王苗苗，董 虎，盧淵錄，郭慧琛，孫世琪*，聞曉波

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；3.海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

豆蔻?；侵冈诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白相互作用、蛋白靶向內(nèi)膜和質(zhì)膜系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用的一種蛋白脂質(zhì)修飾[1]，參與細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡等不同生理過(guò)程[2-5]。N-豆蔻?；D(zhuǎn)移酶(N-myristoyltransferase,NMT)可以催化蛋白發(fā)生豆蔻?；?，其催化作用是一個(gè)不可逆的酰化過(guò)程。NMT對(duì)許多生物的生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要。NMT是寄生蟲(chóng)必不可少的酶，已證實(shí)NMT是針對(duì)寄生蟲(chóng)潛在的藥物靶標(biāo)[6-7]，例如布氏錐蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、杜氏利什曼原蟲(chóng)和惡性瘧原蟲(chóng)[8-9]。NMT也被鑒定為白色念珠菌的新型抗真菌靶標(biāo)。Shrivastav A等研究表明，NMT對(duì)調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)以及人類(lèi)免疫缺陷病毒感染至關(guān)重要[10]，N-豆蔻?；募顾杌屹|(zhì)炎病毒衣殼蛋白VP4的定點(diǎn)突變的研究表明，肉豆蔻酸參與病毒衣殼蛋白組裝，對(duì)小RNA病毒復(fù)制組裝及感染性病毒顆粒的裝配至關(guān)重要。

省民族宗教委舉辦2018年清真食品安全監(jiān)管和公民民族成份登記管理業(yè)務(wù)專(zhuān)題培訓(xùn)班 11月6日至7日，省民族宗教委舉辦2018年清真食品安全監(jiān)管和公民民族成份登記管理業(yè)務(wù)專(zhuān)題培訓(xùn)班，來(lái)自全省16個(gè)州市、129個(gè)縣（市、區(qū)）民宗委（局）的業(yè)務(wù)負(fù)責(zé)人共140余人參加培訓(xùn)，省民族宗教委副主任陸永耀出席開(kāi)班動(dòng)員會(huì)。

NMT的催化是一個(gè)共翻譯的過(guò)程，在真核表達(dá)系統(tǒng)中已證實(shí)豆蔻酰化修飾可提高病毒蛋白的組裝效率，而大腸埃希氏菌缺少翻譯后的修飾，也無(wú)NMT活性，因此，在大腸埃希氏菌里表達(dá)的蛋白要與NMT共表達(dá)才能達(dá)到豆蔻?；揎椀哪康?。大腸埃希氏菌具有生長(zhǎng)速度快、代謝途徑和機(jī)制較清楚及遺傳操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，便于制備蛋白，因此本研究將hNMT1基因，克隆至pRSFDuet1原核表達(dá)載體，在大腸埃希氏菌中誘導(dǎo)表達(dá)豆蔻?；D(zhuǎn)移酶，優(yōu)化其在大腸埃希氏菌中的表達(dá)條件，并通過(guò)Ni2+親和層析進(jìn)行純化，采用基于7-二乙胺基-3-(4-馬來(lái)酰亞胺-苯基)-4-甲基香豆素(7-diethylamino-3-(4-maleimidophenyl)-4-methylcoumarin,CPM)檢測(cè)CoA的熒光法測(cè)定hNMT1活性，為下一步探究在大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)中豆蔻酰化對(duì)小RNA病毒樣顆粒組裝效率奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及抗體 原核表達(dá)載體pRSFDuet1及含有N-豆蔻?；D(zhuǎn)移酶的pUC57-hNMT1、口蹄疫病毒VP1、VP4蛋白，由蘭州獸醫(yī)研究所獸用納米材料與應(yīng)用團(tuán)隊(duì)保存；大腸埃希氏菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21-CodenPlus(DE3)-RIL、E.coliTrans5α，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；鼠源抗His單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，NEB(北京)有限公司產(chǎn)品；連接酶SolutionⅠ、PCR擴(kuò)增高保真酶，TAKARA公司產(chǎn)品；Plasmid Mini KitⅠ(200)、Gel Extract Kit(200)，OMEGA公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母粉，OXOID公司產(chǎn)品；卡那霉素、氯霉素、IPTG和咪唑，北京索萊寶公司產(chǎn)品；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，SMOBIO產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(PTC-200)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀(PowerPac Uniwersal)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像分析儀(WD-9413B)，北京市六一生物科技有限公司產(chǎn)品；超微量分光光度計(jì)(nanodrop 2000 c)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；蛋白染色儀(L02016 PD-00452)，南京金斯瑞生物科技有限公司產(chǎn)品；pH計(jì)(FE20K)，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-IID)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 5200)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(3020)，芬蘭Thermo Fisher Scientific Oy公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.7 hNMT1的活性檢測(cè) 使用96孔酶標(biāo)板，每孔加入基礎(chǔ)緩沖液(5 g/L EGTA、pH7.5的20 mmol/L磷酸鉀、5 g/L EDTA、1 mL/L TritonX-100)，然后加入不同濃度的hNMT1并與緩沖液混合，隨后避光加入15 mmol/L的CPM與5 mmol/L的豆蔻酰CoA，最后加入10 mmol/L的VP4蛋白，空白對(duì)照中加入10 mmol/L的VP1蛋白作為陰性對(duì)照，各3個(gè)重復(fù)，室溫避光反應(yīng)30 min，運(yùn)用多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)384 nm激發(fā)波下470 nm發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

反沖質(zhì)子磁譜儀的性能模擬結(jié)合了中子探測(cè)和反沖質(zhì)子的動(dòng)量分析等物理過(guò)程。首先，根據(jù)中子與反沖聚乙烯靶相互作用機(jī)理，采用蒙特卡羅方法模擬不同能量的中子在聚乙烯靶中的輸運(yùn)過(guò)程，獲得反沖質(zhì)子的能量和角分布；其次，以束流光學(xué)計(jì)算為基礎(chǔ)，模擬反沖質(zhì)子在磁分析單元中的色散、偏轉(zhuǎn)和聚焦過(guò)程；最后，獲得反沖質(zhì)子在焦平面上的空間分布。模擬計(jì)算主要分為5個(gè)過(guò)程：

土壤樣品全部采自賀州市荸薺地的0～20 cm表層土壤。每個(gè)采樣點(diǎn)用五點(diǎn)法采集，除去動(dòng)植物殘?bào)w、石礫等雜物，并將大塊樣品捻碎混合均勻后，用四分法選取1 kg土樣，共28份。土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干、研磨，分別過(guò)20和100目尼篩，并保存于玻璃瓶中備用。

比較兩組病患治療前后糖化血紅蛋白數(shù)值變化,顯示兩組均有改善,觀察組改善程度相對(duì)更明顯(p<0.05),詳見(jiàn)表一。

1.2.5.3 目的蛋白可溶性表達(dá)的溫度優(yōu)化 過(guò)夜培養(yǎng)的確定表達(dá)的菌液以1%比例接種至含有50 μg/mL卡那霉素、34 μg/mL氯霉素的5 mL培養(yǎng)基中，按照上述確定的誘導(dǎo)時(shí)菌濃度及IPTG濃度，分別于37℃、25℃和16℃中過(guò)夜表達(dá)，各取1 mL菌液離心后用適量PBS重懸，置于冰水浴中超聲破碎，破碎后4℃離心，各取上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析各溫度下的可溶性蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5.2 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 將確定表達(dá)過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至經(jīng)優(yōu)化所得的菌濃度時(shí)分別加入終濃度為0.05 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L和1.5 mmol/L的IPTG，37℃表達(dá)4 h，SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)劑量。

1.2.4.1 hNMT1的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的質(zhì)粒和空載體pRSFDuet1分別轉(zhuǎn)入表達(dá)菌E.coliBL21-CodenPlus(DE3)-RIL中，各挑取單菌落于3 mL LB培養(yǎng)基(卡那霉素終濃度為50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL)中培養(yǎng)，待OD 600 nm 值至0.8左右，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，取1 mL菌液10 000 r/min離心2 min，用100 μL PBS重懸菌體，空載體作為對(duì)照，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。

1.2.4.2 hNMT1的Western blot鑒定 將表達(dá)的蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Nitrocellulose,NC)上，用50 g/L脫脂乳-TBST室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的抗his標(biāo)簽的鼠源單克隆抗體，4℃過(guò)夜孵育，TBST洗滌5次，加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST洗滌5次，加入ECL發(fā)光液避光反應(yīng)1 min，利用Tanon 5 200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯示結(jié)果。

在當(dāng)代水墨畫(huà)壇，林容生的藝術(shù)風(fēng)格十分鮮明，他在山水畫(huà)上一方面悉心研究文人畫(huà)傳統(tǒng)，著重體悟傳統(tǒng)繪畫(huà)在表現(xiàn)精神性、書(shū)卷氣上的品質(zhì)，一方面勤奮地走向自然，在大量的寫(xiě)生中錘煉自己的筆墨語(yǔ)言，從而使畫(huà)中的“生活”和筆墨的“格調(diào)”二者相得益彰，煥發(fā)華采。

1.2.5 hNMT1蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

1.2.5.1 加入IPTG誘導(dǎo)時(shí)細(xì)菌濃度的優(yōu)化 將確定表達(dá)的菌液過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1∶100比例轉(zhuǎn)接至5 mL培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm值分別在0.5、0.6、0.7、0.9、1.0和1.2時(shí)加入同等濃度的IPTG于37℃中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4 h，各取1 mL菌液離心并重懸菌體，經(jīng)120 g/L SDS-PAGE分析確定誘導(dǎo)時(shí)細(xì)菌最佳濃度。

除了機(jī)遇，周邊景區(qū)也對(duì)廬山西海的客源市場(chǎng)有較大的競(jìng)爭(zhēng)力(例如廬山,星子,黃山等具獨(dú)特的文化旅游資源的景點(diǎn))。在全國(guó)都在加大旅游開(kāi)發(fā)的形勢(shì)下,廬山西海風(fēng)景區(qū)還要面臨來(lái)自中部地區(qū)旅游景區(qū)的競(jìng)爭(zhēng)。除此之外，地方保護(hù)主義和地域的條塊分割等弊端也會(huì)對(duì)廬山西海風(fēng)景區(qū)的客源有一定的分流。

1.2.4 hNMT1蛋白的表達(dá)鑒定

1.2.3 重組質(zhì)粒pRSFDuet1-hNMT1構(gòu)建 膠回收后產(chǎn)物及pRSFDuet1載體分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ/EcoRⅠ在37℃酶切2 h后，膠回收純化相應(yīng)片段，Nano Drop One測(cè)定DNA濃度，經(jīng)SolutionⅠ 16℃連接1 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTrans5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)14 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌落通過(guò)質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，并用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切做進(jìn)一步鑒定。鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。

積差相關(guān)系數(shù).這種方法是Pearson提出來(lái)的，其適用條件為：①兩個(gè)變量都是連續(xù)型隨機(jī)變量；②兩個(gè)變量的總體都呈正態(tài)分布或接近正態(tài)分布；③兩個(gè)變量的取值是一一對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)；④兩個(gè)變量之間呈線性關(guān)系.

阿爾伯塔卒中項(xiàng)目早期CT評(píng)分＞8分的急性后循環(huán)腦梗死患者發(fā)病12 h內(nèi)血管內(nèi)治療的療效觀察 ………………………………………………………… 傅新民，傅聰，張洋，等 378

1.2.6 hNMT1蛋白的純化 將表達(dá)菌按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至100 mL培養(yǎng)基中，按照優(yōu)化好的條件待菌液OD 600 nm 值為1.0時(shí)，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體，用3～5 mL緩沖液(30 mmol/L Tris-hcl、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑，pH8.5)重懸菌體，冰水浴超聲破碎，11 000 r/min、4℃離心30 min，取上清液與鎳樹(shù)脂于4℃結(jié)合1 h，收集流出液，并依次用含有10 mmol/L、20 mmol/L和30 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白，最后用含有300 mmol/L咪唑緩沖液洗脫目的蛋白(其余組分：30 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl，pH8.5)。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)純化結(jié)果。用PierceTMBCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific,U.S.A)按照說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白定量。

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中的hNMT1序列(GenBank No：M86707.1)，利用Oligo 6設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，F(xiàn)-BamHⅠ：5′-CGGGATCCATGAACTCTTTGCCAGCAG-3′，R-EcoRⅠ：5′- CGGAATTCTTATTGTAGCACCAGTCCAACCT-3′，劃線部位為酶切位點(diǎn)，引物由擎科生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，與空載體菌相比，在46 ku處有明顯條帶，SDS-PAGE(圖3)與Western blot(圖4)結(jié)果一致，均與預(yù)期蛋白分子質(zhì)量大小相符。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增及純化 以質(zhì)粒pUC57-hNMT1為模板，利用引物F-BamHⅠ/R-EcoRⅠ對(duì)其hNMT1基因進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下：10 μL 5×PrimeSTAR GXL buffer(Mg2+plus)，0.5 μL PrimeSTAR GXL，4 μL dNTP Mix，上、下游引物各1 μL，0.2 μL模板，ddH2O補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增程序如下：98℃變性15 s，63℃退火30 s，68℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并用OMEGA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA回收。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.陽(yáng)性對(duì)照；2～4.目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5.陰性對(duì)照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.重組質(zhì)粒pRSFDuet1-hNMT1；2.重組質(zhì)粒雙酶切

2.2 hNMT1蛋白的表達(dá)鑒定

以pUC57-hNMT1為模板，PCR擴(kuò)增hNMT1基因，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)1 251 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期相符(圖1)。將基因片段與pRSFDuet1載體連接、轉(zhuǎn)化后，菌液PCR鑒定片段大小與預(yù)期相符，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切后，凝膠電泳可見(jiàn)與預(yù)期大小相符的兩條帶(圖2)。將鑒定正確的質(zhì)粒送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，序列與GenBank中hNMT1序列一致。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4.重組質(zhì)粒表達(dá)菌誘導(dǎo)；5.重組質(zhì)粒表達(dá)菌未誘導(dǎo)；6.空載體誘導(dǎo)；7.空載體未誘導(dǎo)

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒表達(dá)菌未誘導(dǎo)；2～3.重組質(zhì)粒表達(dá)菌誘導(dǎo)；4.空載體表達(dá)菌誘導(dǎo)；5.空載體表達(dá)菌未誘導(dǎo)

2.3 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)時(shí)大腸埃希氏菌濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響 選取大腸埃希氏菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的節(jié)點(diǎn)，對(duì)處于不同生長(zhǎng)階段的大腸埃希氏菌進(jìn)行誘導(dǎo)，隨著菌濃度的增加，蛋白表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)OD 600 nm 值達(dá)到1.0時(shí)表達(dá)量最高，隨后降低(圖5)，故選擇在OD 600 nm =1.0時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)時(shí)菌濃度為1.2；2.未誘導(dǎo)；3～7.誘導(dǎo)時(shí)菌濃度分別為0.5、0.6、0.7、0.9和1.0

2.3.2 誘導(dǎo)劑劑量對(duì)蛋白表達(dá)量的影響 在確定誘導(dǎo)劑濃度過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在IPTG濃度較小時(shí)，隨IPTG濃度增加蛋白表達(dá)量增多，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量最高，隨后表達(dá)量不再隨誘導(dǎo)劑濃度的增加發(fā)生明顯變化(圖6)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7.IPTG終濃度分別為1.0、0.9、0.7、0.5、0.4、0.2和0.1 mmol/L；8.重組質(zhì)粒表達(dá)菌未誘導(dǎo)

2.3.3 不同表達(dá)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響 在已確定的菌濃度及誘導(dǎo)劑濃度條件下，16℃、25℃和37℃時(shí)蛋白均可表達(dá)(圖7)，超聲破碎后的上清及沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)隨表達(dá)溫度的降低，可溶性蛋白增加(圖8)，因此選擇在16℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.重組質(zhì)粒表達(dá)菌未誘導(dǎo)；2～4.誘導(dǎo)表達(dá)溫度分別為16℃、25℃、37℃

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.分別為16℃表達(dá)全菌、上清和沉淀；

2.4 目的蛋白純化及鑒定

蛋白經(jīng)鎳柱純化后，SDS-PAGE結(jié)果可看出純化后的蛋白大小與表達(dá)鑒定結(jié)果一致(圖9)。將純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)在46 ku處有特異性條帶(圖10)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.純化后蛋白M.Protein molecular weight Marker; 1-2.Purified hNMT1

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后蛋白M.Protein molecular weight Marker; 1.Purified hNMT1

2.5 hNMT1活性檢測(cè)

在hNMT1較低濃度范圍內(nèi)，隨hNMT1濃度增加，470 nm處熒光強(qiáng)度略有增加，但與對(duì)照相比并無(wú)明顯差異，當(dāng)hNMT1濃度為20 nmol/L時(shí)，在470 nm處可見(jiàn)有明顯的吸收峰，與對(duì)照組相比差異顯著，當(dāng)hNMT1濃度繼續(xù)增加，吸收峰值不再升高(圖11)。結(jié)果表明，本研究獲得了具有活性的N-豆蔻?；D(zhuǎn)移酶。

圖11 hNMT1活性檢測(cè)

3 討論

NMT的N端主要為豆蔻酰CoA的結(jié)合區(qū)域，C端為抑制劑的結(jié)合區(qū)域。NMT能夠特異性識(shí)別并結(jié)合豆蔻酰CoA形成NMT-豆蔻酰CoA綴合物。二者結(jié)合后共同構(gòu)成了一個(gè)功能性肽類(lèi)底物的結(jié)合位點(diǎn)，可識(shí)別特異性肽類(lèi)(蛋白)底物形成NMT-豆蔻酰CoA-肽類(lèi)底物三元復(fù)合物，發(fā)生直接親核加成-消除反應(yīng)，由酶-底物復(fù)合物轉(zhuǎn)化成酶-產(chǎn)物復(fù)合物，一部分豆蔻酸被催化轉(zhuǎn)移至底物N端的甘氨酸上，釋放游離的CoA，隨后釋放N-肉豆蔻?；a(chǎn)物[11-12]。

在低等真核生物中，一個(gè)基因即可編碼NMT，而在高等真核生物中，NMT1和NMT2兩個(gè)基因編碼NMT[13-14]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的NMT兩種同工酶，序列相似性約為77%[15]，但在豆蔻酰化生物活性中起著不同作用。Suwanmanee S等研究表明，NMT1可能是一種宿主因子，通過(guò)參與病毒生命周期的膜相互作用，促進(jìn)登革熱病毒(Dengue virus,DENV)復(fù)制，特別是吸附、病毒組裝和釋放[16]。有研究證實(shí)，體內(nèi)敲除NMT1會(huì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，NMT1基因敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎中的缺陷型骨髓生成。Wen Z等在研究中發(fā)現(xiàn)，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者可通過(guò)自調(diào)節(jié)NMT1的表達(dá)來(lái)抑制滑膜炎，進(jìn)而表明NMT1對(duì)組織有保護(hù)作用[17]。

多種病毒蛋白都可發(fā)生豆蔻酰化，例如小RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒及呼腸孤病毒等，其中有些蛋白的豆蔻?；瘜?duì)產(chǎn)生有感染性的病毒顆?；虿《緩?fù)制組裝是必不可少的，例如HIV-1的Nef蛋白。Nef蛋白的肉豆蔻?；饔脤?duì)其活性至關(guān)重要[18-19]，而Nef蛋白缺失N端的肉豆蔻?；稽c(diǎn)會(huì)阻斷其與CD4+T細(xì)胞質(zhì)尾部的相互作用[20-21]。Seaton K E等研究表明，NMT1與NMT2這兩種同工酶都可使Nef蛋白豆蔻酰化[22]；Ohta H等[23]通過(guò)免疫共沉淀和質(zhì)譜探究發(fā)現(xiàn)，NMT1使HIV-1蛋白發(fā)生豆蔻?；⒋龠M(jìn)HIV-1復(fù)制。

因大腸埃希氏菌轉(zhuǎn)化率高，加工生產(chǎn)蛋白快速，并且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于研究在大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)中裝配口蹄疫病毒樣顆粒，因此我們選用同工酶hNMT1作為研究對(duì)象，在大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)具有活性的N-豆蔻?；D(zhuǎn)移酶，為了提高表達(dá)量，本試驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、表達(dá)溫度和誘導(dǎo)前細(xì)菌濃度進(jìn)行了摸索，利用最適表達(dá)條件得到表達(dá)量較高的可溶性蛋白。本試驗(yàn)采用化學(xué)熒光反應(yīng)對(duì)hNMT1進(jìn)行活性檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，靈敏性好；hNMT1在濃度為20 nmol/L時(shí)，吸收峰值至最高，隨后不再增加；為節(jié)約試驗(yàn)材料，我們選擇濃度為20 nmoL/L的hNMT1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。本研究所制備的hNMT1可用于探究在原核表達(dá)系統(tǒng)中，hNMT1催化的豆蔻?；瘜?duì)小RNA病毒衣殼組裝的影響。