其保護(hù)作用與濃度都呈線性相關(guān)。這與Tapati等關(guān)于多羥基化合物濃度對(duì)酶熱穩(wěn)定性影響的研究結(jié)果一致，即高濃度下多羥基化合物對(duì)酶的保護(hù)作用趨于某一限值，而低濃度下多羥基化合物的熱保護(hù)作用與其添加量成正比[1]。關(guān)于穩(wěn)定劑對(duì)酶的保護(hù)機(jī)理大多是在海藻糖的研究結(jié)果上提出的，包括玻璃態(tài)假說，水替代假說和優(yōu)先排阻假說等[11]。氫鍵和疏水作用是維持酶分子三維構(gòu)象的主要作用，多羥基化合物中的羥基與水分子形成大量氫鍵，在蛋白質(zhì)分子周圍形成一個(gè)由氫鍵連接起來的水化層，使水分子結(jié)構(gòu)更加有序，同時(shí)也可以增強(qiáng)非極性基團(tuán)之間的疏水相互作用，從而提高了蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性[11-15]。低濃度下，多羥基化合物形成的水化層強(qiáng)度和厚度也隨其濃度提高而增加。利用該特性，只需比較混合溶液中各組分保護(hù)效果的簡(jiǎn)單加和與實(shí)測(cè)的凝乳酶活力是否存在較大差異，即可確定多羥基化合物混合溶液中各成分對(duì)凝乳酶熱穩(wěn)定性的影響是否存在相互作用。

3.2 多羥基化合物對(duì)凝乳酶分子結(jié)構(gòu)的影響

表4中關(guān)于葡萄糖對(duì)熱處理凝乳酶熒光發(fā)射峰影響顯示，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，凝乳酶熒光發(fā)射峰的位置紅移，強(qiáng)度降低。Trp熒光光譜最大發(fā)射峰的變化，可推斷蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的信息。Trp作為高度疏水的基團(tuán)，常位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。蛋白質(zhì)變性過程中，其內(nèi)部的疏水氨基酸逐漸向外暴露，熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度會(huì)顯著降低，發(fā)射峰的位置也會(huì)不斷紅移。當(dāng)Trp殘基處于疏水性環(huán)境中時(shí)，其熒光發(fā)射峰在330～332 nm。隨著蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的逐漸松弛，Trp殘基逐漸暴露于水相中，其熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，最大發(fā)射波長(zhǎng)λmax也逐漸紅移至350～352 nm[16]。表4的結(jié)果顯示，含葡萄糖組凝乳酶熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度和位置的變化幅度均低于對(duì)照組，表明加入葡萄糖能顯著的提升凝乳酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。

表4 葡萄糖對(duì)熱處理凝乳酶熒光發(fā)射峰的影響

3.3 混合多羥基化合物對(duì)凝乳酶保護(hù)作用

以三元線性回歸分析總濃度5.0%的葡萄糖、海藻糖和甘油溶液對(duì)凝乳酶的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、海藻糖和甘油的混合溶液對(duì)凝乳酶的熱保護(hù)效果與三者同濃度下單一組分作用效果之和基本一致，表明實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)3種多羥基化合物對(duì)凝乳酶的熱穩(wěn)定作用基本無(wú)相互影響。這可能是由于，在多羥基化合物濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)周圍的水化層尚未飽和，因此混合溶液中各種多羥基化合物都能與凝乳酶周圍的水分子形成氫鍵，起到提升蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用[13-14]。而以酶活力和兩個(gè)三元線性回歸方程中3個(gè)X變量的比值也基本相當(dāng)，則體現(xiàn)了多羥基化合物提高凝乳酶熱穩(wěn)定性對(duì)催化活力與分子構(gòu)象作用效果的一致性。

4 結(jié) 論

在0～0.5%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，多羥基化合物的濃度與凝乳酶殘余活力正相關(guān)，同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下對(duì)凝乳酶的保護(hù)效果：葡萄糖＞海藻糖＞甘油。多羥基混合溶液中各化合物對(duì)凝乳酶的保護(hù)效果接近其混合溶液?jiǎn)为?dú)作用效果的總和，表明較低濃度下，混合溶液中多羥基化合物間相互作用較弱或無(wú)相互作用。熱處理后凝乳酶熒光發(fā)射峰紅移，發(fā)射強(qiáng)度也明顯降低，加入多羥基化合物后，發(fā)射峰紅移和發(fā)射強(qiáng)度降幅有所減少。該結(jié)果提示熱處理導(dǎo)致凝乳酶分子結(jié)構(gòu)變得更加松散，而多羥基化合物具有穩(wěn)定凝乳酶分子三維構(gòu)象的作用。以殘余酶活力和熒光差譜AUC305nm-369nm為因變量的三元線性方程，其自變量的回歸系數(shù)分別為13.229：9.595：4.819和-79489：-63257：-33959，回歸系數(shù)比例較為接近，說明多羥基化合物對(duì)凝乳酶的熱穩(wěn)定作用在分子結(jié)構(gòu)與催化功能方面的效果是一致的。