劉靖文，劉 柳，陳飛龍，陳紹興

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

1990年，Woese通過對生物的核糖體小亞基rRNA(原核生物16S rRNA、真核生物的18S rRNA)基因序列的分析提出三域?qū)W說，將生物界分為真核生物域、細(xì)菌域和古菌域三大域，并正式提出古菌(Archaea)的概念[1]。早期發(fā)現(xiàn)的古菌通常生活在極端環(huán)境中，地球最古老的生命可能是這些極端微生物，因此研究極端微生物對認(rèn)識生命的起源及進(jìn)化機(jī)制具有重要意義。嗜鹽古菌是極端微生物的一大類群，廣泛存在于鹽礦、鹽湖、海洋以及鹽腌制品表面等高鹽環(huán)境[2-4]。它們經(jīng)過長期進(jìn)化，形成了獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理代謝系統(tǒng)，這在環(huán)境治理、食品開發(fā)、工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值[5-8]。

玻利維亞安第斯山脈地區(qū)分布有眾多的高鹽環(huán)境，如鹽礦，其中鹵水型礦床形成于封閉匯水盆地內(nèi)，而后又由火山運(yùn)動及氣候條件的影響產(chǎn)生大量巖脈和礦脈，可能以鹽湖的形式露出地表[9]。玻利維亞位于南美洲內(nèi)陸中西部，地形以高原為主，分布有大量鹽湖[10]。2017年，Haferburg等采用基于16S rRNA基因V3-V4區(qū)的Illumina MiSeq技術(shù)對世界最大鹽湖、玻利維亞烏尤尼鹽湖，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析，首次揭示了該鹽湖存在豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)組成[11]。2019年，Pérez-Fernández等研究烏尤尼鹽湖嗜鹽微生物群落分布與地理位置的關(guān)系，不僅發(fā)現(xiàn)在鹽灘上分布有Haloarcula、Halorubrum、Halorhabdus和Halolamina等嗜鹽古菌，還有Salinibacter和Halorhodospira等嗜鹽細(xì)菌，以及還存在未分類的Gammaproteobacteria成員，還發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌群落在鹽灘上的分布是均勻的，而嗜鹽細(xì)菌菌落則隨地理位置的差異表現(xiàn)出局部變異的分布規(guī)律[12]。

之前的研究主要集中在采用免培養(yǎng)技術(shù)對玻利維亞鹽湖中嗜鹽微生物的群落組成及多樣性進(jìn)行研究。盡管免培養(yǎng)技術(shù)具有很多優(yōu)勢，但也存在如核酸提取、引物和探針的設(shè)計等方面的問題，并且不能揭示那些嶄新的未知物種，也不能獲得具有開發(fā)利用前景的微生物菌株資源[13]。

因此本研究采用純培養(yǎng)方法對玻利維亞進(jìn)口商品鹽樣品的嗜鹽微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過16S rRNA基因的測序和序列相似性分析，確定所分離菌株的分類地位。在此基礎(chǔ)上，對該樣品中的嗜鹽微生物群落組成和物種多樣性進(jìn)行系統(tǒng)研究，并且選取部分代表菌株進(jìn)行胞外酶活及拮抗作用測定。這不僅使我們對玻利維亞鹽樣品中可培養(yǎng)嗜鹽微生物群落組成及物種多樣性有所了解，而且獲得了一批胞外酶活性較高或產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的具有開發(fā)利用潛力的菌株資源。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

袋裝玻利維亞商品鹽(280克包裝)，由辰馬國際有限公司生產(chǎn)，品名為“印帝歐玫瑰鹽-細(xì)粉狀”，原產(chǎn)地為玻利維亞安第斯山。樣品呈肉粉色，為巖鹽(圖1)。

圖1 玻利維亞商品鹽Figure 1 The commercial salt imported from Bolivia注：a袋裝商品鹽；b商品鹽樣品形態(tài)

1.2 培養(yǎng)基的配制

本研究采用嗜鹽古菌常用的AS-168培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的成分和含量為(每升)：NaCl 200g、MgSO4·7H2O 20g、KCl 2g、檸檬酸鈉3g、谷氨酸單鈉1.8g、FeSO4·4H2O 50mg、MnCl2·4H2O 0.36mg、酸水解酪蛋白5.0g、酵母粉5.0g，用蒸餾水補(bǔ)足1升[14]。

為了研究不同pH條件下嗜鹽微生物的群落組成，將AS-168培養(yǎng)基的pH用1M的NaOH分別調(diào)至7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。固體平板的配制：以1.5%(w/v)的比例加入瓊脂粉，1×105Pa，20min，滅菌，倒平板(～25mL/皿)[15]。

1.3 主要試劑和儀器

NaCl、MgSO4·7H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酸水解酪蛋白氨基酸、酵母粉，Oxoid公司；PCRMix，北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫震蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能公司；臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.4 商品鹽樣品溶解及微生物復(fù)蘇培養(yǎng)

將10g商品鹽樣品溶解到100mL已滅菌的10%(w/v)NaCl溶液中。取500μL均勻涂抹于不同pH的固體AS-168平板上。將每個平板用保鮮膜封口，置于37℃，培養(yǎng)3-4周。

待菌落形成后，用滅菌牙簽將所形成的單菌落，通過平板劃線，轉(zhuǎn)移到相應(yīng)pH值的新鮮固體平板上。經(jīng)連續(xù)3-4次平板劃線，獲得各個菌株的純培養(yǎng)物，并對所分離的菌株進(jìn)行編號。

1.5 16S rRNA基因序列測定

1.5.1 DNA模板制備 對于純水裂解型的菌株，挑取少量菌株純培養(yǎng)物菌苔，重懸于50-100μL蒸餾水中。該細(xì)胞裂解液即可作為純水裂解型菌株16S rRNA基因擴(kuò)增的模板。

對于純水不裂解型的菌株，則同樣挑取少量菌苔，重懸于50-100μL蒸餾水中，用等體積的酚氯仿溶液(苯酚:氯仿=1:1;v/v)抽提(12,000r/min離心5min)收集的上清液再用氯仿抽提(12,000r/min離心5min)，收集的上清液即為總DNA模板。

1.5.2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增 以上述制備的總DNA為PCR擴(kuò)增模板，選用F8(5’-TTGATCCTGCCGG

AGGCCATTG-3’)和R1462(5’-ATCCAGCCGCAGATTCCCCTAC-3’)為引物，配制PCR擴(kuò)增體系[16]。PCR擴(kuò)增體系(50.0μL)包括25.0μL 2×PCR mix(擎科生物北京)、2.0μL總DNA模板(20ng/μL)、2.5μL引物F8(10μmol/L)、2.5μL引物R1462(10μmol/L)、18.0μL dd H2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)；接著72℃體外延伸7min[17]。

擴(kuò)增結(jié)束后，取5.0μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測成功的剩余PCR產(chǎn)物送生物公司(擎科生物昆明分部)，使用引物R1462進(jìn)行DNA測序。

1.6 物種分類地位確定

從測序公司獲得測序原始峰圖，用BioEdit進(jìn)行初步分析[18]，截取可信度較高的中間區(qū)域，導(dǎo)入GenBank或EzBioCloud數(shù)據(jù)庫[19]，與已發(fā)表種的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似度比對分析。以≤98.5%的16S rRNA基因序列相似性作為屬于相同種標(biāo)準(zhǔn)[20]，確定所分離菌株的分類地位。

1.7 物種多樣性分析

根據(jù)上述所確定的菌株分類地位，對本研究分離的所有菌株進(jìn)行物種多樣性分析。計算商品鹽樣品總體和不同pH條件下的物種多樣性，如香農(nóng)-威納指數(shù)、辛普森指數(shù)、瑪格列夫豐富度指數(shù)、皮洛均勻度指數(shù)和貝格-派克優(yōu)勢度指數(shù)[21]。

1.8 胞外酶活檢測

從所分離的嗜鹽古菌每個物種中選1-2個代表菌株進(jìn)行胞外酶活測定。

(1)氧化酶活性：將新鮮菌苔涂抹于用1%的對氨基二苯胺鹽酸鹽水溶液和1%的α-萘胺溶液的混合溶液浸潤的濾紙上。在10s內(nèi)菌苔出現(xiàn)藍(lán)色為陽性，10-60s內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色為延遲反應(yīng)，60s內(nèi)未出現(xiàn)藍(lán)色為陰性反應(yīng)[22]。

(2)觸酶活性：用5%的H2O2溶液覆蓋新鮮菌苔，有氣泡產(chǎn)生為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)[22]。

(3)淀粉酶活性：將菌株劃線在含有1%(w/v)的可溶性淀粉的AS-168固體平板上，待菌落形成后，用碘液覆蓋平板，觀察菌落周圍有無透明圈。若菌落周圍有透明圈說明胞外淀粉酶陽性。

(4)明膠酶活性：將菌株劃線于含1%(w/v)明膠的AS-168固體平板上，待菌落形成后，用Frazier試劑檢測明膠液化情況。若菌落周圍有透明圈說明胞外明膠酶陽性[23]。

(5)蛋白酶活性：將菌株劃線于含1%(w/v)脫脂奶粉的AS-168固體平板上，待菌落形成后，觀察菌落周圍是否有蛋白水解圈。若菌落周圍有透明水解圈說明胞外蛋白酶陽性[23]。

1.9 拮抗作用測定

為了測定分離菌株的拮抗作用，我們選取pH值7.5條件下能正常生長的菌株為待測菌株，以實(shí)驗(yàn)室保藏的另4株嗜鹽古菌：Haloferaxsp.Q22、Halorubrumsp.LN72、HaloarculahispanicaATCC 33960和Halorubrumsp.F4等，作為拮抗作用的指示菌(見表1)。

表1 拮抗作用指示菌

將Q22、LN72、ATCC 33960和F4等4株指示菌分別接種于pH為7.5的AS-168液體培養(yǎng)基中，37℃，180r/min培養(yǎng)，待菌懸液OD600接近1.0時，將10mL各上述菌株菌懸液加入100mL(～55℃)固體培養(yǎng)基中?；靹蚝蟮蛊桨?，制作4種指示菌平板。

將選出的在相同pH值(pH7.5)能正常生長的20個代表菌株，分別在上述4種指示菌平板上劃線，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)10天，觀察抑菌圈。

2 結(jié)果

2.1 物種組成總體分析

利用不同pH值的AS-168培養(yǎng)基從玻利維亞商品鹽樣品中共分離到505株嗜鹽微生物，以16S rRNA基因測序及序列相似性比對分析，確定所分離菌株的分類地位。這505株嗜鹽微生物全部屬于嗜鹽古菌，菌株分布于Natrialbales、Haloferacales和Halobacteriales等3個目，Natrialbaceae、Halorubraceae、Haloferacaceae、Halococcaceae、Halobacteriaceae和Haloarculaceae等6個科，Natronococcus、Natrinema、Natrialba、Halovivax、Haloterrigena、Halorubrum、Halopenitus、Halobellus、Halococcus、Halobacterium、Halalkalicoccus、Haloarcula和Halosimplex等13個屬(表2)。目前嗜鹽古菌現(xiàn)有的3個目和6個科本研究所分離的菌株均有分布(表2)。

來自于Halobacterium屬的菌株最為豐富，共有180株，占所有菌株數(shù)量的35.6%。菌株數(shù)量排在前5的屬分別是Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus和Halorubrum，這5個屬的菌屬數(shù)量占所有菌株數(shù)量的90.5%(表2)。目前報道的Halobacterium屬有6個物種，而本研究揭示的Halobacterium屬菌株全部屬于一個物種，即Halobacteriumnoricense。

表2 玻利維亞商品鹽可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落組成情況

此外，Halorubrum屬共分離到50個菌株，分別來自于10個物種，Haloarcula屬共分離到70個菌株，分別來自于9個物種。這是本研究揭示的物種數(shù)最豐富的2個屬。

2.2 不同pH培養(yǎng)條件下可培養(yǎng)嗜鹽古菌比較

2.2.1 不同pH條件下物種組成 從pH7.5的培養(yǎng)基中分離到188株嗜鹽古菌，分別屬于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halalkalicoccus、Halopenitus、Halorubrum、Natrinema和Natrialba等8個屬；從pH8.0的培養(yǎng)基中共分離到195株嗜鹽古菌，分別屬于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halosimplex、Halopenitus、Halorubrum、Halobellus、Natrinema、Haloterrigena和Halovivax等10個屬；從pH8.5的培養(yǎng)基中共分離到51株嗜鹽古菌，分別屬于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus和Halorubrum等5個屬；從pH9.0的培養(yǎng)基中共分離到62株嗜鹽古菌，分別屬于Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus、Halorubrum、Natrialba和Natronococcus等7個屬；從pH9.5的培養(yǎng)基中共分離到9株嗜鹽古菌，分別屬于Halorubrum、Natrialba和Natronococcus等3個屬(表2)。

從獲得的菌株數(shù)量看，從pH8.0的培養(yǎng)基中分離到的菌株最多，為195株，而從pH9.5中分離到的菌株最少，為9株。在pH8.0條件下，平均每分離19.5株獲得一個不同屬，而在pH9.5的條件下，平均3株一個屬。說明在pH9.5條件下，獲得不同屬菌株的概率更高，更容易分離到不同屬的菌株(表2)。

我們將pH7.5作為較低pH；將pH8.0作為中度pH；將pH8.5作為較高pH；將pH9.0和pH9.5歸為高pH。通過共有和特有分類單元比較分析，發(fā)現(xiàn)上述4種pH條件都分離到Halobacterium、Halococcus、Haloarcula、Halopenitus和Halorubrum屬菌株，說明這5個屬的菌株能適應(yīng)較廣泛的pH范圍。在pH8.0的條件下，特有屬的數(shù)量最多；pH值低于或高于8.0時，特有屬數(shù)量均顯著減少(圖2)。

圖2 不同pH條件下共有和特有屬數(shù)量和占比分析Fig.2 Common and unique genera of different pH media

2.2.2 不同pH培養(yǎng)條件下優(yōu)勢種分析 從玻利維亞商品鹽樣品所分離到的505株可培養(yǎng)嗜鹽古菌中有281株來自Halobacteriaceae科。其中來自Halobacterium屬的菌株數(shù)量最多，有180株，占總分離數(shù)的35.6%，是該生境的絕對優(yōu)勢物種，這可能也是使鹽樣品呈粉紅色的最主要原因。其次是來自Halococcus屬菌株，有101株，占20.0%，這是該生境的次優(yōu)勢類群(表2)。

各屬級水平的組成情況如圖3所示，在不同pH條件下從玻利維亞商品鹽樣品中分離得到的優(yōu)勢物種不盡相同。在pH為7.5和8.5的培養(yǎng)基分離的嗜鹽古菌中，分別有107株、30株來自Halobacterium屬，分別占所分離菌株的56.9%、58.8%，說明Halobacterium屬菌株為該pH生境中的優(yōu)勢物種(圖3)。在pH為9.5的條件下共分離到9株嗜鹽古菌，其中有7株來自Natrialba屬，占比77.8%，說明Natrialba屬菌株為嗜鹽嗜堿類群，也成為較高pH條件下的優(yōu)勢物種(圖3)。而在pH為8.0和9.0的培養(yǎng)基中，嗜鹽古菌種類分布較均勻，優(yōu)勢種的優(yōu)勢地位并不明顯：在pH8.0條件下Halobacterium屬菌株最多，有42株，占比21.5%；在pH9.0條件下Halopenitus屬菌株最多，有22株，占比35.5%(圖3)。

圖3 玻利維亞商品鹽可培養(yǎng)嗜鹽古菌組成(屬級水平)Fig.3 Composition of cultivable halophilic archaea from commercial salt of Bolivia (genus level)注：不同顏色代表不同屬嗜鹽古菌，色塊高度代表該屬占比。

2.3 不同pH培養(yǎng)基分離的嗜鹽古菌多樣性分析

對從不同pH培養(yǎng)條件下分離到的嗜鹽古菌進(jìn)行多樣性分析(表3)。在pH8.0條件下，可培養(yǎng)嗜鹽古菌的香農(nóng)-威納指數(shù)最高，為2.8；pH9.0其次，為2.4。在pH8.0和pH9.0條件下，辛普森指數(shù)最高，為0.9。在pH8.0條件下的瑪格列夫豐富度指數(shù)最高，為5.9；pH9.0其次，為4.1。指數(shù)越高，物種多樣性越高。

表3 可培養(yǎng)嗜鹽古菌的多樣性分析

在pH9.5條件下，皮洛均勻度指數(shù)最高，為0.8；pH9.0其次，為0.6。指數(shù)越高均勻度越高，相同物種數(shù)的條件下多樣性指數(shù)越高。在pH8.0條件下，貝格-派克優(yōu)勢度指數(shù)最低，為0.2；pH9.0和pH9.5其次，為0.3。指數(shù)越高，優(yōu)勢物種的優(yōu)勢地位越明顯。

通過上述五種多樣性指數(shù)分析，可以得出，在pH為8.0和9.0培養(yǎng)條件下物種多樣性較高。具體體現(xiàn)在物種數(shù)量豐富，優(yōu)勢種在群落中地位不明顯，物種個體數(shù)目較為均勻。

2.4 胞外酶活特征

從上述可培養(yǎng)嗜鹽古菌每個物種中選取1株生長較快的代表，共選取39株菌，進(jìn)行了胞外酶活測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2株具有蛋白酶活性，均為Natrialba屬菌株；5株具有明膠酶活性，分別來自于Halococcus、Halovivax和Natrialba屬菌株；6株具有淀粉酶活性，分別屬于Natrialba、Haloterrigena、Halococcus、Haloterrigena和Halalkalicoccus屬(表4)。大多數(shù)菌株具有氧化酶和觸酶活性(表4)。其中屬于Natrialba屬的J-8、J-9菌株具有淀粉酶、明膠酶、蛋白酶等多種胞外酶活性，具有較大的開發(fā)利用前景。

表4 胞外酶活測定

2.5 部分菌株的拮抗作用

從所選取的20株嗜鹽古菌對Q22、LN72、ATCC 33960和F4等4株菌的拮抗作用結(jié)果看，來自于Haloterrigena屬的菌株J-68對上述4個指示菌均具有明顯的拮抗作用(表5)。這為探索發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌來源新型抑菌活性物質(zhì)提供材料。

表5 拮抗作用

3 討論

玻利維亞安第斯山脈附近分布有眾多的高鹽環(huán)境，其中鹵水型礦床形成于封閉匯水盆地內(nèi)，多以鹽湖的形式露出于地表[10，24]。獲得純培養(yǎng)物不僅可以了解嗜鹽古菌在鹽湖生態(tài)中的分布，也是開發(fā)利用微生物資源的前提[25]。本研究從玻利維亞進(jìn)口商品鹽樣品中共分離到505株嗜鹽古菌，并結(jié)合16S rRNA基因的測序和序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，這些菌株分布于嗜鹽古菌現(xiàn)有的所有3個目6個科。

盡管我們采用純培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)了大量的嗜鹽古菌物種，但Haferburg等[11]和Pérez-Fernández等[12]通過高通量測序所揭示的相關(guān)研究中Halonotius和Halohabdus等屬物種在本研究中并未發(fā)現(xiàn)?？赡芘cHalonotius和Halohabdus屬菌株主要生活于中性pH條件有直接關(guān)系[26-27]。目前對嗜鹽古菌培養(yǎng)條件的探索尚未成熟，本研究所采用pH7.5-9.5的人工篩選條件不利于這兩個屬物種的生存。

從目前分離的505株嗜鹽古菌來看，13個屬、39個種，豐富度指數(shù)為6.1，Simpson指數(shù)為0.8，Shannon指數(shù)為2.5，表明玻利維亞鹽礦中具有較為豐富的微生物資源。此外，貝格-派克優(yōu)勢度指數(shù)為0.4，相比而言，青海湖、察爾汗鹽湖和新疆艾比湖的可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落優(yōu)勢度指數(shù)分別為0.3、0.2、0.3[21,25,28]。說明本研究所揭示的優(yōu)勢種在群落中的優(yōu)勢地位較高，說明在漫長的地質(zhì)變化中該物種已經(jīng)對玻利維亞獨(dú)特的鹽礦環(huán)境產(chǎn)生了高度適應(yīng)，占據(jù)了有利的生態(tài)位，從而成為優(yōu)勢種。高通量測序和本研究的純培養(yǎng)方法均表明玻利維亞鹽湖生態(tài)中Halobacterium屬菌株占據(jù)優(yōu)勢地位，為明顯的優(yōu)勢類群[11-12]。此外，通過對比優(yōu)勢物種的16S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)不同菌株間存在一定程度的序列差異變異，這意味著玻利維亞鹽礦中的微生物群落演替還處于活躍狀態(tài)，在接下來的發(fā)展中種群結(jié)構(gòu)和分布可能會發(fā)生一定變化。綜合來看，玻利維亞鹽礦中可培養(yǎng)嗜鹽古菌數(shù)量較高、物種數(shù)較多但均勻度不高，群落結(jié)構(gòu)發(fā)育還未進(jìn)行到穩(wěn)定狀態(tài)。

許多嗜鹽古菌在生長過程中會分泌一些胞外蛋白，如胞外酶和嗜鹽菌素。嗜鹽菌素是一種蛋白類抗生素，能抑制其他鄰近嗜鹽古菌的生長[29]。胞外酶分泌到周圍環(huán)境中，有分解有機(jī)大分子的能力，從而有利于它們在貧瘠的鹽礦中長期生存[30-31]。本研究從玻利維亞商品鹽樣品可培養(yǎng)嗜鹽古菌中篩選到1株具有產(chǎn)嗜鹽菌素活性的菌株。嗜鹽古菌所產(chǎn)胞外酶(如胞外蛋白酶、淀粉酶和明膠酶)能在高鹽環(huán)境中發(fā)揮功能，因此它們在腌制食品、縮短魚露發(fā)酵周期和皮革的保存等方面均發(fā)揮著重要作用[32-33]。本研究篩選到若干產(chǎn)胞外酶活菌株，可為積累寶貴的嗜鹽微生物菌種資源和極端環(huán)境微生物資源的深入開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。