劉毅，李菲，賈躍進，郝世飛

1 山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西太原 030024 2 山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 山西太原 030024 3 山西省人民醫(yī)院 山西太原 030012

失眠障礙（Insomnia Disorder，ID）被定義為有足夠的睡眠機會和條件下，仍存在持續(xù)的入睡困難，維持困難，早醒或睡眠質(zhì)量差，并導(dǎo)致某種形式的日間功能障礙的睡眠障礙，其患病率約為10%～20%，是最常見的睡眠障礙[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實ID是抑郁癥、心血管疾病以及一些癌癥的重要危險因素[4-6]，是人們身心健康的潛在威脅。盡管西醫(yī)對ID治療有多種藥物可供選擇，但沒有一種藥物可被認為是理想藥物[7]。其目前臨床使用的最廣泛藥物為苯二氮卓類藥物，但存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、運動失調(diào)、記憶損害等副作用，長期應(yīng)用還可誘發(fā)依賴性、成癮性等問題[8]。因而，探索治療ID安全有效的藥物是當下的重要課題。

丹梔逍遙散出自《內(nèi)科摘要》，由丹皮、梔子、當歸、白芍、柴胡、茯苓、白術(shù)、甘草、生姜、薄荷10味中藥組成，具有疏肝健脾，清熱養(yǎng)血的功效，常用以治療肝郁化火證[9-10]。而證候?qū)W研究表明肝火證是ID的主要證型，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認為該方成分具有抗抑郁、抗焦慮和神經(jīng)保護等作用，并且臨床研究證實其對ID有確切治療作用，因此可確定丹梔逍遙散治療ID安全有效[11-13]。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點、多通路發(fā)揮作用的特點，故使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法可以一定程度揭示其作用機制，為進一步研究提供思路和參考[14]。

資料與方法

1 丹梔逍遙散活性成分與靶點搜集

以丹梔逍遙散中各藥物為關(guān)鍵詞在TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中分別檢索，并限定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3，類藥性（drug—likeness，DL）≥0.18，篩選得到其活性成分并匹配靶點，無靶點的活性成分則利用Swisstargetprediction平 臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測靶點，再將得到的靶點在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中匹配基因名。

2 失眠障礙疾病靶點與藥物-疾病靶點交集獲得

以“insomnia disorder”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫中檢索并搜集疾病靶點，合并去重后得到ID疾病靶點。將所獲藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，得出丹梔逍遙散中活性成分直接對ID有作用的靶點，并以Venn圖表示。

3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以疾病、方劑、活性成分、靶點為節(jié)點，邊為相互關(guān)聯(lián)關(guān)系，運用CytoscapeV3.8.0構(gòu)建疾病-方劑-藥物-成分-靶點以及疾病-方劑-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)。然后將交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），設(shè)置物種為:智人，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并選擇網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度＞二倍中位數(shù)者構(gòu)建核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

4 GO（Gene Ontology）富 集 分 析 和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

將交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺（https://metascape.org/）分別進行GO分子功能、細胞成分、生物過程和KEGG通路富集分析，并利用在線作圖平臺ImageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/）將結(jié)果可視化。

5 核心成分和核心靶點分子對接驗證

分別選取疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值＞2倍中位數(shù)的核心活性成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的核心靶點在ZINC（http://zinc.docking.org/）數(shù)據(jù)庫、PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中找到其三維結(jié)構(gòu)，對于沒有結(jié)構(gòu)記錄的靶點則利用SWISSMODEL平臺（https://swissmodel.expasy.org/）模擬構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)，然后將核心成分和核心靶點結(jié)構(gòu)預(yù)處理后使用Autodock vina進行分子對接，并在Pymol中進行可視化。

結(jié)果

1 丹梔逍遙散活性成分與靶點搜集結(jié)果

通過在TCMSP中限定OB、BBB、DL值，獲得牡丹皮活性成分3種，對應(yīng)靶點4個；梔子活性成分10種，對應(yīng)靶點139個；當歸活性成分2種，對應(yīng)靶點69個；白芍活性成分3種，對應(yīng)靶點42個；柴胡活性成分9種，對應(yīng)靶點85個；茯苓活性成分6種，對應(yīng)靶點49個；白術(shù)活性成分4種，對應(yīng)靶點78個；甘草活性成分69種，對應(yīng)靶點1270個；生姜活性成分5種，對應(yīng)靶點90個；薄荷活性成分3種，對應(yīng)靶點43個，其中重復(fù)成分5種，經(jīng)合并排除并去重后，丹梔逍遙散共計得到活性成分102種，對應(yīng)靶點147個，其成分信息見表1。

表1 丹梔逍遙散部分活性成分基本信息

2 ID疾病靶點與藥物-疾病交集靶點獲取結(jié)果

在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中分別得到2281、673、28個ID靶點，合并去重后，得到ID靶點2916個。將其與所得的147個藥物靶點取交集，得到丹梔逍遙散直接對ID作用的52個交集靶點，見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點

3 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

利用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-方劑-藥物-成分-靶點和疾病-方劑-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2、3，其中藍色節(jié)點表示疾病，綠色節(jié)點表示方劑，紅色節(jié)點為靶點或交集靶點，邊為其相互關(guān)聯(lián)關(guān)系，圖2中共有261個節(jié)點，1611條邊，各色矩形為各藥物，以拼音縮寫表示，各色圓形為活性成分，用表1中編號表示；圖3中共計145個節(jié)點，672條邊，以黃色圓形表示各活性成分。綜合以上2個網(wǎng)絡(luò)可得節(jié)點度較大（Degree＞二倍中位數(shù)）的活性成分有:豆甾醇（Stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等12個成分，見表2。將52個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫得出以靶點為節(jié)點，蛋白互作為邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4，得出其節(jié)點數(shù)為52，邊數(shù)為234，平均節(jié)點度為9，平均局部聚類系數(shù)為0.635，再利用Cytoscape分析其節(jié)點度，選取節(jié)點度＞二倍中位數(shù)的靶點為核心靶點構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，見圖5，其核心靶點為:MAOA、SLC6A4、ACHE、MAOB、CHRNA4、TNF、HTR3A。

圖2 疾病-方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 疾病-藥物-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 PPI核心靶點網(wǎng)絡(luò)

4 GO富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

將交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺分別進行GO和KEGG通路富集分析，總體GO富集分析獲得762條結(jié)果，其中GO生物過程、分子功能和細胞成分各得到618、93和51條結(jié)果，然后分別篩選其p值＜0.01，最小計數(shù)為3，富集因子＞1.5的前20、15和9項結(jié)果，繪制富集氣泡圖，見圖6。結(jié)果可見，主要生物過程包括:神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、對類固醇激素的反應(yīng)、對外源物刺激的反應(yīng)、膜電位調(diào)節(jié)、離子傳輸調(diào)節(jié)、細胞分泌調(diào)節(jié)等；分子功能主要涉及:腎上腺素受體活性、銨離子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、類固醇激素受體活性、單胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等；細胞成分則主要有:突觸膜的組成部分、受體復(fù)合體、膜筏、神經(jīng)細胞體等成分。KEGG通路分析得到61條結(jié)果，分別將通路、交集靶點和活性成分作為節(jié)點，其相互關(guān)系為邊構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，以更直觀看出三者關(guān)系，見圖7，然后按照和GO分析相同的篩選條件，選擇其前12項結(jié)果繪制氣泡圖，見圖8，可得主要通路為:神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細胞色素P450介導(dǎo)的藥物代謝、血清素能突觸、癌癥中的蛋白聚糖、催乳素信號通路等，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路基因占比、q值都遠高于其他通路，因此可以判斷藥物最可能藉由該通路發(fā)揮作用，圖9為其具體作用機制。

圖6 GO富集分析氣泡

圖7 活性成分-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖8 KEGG通路富集分析氣泡

圖9 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路機制

5 核心成分與核心靶點分子對接結(jié)果

核心靶點與成分分子對接結(jié)果均＜-5 kcal/mol，見表2，表中標注內(nèi)容為核心成分的MolID、編號和核心靶點的PDBID，可見核心成分與核心靶點均能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。并分別取與每個核心靶點對接最穩(wěn)定的核心成分運用Pymol對其構(gòu)象進行可視化，其中灰色部分為靶點，綠色部分代表關(guān)鍵成分，其余各色標記殘基，并顯示其名稱，黃色虛線為氫鍵，并標示其距離，見圖10。

圖10 核心成分與核心靶點分子對接構(gòu)象

表2 核心活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果

討論

ID屬于中醫(yī)“不寐”的范疇，中醫(yī)對于其有深刻的認識，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期，就有相關(guān)論述:“人之衛(wèi)氣，日行于陽，夜行于陰……日暮在外之陽氣將盡，而陰氣漸盛，則目瞑而臥。[15]”從生理角度闡述了睡眠的發(fā)生機制，睡眠是一個依賴營衛(wèi)之氣推動的節(jié)律周期；而相反:“衛(wèi)氣不得入于陰，長留于陽，則陽氣滿……不得入與陰則陰氣虛，故不目瞑。[15]”則從病理角度闡述了失眠的發(fā)病機理:營衛(wèi)運行失常，節(jié)律周期紊亂而失眠。因而確立了“營衛(wèi)失和，陰陽不交”[16]的總病機與“調(diào)節(jié)律”的治療總綱。而與營衛(wèi)之氣運行相關(guān)性較大的臟腑是肝，氣的正常運行依賴于肝主疏泄的功能。肝病則失疏泄，所謂:“郁而不舒，皆肝木之病也”[17]，分為疏泄太過和疏泄不及:疏泄太過，機體處于亢奮狀態(tài)，易肝郁化火、木旺乘土；疏泄不及，則會造成氣機不暢，肝郁較著，產(chǎn)生痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物。因此調(diào)節(jié)律實為調(diào)氣，調(diào)氣實為調(diào)肝。肝為風木之臟，寄相火而主動，且“氣郁皆屬火”[18]，故治療失眠當多從肝火論。

綜合本研究所構(gòu)建的疾病-方劑-藥物-成分-靶點和疾病-方劑-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)，通過篩選節(jié)點度大于二倍中位數(shù)的活性成分，可得出丹梔逍遙散核心成分12種，其中成分B在動物實驗被證實可使谷胱甘肽、γ-氨基丁酸（GABA）水平上升，多巴胺（DA）、丙二醛、腫瘤壞死因子-α水平以及乙酰膽堿酯酶（AChE）活性下降從而發(fā)揮對精神癥狀的調(diào)節(jié)作用并可上調(diào)神經(jīng)發(fā)生和突觸形成基因而改善腦功能[19-20]；A成分可顯著增加了小鼠腦中的去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）水平，從而介導(dǎo)抗抑郁活性[21]；GC7、GC8、GC20、GC35、GC49、GC58、GC5、GC46、GC51、GC56等成分均為甘草中的黃酮類物質(zhì)，研究認為該類物質(zhì)總體具有抗抑郁和神經(jīng)保護作用[22]，此外，GC8可通過抑制神經(jīng)炎癥改善認知功能[23]；GC49可以活化小膠質(zhì)細胞預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元丟失[24]。篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度大于二倍中位數(shù)的核心靶點，可認為是丹梔逍遙散在ID治療中的核心靶點，該七個核心靶點中:MAOA、MAOB 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺的代謝中具有重要作用，其活性與睡眠的生物學(xué)變化有關(guān)[25]；ACHE編碼的AChE可快速水解終止膽堿能突觸的神經(jīng)傳遞，服用其抑制劑可改善睡眠狀態(tài)[26-27]；CHRNA4編碼煙堿乙酰膽堿受體，其可通過控制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和攝取來調(diào)控睡眠和覺醒功能[28]；HTR3A編碼5-HT受體，SLC6A4則介導(dǎo)5-HT對5-HT能系統(tǒng)受體的調(diào)節(jié)，5-HT是一種神經(jīng)遞質(zhì)，其拮抗劑是一種ID的治療藥物[29-31]；TNF編碼多功能促炎因子，其被證實會增加非快速眼動睡眠時間并被認為是一種睡眠啟動因子[32-33]。

通過GO富集分析得到主要生物過程有神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、對類固醇激素的反應(yīng)等。其中神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)是ID最重要的生物過程，現(xiàn)代研究認為睡眠喚醒周期不同階段的啟動和維持是通過多種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)實現(xiàn)的[34]；已經(jīng)證實NE的神經(jīng)傳遞，尤其是α-腎上腺素能受體功能是人類睡眠-蘇醒調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組成部分[35]；丹梔逍遙散所得核心成分多為類固醇類，存在激素樣作用，類固醇激素如雌激素和孕酮調(diào)控女性一生的睡眠方式變化，皮質(zhì)醇則發(fā)揮促覺醒作用[36]。KEGG通路富集分析得到的主要通路有神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細胞色素P450介導(dǎo)的藥物代謝、血清素能突觸、催乳素信號通路等。其中根據(jù)各項數(shù)據(jù)可得神經(jīng)活性配體-受體相互作用是最可能的治療通路，目前所發(fā)現(xiàn)的促進覺醒/抑制睡眠的物質(zhì)（如:兒茶酚胺，食欲素和組胺）和促進睡眠/抑制覺醒的物質(zhì)（如:GABA，腺苷，5-HT，褪黑素）幾乎都藉由此通路發(fā)揮作用；[37]血清素能突觸通路則與神經(jīng)機制密切相關(guān)，主要涉及5-HT對睡眠覺醒的調(diào)節(jié)[38]；細胞色素P450酶對于藥物的代謝至關(guān)重要，該通路可能涉及丹梔逍遙散中藥物的代謝[39]；催乳素是一種肽類激素，報道認為其有促進神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育，促進睡眠以及神經(jīng)保護的作用。[40]分子對接結(jié)果顯示，核心成分和核心靶點均能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而通過計算結(jié)合力的均數(shù)，又可得到對接較好的核心成分有:GC35（shinpterocarpin）、GC51（4'-甲氧基光甘草定）、B（豆甾醇）和A（β-谷甾醇），可見這四種成分為丹梔逍遙散中治療ID發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分，而這四種成分來自六種中藥物，說明丹梔逍遙散中藥物可協(xié)同發(fā)揮作用；核心靶點有:MAOB、MAOA、SLC6A4，可見丹梔逍遙散最可能通過神經(jīng)系統(tǒng)中的單胺類物質(zhì)和5-HT發(fā)揮作用。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接研究，可以初步揭示丹梔逍遙散治療失眠障礙的關(guān)鍵成分為:shinpterocarpin、4'-甲氧基光甘草定、豆甾醇和β-谷甾醇，作用關(guān)鍵靶點為:MAOB、MAOA、SLC6A4；關(guān)鍵通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸。該結(jié)論可為臨床應(yīng)用和進一步研究提供參考，也可為本課題組課題提供思路。