趙洪超 關(guān)書(shū)博 王丹

摘要 目的：探究不同炮制方法對(duì)黃柏藥效的影響。方法：選擇Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將其隨機(jī)分為蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組與模型組，每組10只，建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組給予對(duì)應(yīng)藥液灌胃干預(yù)，比較各組疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）、結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分及結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）]、氧化應(yīng)激指標(biāo)[超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）]差異。結(jié)果：其中蜜制組、酒制組DAI及組織學(xué)評(píng)分均明顯低于鹽制組、生品組，結(jié)腸組織TNF-α、IL-17水平均明顯低于鹽制組、生品組，結(jié)腸組織IL-10水平均明顯高于鹽制組、生品組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸長(zhǎng)度及結(jié)腸組織SOD、GSH-Px水平均明顯高于生品組，結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)及結(jié)腸組織MDA水平均明顯低于生品組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：不同方法炮制黃柏均可增強(qiáng)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的藥效，尤以蜜制、酒制黃柏增強(qiáng)效果較為突出，可為其炮制工藝提供參考。

關(guān)鍵詞 黃柏;炮制;藥效;潰瘍性結(jié)腸炎;小鼠;疾病活動(dòng)指數(shù);結(jié)腸長(zhǎng)度;結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù);組織學(xué)評(píng)分;炎癥介質(zhì);氧化應(yīng)激指標(biāo)

Effects of Different Processing Methods on Ulcerative Colitis Mice Pharmaceutical Effects of Cortex Phellodendri

ZHAO Hongchao，GUAN Shubo，WANG Dan

（The Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110101，China）

Abstract Objective：To explore the effects of different processing methods on pharmaceutical effects of Cortex Phellodendri.Methods：Balb/c mice were selected as experimental animals.And were randomly divided into a ulcerative colitis group，a honey processing group，a salt processing group，a wine processing group，a crude herb group respectively，with 10 mice in each group.The disease activity index （DAI），colon length，colon gross morphological damage index，histological score and colonic cytokines [tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-10 （IL-10），interleukin-17 （IL-17）] and oxidative stress indicators [superoxide dismutase （SOD），malondialdehyde （MDA），glutathione peroxidase （GSH-px）] were compared between the 2 groups.Results：The DAI and histological score in honey processing group and wine processing group were significantly lower than those in salt processing group and crude herb group.The levels of TNF-α and IL-17 in colon tissues were significantly lower than those in salt processing group and crude herb group while the level of IL-10 in colon tissues was significantly higher than that in salt processing group and crude herb group （P<0.05）.The colon length and levels of SOD and GSH-px in colon tissues in honey processing group，salt processing group and wine processing group were significantly higher than those in crude herb group，and the colon gross morphological damage index and the MDA level in colon tissues were significantly lower than those in crude herb group （P<0.05）.Conclusion：Different processing methods of Cortex Phellodendri can enhance the pharmaceutical effects of ulcerative colitis，especially the honey-processing and wine-processing Cortex Phellodendri have more prominent enhancement effect，which can provide reference for processing technology.

Keywords Cortex phellodendri; Processing; Pharmaceutical effects; Ulcerative colitis; Mice; Disease activity index; Colon length; Colon gross morphological damage index; Histological score; Cytokines; Oxidative stress indicators

中圖分類(lèi)號(hào)：R282;R574文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.015

黃柏是蕓香科植物黃皮樹(shù)的干燥樹(shù)皮，常言道“檗木，黃檗也，今處處有之，以蜀中者為佳”，該藥材性寒味苦，歸腎、膀胱經(jīng)，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之功效，主治以濕熱瀉痢、熱淋澀痛、瘡瘍腫毒、熱淋澀痛等疾病為代表的熱證[1]。傳統(tǒng)的黃柏炮制方法較多，《證治準(zhǔn)繩》記載“生用降實(shí)火，熟用酒制治上，鹽制治下，蜜制治中不傷胃”[2]，可見(jiàn)古代醫(yī)家對(duì)黃柏炮制及辨證用藥的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)已較為全面，但未能從藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)的角度獲得解釋。目前黃柏復(fù)方或組方治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果已獲得廣泛證實(shí)[3-7]，但黃柏具體如何影響治療效果仍不十分明確。本研究旨在分析不同黃柏炮制藥品治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效差異，取得一定成果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物材料 選擇Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，均為雄性，周齡為6～8周，體質(zhì)量為18～25 g，隨機(jī)分為蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組與模型組，每組10只，開(kāi)展為期1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，確保小鼠自由飲水、攝食，光照周期為12 h光照+12 h黑暗，室溫維持在20～25 ℃。

1.1.2 藥品材料 川黃柏原藥材洗凈后切4 mm絲，取適量置于容器中，蜜制黃柏100 g黃柏絲配30 g蜂蜜+30 g蒸餾水拌勻，悶潤(rùn)2 h，取出后在120～130 ℃鍋內(nèi)炒制4 min，放涼即得;鹽制黃柏100 g黃柏絲配2 g食鹽+30 g蒸餾水，悶潤(rùn)2 h，取出后在150～160 ℃鍋內(nèi)炒制6 min，放涼即得;酒制黃柏100 g黃柏絲配20 g黃酒+30 g蒸餾水，悶潤(rùn)2 h，取出后在150～160 ℃鍋內(nèi)炒制6 min，放涼即得;生品直接以蒸餾水潤(rùn)透后干燥即得。分別取適量炮制成品，100 g成品加入1 L蒸餾水浸泡30 min，而后以文火煎煮60 min，趁熱過(guò)濾保留藥液，藥渣回鍋加入0.8 L蒸餾水，文火煎煮60 min，趁熱過(guò)濾，合并2次藥液，濃縮收汁至200 mL備用。

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥方法 小鼠飲用2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）滅菌水，以0.5%羧甲基纖維素鈉滅菌水灌胃，持續(xù)≥5 d，以疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）達(dá)到2分作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，隨后蜜制組、鹽制組、酒制組及生品組小鼠給予相應(yīng)藥液灌胃干預(yù)，劑量按體質(zhì)量0.01 mL/g給藥，在此期間各組均飲用不含DSS的滅菌水。

1.2.2 評(píng)估方法 試驗(yàn)完畢后采用DAI評(píng)估小鼠病情嚴(yán)重程度[8]，分別從體質(zhì)量下降、大便性狀、便血程度3個(gè)方面作出評(píng)價(jià)，每個(gè)方面根據(jù)嚴(yán)重程度計(jì)為0～4分，總分/3為最終得分，分?jǐn)?shù)越高表示病情越嚴(yán)重。處死小鼠并解剖采集完整結(jié)腸，測(cè)量其長(zhǎng)度，以如下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估大體損傷表現(xiàn)[9]，0分：無(wú)損傷。1分：黏膜略微充血。2分：存在潰瘍且累及<25%受損面積。3分：存在潰瘍且累及25%～50%受損面積。4分：存在潰瘍且累及>50%受損面積。將小鼠結(jié)腸組織常規(guī)固定、脫水、透明化、包埋、切片、染色后進(jìn)行光鏡下組織學(xué)觀察，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提出的評(píng)估方法對(duì)其組織學(xué)狀態(tài)作出評(píng)價(jià)[10]，觀察上皮損傷及潰瘍形成、潰瘍深度、淋巴細(xì)胞募集程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)深度、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)深度、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)深度及水腫程度7個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，每個(gè)方面根據(jù)病變程度計(jì)為0～3分，分?jǐn)?shù)越高表示病變?cè)絿?yán)重。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)方法 準(zhǔn)確切取小鼠結(jié)腸相同部位組織100 mg，加入4 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS），組織研磨機(jī)勻漿30 s，并在8 000×g加速度下離心10 min，提取上清，分別采用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）對(duì)應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：s160539、s171157、s161204、s180427、s171013、s170635），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定上述指標(biāo)在上清液中的濃度水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)資料處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間整體比較采用單因素方差分析，對(duì)整體比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)，實(shí)施Student-Newman-Keuls q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAI與結(jié)腸長(zhǎng)度比較 各組小鼠DAI與結(jié)腸長(zhǎng)度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、酒制組DAI均明顯低于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸長(zhǎng)度均明顯大于生品組，且上述4組均明顯大于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分比較 各組小鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)均明顯低于生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、酒制組組織學(xué)評(píng)分均明顯低于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 結(jié)腸組織炎癥介質(zhì)比較 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-10、IL-17水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、酒制組結(jié)腸組織TNF-α、IL-17水平均明顯低于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、酒制組結(jié)腸組織IL-10水平均明顯高于鹽制組、生品組，且上述4組均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 各組小鼠結(jié)腸組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;其中蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸組織SOD、GSH-Px水平均明顯高于生品組，且上述4組均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;蜜制組、鹽制組、酒制組結(jié)腸組織MDA水平均明顯低于生品組，且上述4組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎多由過(guò)食寒涼、嗜食辛辣、暴飲暴食等飲食不節(jié)行為引起脾臟失于運(yùn)化所致[11]，氣血生化乏源而濕濁內(nèi)生熱化，腸胃怫郁，濕勝濡瀉，氣血與濕熱搏結(jié)，化為膿血黏液，氣液宣通不能，故濕熱蘊(yùn)阻腸腑而為病。黃柏治療潰瘍性結(jié)腸炎能控制急性發(fā)作，緩解臨床癥狀，并減少?gòu)?fù)發(fā)[12]，其復(fù)方水煎劑保留灌腸效果尤其確切，可起清熱健脾、化濕止痢之效，但需嚴(yán)格把控用藥劑量、藥液濃度與溫度[13]。本研究結(jié)果顯示，蜜制組、鹽制組、酒制組、生品組小鼠DAI及結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)、組織學(xué)評(píng)分均比模型組更低，結(jié)腸長(zhǎng)度則比模型組更高，這表明黃柏炮制成品及生品治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎效果均屬良好。其中蜜制、酒制黃柏療效較為突出，鹽制黃柏與生品黃柏次之，究其原因可能與不同炮制方法可改變黃柏內(nèi)有效化學(xué)成分保留情況，以及用藥后在小鼠體內(nèi)分布、吸收、代謝、廓清等產(chǎn)生較大影響有關(guān)。

生黃柏具有苦寒之性，清熱燥濕作用強(qiáng)，藥性猛烈而易使氣血下沉，瀉火效果極佳;蜂蜜常用于調(diào)補(bǔ)脾胃、扶正養(yǎng)陰，蜜制法可保護(hù)胃腑不受黃柏寒性所傷，可治療中焦熱病[14];黃酒作為常用藥引，乙醇含量適中且性質(zhì)溫和，充分溶解藥材的有效疏水性成分，提高藥物效能，并令藥性上體，酒制黃柏常用于治療上焦熱病[15];而《藥品辨義》有云“用咸水炒，使咸入腎，主降陰火，救腎水”，可見(jiàn)鹽制黃柏使其苦寒之性進(jìn)一步增強(qiáng)，又引藥下行入腎，增強(qiáng)滋陰降火之功，可主治下焦熱病[16]。現(xiàn)代藥理研究顯示，黃柏有效成分包括小檗堿、小檗紅堿、黃柏堿、檸檬苦素、黃柏酮及木蘭花堿[17-19]，其中尤以小檗堿對(duì)腸道組織作用最為明顯，可促進(jìn)潰瘍愈合、保護(hù)黏膜屏障、抑制炎癥反應(yīng)、維持菌群平衡并增強(qiáng)腸管張力與蠕動(dòng)幅度[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，蜜制組與酒制組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-17水平明顯低于鹽制組與生品組，而IL-10水平則明顯高于鹽制組與生品組，提示蜜制或酒制黃柏相較于鹽制黃柏或生品黃柏能對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠產(chǎn)生更為強(qiáng)效的炎癥反應(yīng)抑制作用。相關(guān)專(zhuān)家提出，雙酯類(lèi)生物堿及醇胺類(lèi)生物堿在體內(nèi)轉(zhuǎn)化效率相對(duì)單酯類(lèi)生物堿更慢，混入蜂蜜后，肝臟代謝易于達(dá)到飽和，生物堿在通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟時(shí)速度減緩，生物堿可在循環(huán)系統(tǒng)中停留更長(zhǎng)時(shí)間，有助于產(chǎn)生持久藥效[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)，蜜制組、鹽制組、酒制組的結(jié)腸組織SOD、GSH-Px水平顯著較生品組更高，而結(jié)腸組織MDA水平則顯著較生存組更低，這說(shuō)明炮制可增強(qiáng)黃柏抗氧化應(yīng)激作用。但不同炮制方法增強(qiáng)效果差異不大，初步分析認(rèn)為，酒制黃柏盡管提高小檗紅堿在局部組織的分布，但由于肝腸循環(huán)的存在，可導(dǎo)致鹽制黃柏小檗紅堿藥時(shí)曲線(xiàn)呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，因此二者綜合作用下，并不對(duì)DSS誘發(fā)的潰瘍性結(jié)腸炎局部氧化反應(yīng)失衡的黃柏藥液灌胃治療效果增強(qiáng)產(chǎn)生影響。

綜上所述，蜜制、鹽制、酒制黃柏與生品黃柏均能有效恢復(fù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度，并逆轉(zhuǎn)結(jié)腸大體損傷，抑制局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中蜜制、酒制黃柏改善小鼠癥狀表現(xiàn)、病變程度及炎癥介質(zhì)表達(dá)效果較為理想，炮制藥材與臨床用藥可以此為據(jù)開(kāi)展相關(guān)工作。

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（2019-07-31收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）