龔曉紅，李桓，李松偉，王炳森，姚曼曼

1 河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南鄭州 450046 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南鄭州 450000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種因免疫功能紊亂、體內(nèi)出現(xiàn)多種自身抗體的自身免疫性疾病[1]。其發(fā)病機(jī)制涉及基因、表觀遺傳、環(huán)境及性激素等多種因素，SLE患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞異?；罨瑫r(shí)，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多種自身抗體，導(dǎo)致皮膚、腎臟、漿膜、血液、神經(jīng)等多系統(tǒng)、多器官受損，臨床表現(xiàn)多樣[2]。目前主要以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療為主[3]。但也存在副作用多、選擇性缺乏等問題。

SLE屬于中醫(yī)學(xué)的“陰陽毒”“蝴蝶斑”“日曬瘡”等范疇。其證型變化難以捉摸，對SLE中醫(yī)證型相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，得出以下規(guī)律:SLE多熱毒熾盛證、陰虛內(nèi)熱證、肝腎陰虛證、氣陰兩虛證；SLE后期多虛證，呈現(xiàn)陰虛內(nèi)熱證、肝腎陰虛證、氣陰兩虛證[4]。上海市中醫(yī)醫(yī)院研究也顯示SLE患者經(jīng)治療病情穩(wěn)定后多向陰虛內(nèi)熱型轉(zhuǎn)化[5]?？梢婈幪撌荢LE發(fā)病過程中一個(gè)重要因素。

青蒿是菊科植物黃花蒿（Artemisia annuaL.）的干燥地上部分，性寒，味苦、辛，苦寒清熱，辛香透散，善使陰分伏熱透達(dá)外散；歸肝、膽經(jīng)。具有清透虛熱，涼血除蒸，解暑截瘧等功效，用于治療暑熱外感、夜熱早涼、骨蒸勞熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸等癥，為陰虛發(fā)熱之要藥[6]。大量臨床及動(dòng)物研究[8-14]表明以青蒿鱉甲為主的方藥聯(lián)合常規(guī)西藥治療SLE可以起到增效減毒的效果。青蒿素（artemisinin）為青蒿的主要有效成分之一。研究[15-19]表明青蒿素類衍生物青蒿琥酯、雙氫青蒿素可改善狼瘡小鼠癥狀及相關(guān)指標(biāo)。但目前對青蒿的主要有效成分治療SLE的機(jī)制研究并不全面，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，搜集青蒿有效活性成分及作用靶點(diǎn)，對青蒿治療SLE的作用機(jī)制進(jìn)行全面探討，為進(jìn)一步研究青蒿治療SLE的作用機(jī)制提供一定依據(jù)。

資料與方法

1 青蒿有效成分、靶基因篩選

TCMSP是基于傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)框架而建立的數(shù)據(jù)庫和可視化平臺(tái)，包括在中國藥典注冊的499種中草藥，29383種成分，3311種作用靶點(diǎn)和837種相關(guān)疾病[20]。在檢索框輸入“青蒿”，選擇“Ingredients”，設(shè)置過濾條件:類藥性（DL）＞0.18及口服生物利用度（OB）＞30%，篩選出青蒿的有效活性成分。在“Related Targets”欄目獲取青蒿所有活性成分的靶基因，通過Perl軟件篩選出過濾活性成分所對應(yīng)靶基因，運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫將基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2 SLE相關(guān)基因篩選

人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）和 （OMIM，http://www.omim.org/）均可自動(dòng)整合網(wǎng)絡(luò)資源的基因數(shù)據(jù)，全面提供有關(guān)人類基因注釋和預(yù)測信息[21-22]。通過在OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)平臺(tái)搜索關(guān)鍵詞“Systemic lupus erythematosus”查找與SLE相關(guān)基因。剔除上述數(shù)據(jù)庫中重復(fù)和假陽性的基因，用R軟件（Version3.6.0）繪制Venny圖進(jìn)行靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到共同基因，即為青蒿治療SLE的關(guān)鍵基因。

3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/Version 11.0）是旨在提供蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵評估和整合，包括直接（物理）和間接（功能）關(guān)聯(lián)的一個(gè)平臺(tái)[23]。將藥物與SLE的共同基因?qū)朐摂?shù)據(jù)庫中，研究的物種限制為人類，選擇highest confidence，導(dǎo)出并保存為TSV格式，獲得關(guān)鍵基因PPI關(guān)系文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件（Version 3.7.1），以節(jié)點(diǎn)的大小和顏色表示度值的大小，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，對應(yīng)的度值越大；邊的粗細(xì)表示綜合分值，綜合分值越高，線條越粗。根據(jù)度值，運(yùn)用R軟件篩選出排名前30的核心基因并繪制條形圖。

4 核心靶點(diǎn)的生物功能（GO）注釋和相關(guān)通路（KEGG）分析及可視化

在R軟件運(yùn)行Bioconductor“org.Hs.eg.db”包，將青蒿治療SLE的關(guān)鍵基因名轉(zhuǎn)換成entrezID，運(yùn)行“clusterProfiler”包，設(shè)定P＜0.05，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，繪制GO條形圖和KEGG氣泡圖進(jìn)行功能注釋。其中，氣泡圖和條形圖中圖形顏色越紅表示校正后P值（P.adjust）值越?。还?jié)點(diǎn)越大、條形越長表示富集的靶基因數(shù)量越多。P.adjust值越小并且靶點(diǎn)數(shù)量越多說明其顯著性就更高，也越重要。

5 “藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

創(chuàng)建“藥物-活性成分”、“活性成分-潛在靶點(diǎn)”、“疾病-潛在靶點(diǎn)”相關(guān)文件，導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)（node）分別代表青蒿（qinghao）、活性成分、潛在靶點(diǎn)和SLE。邊（edge）代表青蒿與對應(yīng)活性成分、活性成分與潛在靶點(diǎn)、SLE與潛在靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。在這整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中展示了藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病之間的關(guān)系，通過構(gòu)建該模型更直觀地呈現(xiàn)了青蒿治療SLE的作用機(jī)制。

結(jié)果

1 青蒿成分和靶基因

在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“青蒿”，以O(shè)B＞30%和DL＞0.18進(jìn)行過濾，得到22個(gè)青蒿活性成分。選擇“Ingredients”，得到青蒿所有活性成分作用靶點(diǎn)1344個(gè)，通過Perl軟件篩選活性成分作用靶基點(diǎn)，獲得184個(gè)青蒿活性成分對應(yīng)靶基因。見表1。

表1 青蒿活性成分及OB、DL值

2 SLE相關(guān)基因

在GeneCards、OMIM兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中輸入檢索詞“systemic lupus erythematosus”，分別得到4060個(gè)、63個(gè)SLE相關(guān)基因，經(jīng)去重后得到3983個(gè)SLE相關(guān)基因，與184個(gè)青蒿作用靶基因映射，得到111個(gè)青蒿活性成分治療SLE的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖1。

圖1

3 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將111個(gè)共同靶基因?qū)?String 數(shù)據(jù)庫，將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖 2。圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)表示1個(gè)基因，邊表示2個(gè)基因之間的互作關(guān)系，共涉及383條邊，103個(gè)節(jié)點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（degree）的大小，獲得排名前30的靶基因，見圖3。Barplot圖顯示，AKT1、JUN、RELA、MAPK1、IL6、MAPK14、MAPK8、CXCL8前8個(gè)基因排名較前，繪制前8位核心基因與青蒿主要活性成分對應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)除MAPK14外其余7個(gè)基因均與主要有效成分相連，此7個(gè)基因?yàn)楹诵幕颉Ｒ妶D4。

圖2

圖3

圖4

4 “藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

將藥物、活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和疾病關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)圖，圖中紅色三角形代表疾病SLE，綠色六邊形代表藥物青蒿，紫色六邊形代表有效活性成分，藍(lán)色長方形代表關(guān)鍵靶基因。從圖中可以看出，在青蒿的22個(gè)活性成分中，與111個(gè)潛在作用靶點(diǎn)相連接的共18個(gè)，部分單一成分與多個(gè)基因連線，單個(gè)基因也與多種成分連接，表明青蒿是通過多成分、多靶點(diǎn)的方式來治療SLE。見圖5。

圖5

5 GO功能富集分析

通過R軟件運(yùn)行“Bioconductor cluster Profiler”包對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO功能富集，共得到138個(gè)生物學(xué)過程和功能，對P.adjust進(jìn)行降序排列，選擇前20個(gè)用條形圖呈現(xiàn)。圖中顯示青蒿治療SLE可能主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、受體配體活性、類固醇激素受體等功能。見圖6。

圖6

6 KEGG 通路富集分析

通過R軟件運(yùn)行“Bioconductor“clusterProfiler”包對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行KEGG功能富集，共得到157條通路，對P.adjust進(jìn)行降序排列，選擇前20條通路用氣泡圖進(jìn)行呈現(xiàn)。青蒿治療SLE的靶基因主要富集在TNF、IL-17、Toll樣受體、Th17細(xì)胞分化及病毒感染、癌癥等信號通路。見圖7。

圖7

討論

青蒿是我國中醫(yī)藥寶庫中的一大瑰寶。清代陳士鐸《洞天奧旨》云:“日曬瘡，乃夏天酷烈之日曝而成者也……止須消暑熱之藥，如青蒿一味飲之，外用末藥敷之即安”[7]。范永升等通過研究發(fā)現(xiàn)SLE患者總以陰虛為本，以熱毒、瘀血為標(biāo)，并以解毒袪瘀滋陰方“干地黃、鱉甲、青蒿……”來治療SLE，可減少糖皮質(zhì)激素的用量，提高療效[24]。從青蒿中提取的有效成分青蒿素以及新型青蒿素衍生物具有顯著的免疫抑制活性和治療的安全性，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明其具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，對于SLE等自身免疫性疾病有可信的療效[19、25-27]。以往的研究為本文提供了線索，但尚不全面。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的推廣，基于大數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為分析復(fù)雜成分的中藥作用機(jī)制的重要方法，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對青蒿的有效成分進(jìn)行篩選，預(yù)測治療SLE的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路，為后續(xù)青蒿治療SLE的研究提供一定的依據(jù)。

本研究運(yùn)用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過檢索青蒿的活性成分及潛在靶點(diǎn)、SLE相關(guān)靶點(diǎn)，找到青蒿-SLE共同靶點(diǎn)111個(gè)，對這些靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析及KEGG富集通路分析，預(yù)測出青蒿的主要活性成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、青蒿素等，其核心靶點(diǎn)為AKT1、JUN、RELA、MAPK1、IL6、MAPK8、CXCL8基因，通過GO功能和KEGG富集分析，青蒿治療SLE的靶基因主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體配體活性、類固醇激素受體等生物功能，主要富集在TNF、IL-17、Toll樣受體、Th17細(xì)胞分化等信號通路。

主要有效成分槲皮素可通過抑制信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子1和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的激活及絲裂原 活化蛋白激酶家族磷酸化及JAK-STAT等途 徑 抑 制IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12 、TNF-α、MMP-9等的生成發(fā)揮抗炎免疫作用[27-31]。研究表明[32]槲皮素能降低降植烷誘導(dǎo)的SLE樣綜合征小鼠模型自身抗體表達(dá)水平，對SLE的治療可能有一定作用。山奈酚能夠增加Treg細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)水平，揭示了山奈酚對一系列炎癥性疾病預(yù)防和治療的抗炎作用的分子機(jī)制[33]。山奈酚還可以抑制小鼠T淋巴細(xì)胞體外活化和增殖[34]。木犀草素可通過介導(dǎo)多種炎性信號通路（NF-κB；MAPK和AP-1；JAK-STAT）抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IFN和趨化因子等炎癥介質(zhì)的表達(dá)等來調(diào)節(jié)免疫[35-38]。青蒿素類衍生物目前研究較多。朱衛(wèi)星等[17]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可通過調(diào)節(jié)SLE小鼠腎臟IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）表達(dá)水平來改善癥狀。屠呦呦團(tuán)隊(duì)通過雙氫青蒿素（DHA）治療狼瘡小鼠（BXSB小鼠），發(fā)現(xiàn)DHA可抑制其B淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)CD8 + T細(xì)胞的增殖抑制自身抗體產(chǎn)生，從而起到雙向調(diào)節(jié)免疫功能[25-26]。新型青蒿素類衍生物馬來酸蒿乙醚胺（SM934）通過抑制TLR7/9 mRNA的表達(dá)，可減少狼瘡小鼠活化的B細(xì)胞數(shù)量，使?jié){細(xì)胞分泌減少，從而減少IgG和IgM抗體的分泌來緩解癥狀[39]。

通過構(gòu)建關(guān)鍵靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)，以及青蒿主要活性成分與核心基因關(guān)系，確定AKT1、JUN、RELA、MAPK1、IL6、MAPK8、CXCL8為核心基因。研究[40]發(fā)現(xiàn)SLE患者表現(xiàn)出AKT1表達(dá)增加，AKT1可激活A(yù)KT/mTOR途徑，進(jìn)而通過激活T細(xì)胞在SLE的發(fā)病機(jī)理中起作用。遺傳小鼠模型證明，表皮細(xì)胞中Jun /AP-1表達(dá)的缺失通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后途徑控制細(xì)胞因子的表達(dá)，沒有JunB表達(dá)的組織會(huì)導(dǎo)致多器官疾病，其特征是粒細(xì)胞集落刺激因子和IL-6水平升高，可能參與SLE發(fā)病[41]。RELA（p65）是NF-κB家族成員，研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)細(xì)胞核中p65水平，抑制NF-κB途徑可保護(hù)原始誘導(dǎo)的SLE小鼠的腎臟損傷[42]。MAPK1、MAPK8是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員。MAPK級聯(lián)是將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞質(zhì)中以啟動(dòng)細(xì)胞增殖，分化和發(fā)育等細(xì)胞過程的重要途徑。MAPK家族包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2），c-Jun NH2末端激酶（JNK-1/ 2/3），p38 MAPK。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中JNK磷酸化增加，MAPK通路處于激活狀態(tài)[43]。IL-6不僅可促B淋巴細(xì)胞抗體產(chǎn)生，而且在Th細(xì)胞增殖、分化過程中起參與作用，致使大量炎癥遞質(zhì)釋放，加重炎性反應(yīng)，進(jìn)一步加重相關(guān)系統(tǒng)、器官損傷。研究顯示，血清IL-6水平在紅斑狼瘡患者中均呈較高表達(dá)，且活動(dòng)期紅斑狼瘡患者水平明顯升高[44]。CXCL8/IL-18是趨化因子CXC家族成員之一，通過與其受體結(jié)合后趨化中性粒細(xì)胞，而SLE患者中性粒細(xì)胞浸潤參與組織的損傷。研究顯示在活動(dòng)性SLE發(fā)病過程中IL-18顯著升高[45]。

Th17是由Th0細(xì)胞在IL-6和IL-23等因子的刺激下分化而成。它分泌的最重要的效應(yīng)因子是IL-17，其受體在體內(nèi)廣泛表達(dá)，二者受體結(jié)合后介導(dǎo)信號傳遞引發(fā)相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[46-47]。研究發(fā)現(xiàn)SLE發(fā)病過程中，通過Th17細(xì)胞分化和IL-17信號通路產(chǎn)生的IL-17可誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，募集中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤靶器官并造成靶器官損害[48]。Toll樣受體信號通路中的Toll樣受體（TLRs）廣泛分布于免疫細(xì)胞以及上皮細(xì)胞表面，通過激活NF-κB、MAPK p38和JNK等，介導(dǎo)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá)[49]。Guo Y等研究發(fā)現(xiàn)SLE患者的TLR7/9表達(dá)水平顯著增加[50]。TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其調(diào)控的上、下游靶點(diǎn)在SLE的發(fā)病過程中扮演著極其重要的角色，通過調(diào)節(jié)NF-κB的磷酸化激活過程，絲裂原活化蛋白激酶及c-Jun基末端激酶通路激活，使多種細(xì)胞因子（如IL-1、IL-17等）募集、趨化作用增強(qiáng)，介導(dǎo)炎癥、免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡與增殖過程[51-54]。

本工作為研究中藥青蒿在治療SLE的藥效機(jī)制方面提供了初步的預(yù)測，但其確切的作用機(jī)制仍需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。