牛文君

(鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校，鄭州 450064）

0 引 言

乳源性運動營養(yǎng)品是指以牛乳為主要原料制成的針對運動人群開發(fā)的一類補充蛋白質(zhì)元素的食品[1]，在近些年開始越來越流行。隨著需求量的大增，促使上游養(yǎng)殖環(huán)節(jié)能夠縮短飼養(yǎng)的周期，提高飼料轉(zhuǎn)化率等[2-3]，而激素的使用能達到上述的效果。所以畜禽在飼養(yǎng)過程中易受到多種人工激素濫用的影響[4-5]，如雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮等，這也導(dǎo)致激素殘留問題影響到消費者的食品安全，因此有必要建立一種檢測含乳源性食品中激素殘留的方法，特別是對運動員這類特殊人群的運動營養(yǎng)品中激素殘留的篩查檢測，評價此類食品的安全具有重要意義。

乳源性食品中檢測激素方法有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-9]。薄層色譜法對檢測儀器及人員要求較低，但是此方法精度較差、實驗步驟冗長繁多、重現(xiàn)性不好[10]；酶聯(lián)免疫吸附試驗法具有靈敏、快速等優(yōu)點，但是存在交叉污染反應(yīng)的缺點[11]；高效液相色譜法的檢測穩(wěn)定性較好，但樣品前處理過程繁瑣，且采用的免疫親和柱成本較昂貴[12]。鑒于上述方法存在的前處理中有些步驟和條件的缺陷，或者易定性誤判等不足，本研究運用SPE前處理凈化技術(shù)，簡化提取過程，縮短時間，并依據(jù)質(zhì)譜檢測器具有特異選擇性以及高靈敏度的特性，嘗試建立了SPE凈化技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS法檢測乳源性食品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮5種激素的方法，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，降低了檢測成本、提高了檢測效率，可作為乳源性運動營養(yǎng)品中激素的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；API 3500 QTrap超高壓液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB公司；雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮標準物質(zhì)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機購買的市售乳源性運動營養(yǎng)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

本試驗的色譜柱選用Zorba-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3μm)；進樣量為2μL；流速為0.15 mL/min；柱溫為30℃；流動相為A：0.20%甲酸溶液，B：乙腈；洗脫條件見表1。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件

1.3.2 樣品的提取與凈化

稱取2.0 g樣品加入20 mL提取溶液，超聲提取10 min，離心后取上清液。取2 mL上清液再進行固相萃取，步驟為：依次用2 mL甲醇和2 mL水活化SPE小柱，然后上樣，再選用5 mL水和5 mL甲醇進行淋洗，最后用5 mL 5%氨水甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液氮氣吹干后用2.0 mL乙腈溶解，過濾膜后上機測定。

1.3.3 標準曲線的建立

吸取10μL的5種激素的標準溶液，用甲醇定容到10.0 mL配制成100.0 ng/mL的中間液，再配制成1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL一系列標準溶液，經(jīng)儀器進行分析，繪制標準曲線。

1.3.4 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出5種激素的乳源性運動營養(yǎng)品為空白基質(zhì)，加入3個梯度的混合標液，使用SPE小柱提取后，上機檢測計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

參考相關(guān)文獻[13-15]，5種激素組分屬堿性物質(zhì)，故選擇中性或者偏酸性溶液提取。本實驗分別比較∶提取溶液Ⅰ（純甲醇溶液）、提取溶液Ⅱ（V甲醇：V水=1∶1、提取溶液Ⅲ（V0.2%甲酸∶V甲醇∶V水=10∶80∶10）、提取溶液Ⅳ（V甲醇∶V0.2%甲酸=90∶10），分別提取加標樣品中的目標物，記錄下目標物峰面積，分析不同類型的提取溶液對激素提取的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 4種提取溶液對激素回收率的影響

由圖1可知，提取溶液Ⅳ的提取效果整體優(yōu)于其他3種提取溶液的效果最優(yōu)，5個目標組分的峰面積最高，這與激素的堿性化合物性質(zhì)有關(guān)，在此比例的偏酸性提取溶液條件下，目標物在提取液中的分配系數(shù)高，實現(xiàn)較滿意的提取效果，不同提取溶液間目標組分的峰面積差異顯著(P＜0.05），所以選擇甲醇-0.2%甲酸（體積比90∶10）比較適合進行下一步的實驗方案。

2.2 SPE柱的選擇

由于激素的化學結(jié)構(gòu)中具有含氮堿性中心，其在弱酸或者堿性條件下能離子化成為分子[16]，實驗對比了已經(jīng)商品化了的HLB、PCX以及MCX 3款固相萃取小柱的做凈化效果對比，記錄下目標物峰面積，分析不同類型的SPE柱對5種激素提取的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 5種激素經(jīng)不同SPE柱處理后的比較

由圖2可知，MCX小柱回收率最好，5個目標組分的峰面積最高，且不同類型SPE柱間目標組分的峰面積差異顯著(P＜0.05），因此選擇MCX小柱進行固相萃取凈化。且對60 mg/3 mL和150 mg/6 mL兩種規(guī)格的MCX小柱進行比較，發(fā)現(xiàn)對5種激素都有非常好的保留，回收率沒有明顯差異，從節(jié)省成本的角度考慮，60 mg/3 mL小柱更為合適。

2.3 流動相的選擇

在流動相選擇中，比較了純乙腈、乙腈-水（體積比1∶1）、純甲醇、甲醇-水（體積比1∶1）、甲醇-0.1%甲酸（體積比1∶1）和乙腈∶0.20%甲酸（梯度洗脫）作為流動相條件下激素檢測靈敏度及出峰情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相中沒有甲酸存在的情況，如：純乙腈、乙腈-水（體積比1∶1）、純甲醇和甲醇-水（體積比1∶1）流動相條件下，5種激素的電離效果較差，出現(xiàn)峰拖尾、峰型對稱性差、靈敏度下降等情況。而選擇乙腈-0.20%甲酸（梯度洗脫）為流動相則得到改善，因此選用乙腈-0.20%甲酸作為流動相。又因運動營養(yǎng)品中基質(zhì)干擾較大，在流動相條件中設(shè)置梯度條件可避免樣品中的基質(zhì)干擾，使得目標組分的定性和定量更加準確，可以獲得較好的實驗結(jié)果（圖3）。

圖3 5種激素的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度分別為雌酮10.0μg/mL、已烯雌酚0.5μg/mL、雙烯雌酚0.5μg/mL、己烷雌酚0.5μg/mL、孕酮0.1μg/mL的混合標準溶液，對目標物進行一級和二級質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。5種目標物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2，包括目標物的母離子精確質(zhì)量數(shù)，碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)以及去簇電壓和碰撞電壓參數(shù)。

表2 5種激素的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.20%甲酸流動相體系中，以表1梯度洗脫的步驟，按1.3.4實驗步驟配制5種激素的標準溶液，繪制標準曲線。結(jié)果表明：5種激素在一定線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，5種激素的檢出限（LOD）范圍為0.3～6.5μg/kg，定量限（LOQ）范圍為1～20μg/kg，結(jié)果見表3。

表3 5種激素的保留時間、標準曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

在加標回收實驗中，分別選用液態(tài)和固態(tài)2種基質(zhì)形態(tài)的乳源性運動營養(yǎng)品，分別添加2倍限量、5倍限量和10倍限量低、中、高的三個水平混合標準品，每個結(jié)果測定5次，進行加標回收的試驗。

由表4可見，在2種不同的形態(tài)基質(zhì)樣品中，5種激素的加標回收率為82.3%～106%，精密度為2.11%～5.67%，說明本實驗的檢測數(shù)據(jù)的準確度和精密度可行。

表4 方法的回收率及相對標準偏差(n=5)

3 結(jié) 論

本文建立了一種SPE-HPLC-MS/MS檢測乳源性運動營養(yǎng)品中5種激素殘留的分析方法。實驗結(jié)果表明，樣品由甲醇-0.2%甲酸（體積比90∶10）進行提取后，經(jīng)60 mg/3 mL的MCX固相萃取小柱凈化處理后，可有效去除樣品中的干擾物對目標峰的影響，實現(xiàn)對5種激素組分的凈化，在質(zhì)譜檢測器的多反應(yīng)監(jiān)測模式下，可實現(xiàn)同時對樣品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮5種激素的定性和定量分析。試驗建立的方法加標回收率范圍為82.3%～106%，相對標準偏差在2.11%～5.67%之間，具有可靠的準確度和精密度，能準確快速有效地檢測乳源性食品中的5種激素的含量，可為乳源性運動營養(yǎng)品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。