馬忠臣，胡瑞瑞，李芮芮，王 震，努爾賽力克·努素甫，王 勇*，陳創(chuàng)夫*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，新疆石河子 832000；3.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000；4.伊犁哈薩克自治州新源縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆伊犁州 835800)

布魯氏菌屬(Brucella)的病原菌屬于α-變形菌(Alphaproteobacteria)的α-2子群，其包含動(dòng)物、植物病原體或共生菌體等多種細(xì)菌，這些細(xì)菌與真核宿主之間經(jīng)歷了長(zhǎng)期的共同進(jìn)化，很多生物學(xué)特性已經(jīng)發(fā)生了改變[1]。目前，布魯氏菌屬的成員越來(lái)越多，幾乎可以感染所有的哺乳動(dòng)物，其中包括牛(Brucellaabortus)，羊(B.melitensis)，豬(B.suis)，綿羊(B.ovis)，駱駝、麋鹿、野牛(B.abortus)，犬(B.canis)，嚙齒動(dòng)物(B.neotomae和B.microti)，猴子(B.papionis)和海豹、海豚、鯨魚(yú)等海洋哺乳動(dòng)物(B.pinnipedialis和B.ceti)以及兩棲動(dòng)物(B.inopinata)[2]。布魯氏菌在宿主體內(nèi)進(jìn)化形成了一系列機(jī)制滿足其胞內(nèi)長(zhǎng)期寄生與繁殖，藏匿于布氏小體(BCV)躲避早期宿主免疫殺傷是其胞內(nèi)生存重要的一步，但其詳細(xì)生存機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本文詳細(xì)介紹了布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)過(guò)程和相關(guān)分子機(jī)制，包括從eBCV到rBCV，再到aBCV的整個(gè)過(guò)程中布魯氏菌通過(guò)偽裝逃避、調(diào)節(jié)宿主分泌等滿足其自身生存，這對(duì)布魯氏菌胞內(nèi)生存機(jī)制的研究具有重要意義。

1 布魯氏菌病

布魯氏菌(Brucella)感染會(huì)引起宿主的布魯氏菌病(Brucellosis)，在動(dòng)物中表現(xiàn)為流產(chǎn)、不育和跛行，人類(lèi)可以通過(guò)吸入氣溶膠化的細(xì)菌、攝取、接觸被污染的組織或其衍生物而感染。山羊種(B.melitensis)，豬種布魯氏菌(B.suis)和牛種布魯氏菌(B.abortus)對(duì)人具有高致病性，此外，犬種布魯氏菌(B.canis)和嚙齒動(dòng)物種布魯氏菌(B.neotomae)也會(huì)對(duì)人造成感染[3]。人感染布魯氏菌后會(huì)在急性期出現(xiàn)非特異性的類(lèi)流感癥狀，如不及時(shí)采取抗生素治療，將會(huì)導(dǎo)致慢性感染，并最終引起反復(fù)發(fā)燒、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和心內(nèi)膜炎等全身衰弱性疾病。布魯氏菌感染在動(dòng)物和人細(xì)胞水平上具有相同的病理和生理性特征，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)循環(huán)來(lái)確保其存活、增殖和寄生(包括巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)[4]。流產(chǎn)布魯氏菌(Brucellaabortus)最初在感染動(dòng)物的胎盤(pán)中被發(fā)現(xiàn)，在上皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞感染模型中表現(xiàn)出了強(qiáng)的增殖能力，在研究布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)增殖的特性方面發(fā)揮了重要作用。

2 VirB Ⅳ型分泌系統(tǒng)

VirB Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)的表達(dá)是布魯氏菌毒力發(fā)揮的標(biāo)志，布魯氏菌T4SS是通過(guò)與植物病原農(nóng)桿菌的VirB T4SS同源鑒定而得來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，慢性布魯氏菌病的鼠模型以及牛、山羊和豬布魯氏菌的細(xì)胞模型中布魯氏菌復(fù)制必需T4SS的表達(dá)[5]。大量研究表明，VirB操縱子內(nèi)多種基因的缺失或插入會(huì)抑制布魯氏菌eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV，進(jìn)而抑制布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，也無(wú)法在小鼠中建立布魯氏菌慢性感染模型[6]，表明T4SS在rBCV生成和布魯氏菌胞內(nèi)增殖中具有重要作用。在許多胞內(nèi)寄生菌中，T4SS可以分泌傳遞效應(yīng)蛋白或核蛋白復(fù)合物，從而其發(fā)揮毒力作用，類(lèi)比于那些使細(xì)菌發(fā)揮毒力的蛋白[7]?？茖W(xué)家推測(cè)布魯氏菌的VirB T4SS同樣可以將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞中，跨過(guò)eBCV膜調(diào)節(jié)特定的細(xì)胞功能并介導(dǎo)rBCV的生成。后來(lái)，一系列分泌到宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的布魯氏菌T4SS依賴(lài)性效應(yīng)蛋白的發(fā)現(xiàn)證明了這一假設(shè)[8]，為了解布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的潛在分子機(jī)制開(kāi)辟了蹊徑。

3 布魯氏菌胞內(nèi)循環(huán)過(guò)程

布魯氏菌一旦入侵吞噬或非吞噬細(xì)胞，就會(huì)藏匿于膜結(jié)合隔室內(nèi)，該隔室被稱(chēng)為布魯氏菌小體，簡(jiǎn)稱(chēng)布氏小體(Brucella-containing vacuole,BCV)(圖1)，布氏小體是基于原始吞噬體的概念，指細(xì)菌特異的膜結(jié)合小泡。早期通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，起初的BCV通常會(huì)沿內(nèi)吞途徑行進(jìn)，依次獲取早期和后期的內(nèi)體膜標(biāo)記物，后被酸化，pH達(dá)到4.5[9]，這類(lèi)似于完整的吞噬體成熟過(guò)程?；诓际闲◇w在感染細(xì)胞周期(感染后0至8 h)中具有內(nèi)體性質(zhì)，故將其稱(chēng)為內(nèi)體BCV(eBCV)(圖1)[10]。

eBCV與內(nèi)吞區(qū)室相互作用后，小泡逐漸喪失內(nèi)體標(biāo)記物(感染后8至12 h)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)結(jié)構(gòu)持續(xù)相互作用，并最終獲得與ER膜相關(guān)的標(biāo)記物，如鈣網(wǎng)蛋白、鈣結(jié)合蛋白和Sec61β蛋白[11]，這表明該過(guò)程伴隨著eBCV膜的反轉(zhuǎn)和ER衍生膜的積聚。另外，這些含菌小泡還擁有了ER的結(jié)構(gòu)和功能特征[11]，這進(jìn)一步表明eBCV已轉(zhuǎn)化為ER衍生的細(xì)胞器。這些結(jié)構(gòu)和功能的改變提供了促進(jìn)布魯氏菌生長(zhǎng)和復(fù)制的胞內(nèi)環(huán)境，有利于布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。這些含菌小泡被稱(chēng)為復(fù)制性BCV(rBCV)(圖1)[10]。

圖1 布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的循環(huán)模型[2]

觀察rBCV的原始超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這些小泡是單個(gè)存在的，在巨噬細(xì)胞或HeLa細(xì)胞中很少與ER相連[11]，而有研究則在滋養(yǎng)層細(xì)胞ER腔內(nèi)觀察到該結(jié)構(gòu)，故rBCV在宿主細(xì)胞中的確切定位尚不清晰。近年，Sedzicki J等[12]利用電子成像技術(shù)重建rBCV的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)rBCV與ER相連，并且可能也與ER和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡相互作用，表明了rBCV與宿主分泌途徑的緊密相互作用。布魯氏菌的增殖與其rBCV階段(感染后12 h至48 h)緊密相關(guān)，該階段會(huì)引起宿主細(xì)胞ER迅速重組形成rBCV網(wǎng)[11]。在布魯氏菌大量繁殖后，預(yù)示著布魯氏菌胞內(nèi)循環(huán)的另一個(gè)階段開(kāi)始，新月?tīng)钅そY(jié)構(gòu)逐漸包圍吞噬rBCV，形成類(lèi)似自噬體的有膜空泡，這些空泡具有后期溶酶體的特征[10]。這些重組的rBCV，稱(chēng)為自噬BCV(aBCV)(圖1)，其在感染后48至72 h形成，引發(fā)布魯氏菌從感染細(xì)胞中釋放并侵染新的細(xì)胞，aBCV的形成加速了布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的過(guò)程[10]。

布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)由eBCV到rBCV再到aBCV三個(gè)階段的連續(xù)循環(huán)具有功能和空間結(jié)構(gòu)的多樣性，它們是布魯氏菌持續(xù)感染的必要條件。20多年來(lái)，人們對(duì)布魯氏菌在這些階段中潛在的分子機(jī)制做了大量的的研究，試圖闡明其如何利用相應(yīng)的細(xì)胞途徑來(lái)完成其細(xì)胞內(nèi)循環(huán)。

3.1 eBCV階段

被吞噬細(xì)胞吞噬或侵入非吞噬細(xì)胞后，布魯氏菌最初位于吞噬體中，并迅速獲取早期內(nèi)體標(biāo)志物，包括控制早期內(nèi)體成熟的小GTPase Rab5和早期內(nèi)體抗原EEA-1[11]。由于這些標(biāo)記物的獲取途徑與典型的吞噬體相似，因此早期BCV可能會(huì)經(jīng)歷一段成熟的過(guò)程。與此相一致，BCV隨后獲得晚期內(nèi)體標(biāo)志物，例如溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1和LAMP2、CD63、以及控制晚期內(nèi)吞體與溶酶體融合的小GTPase Rab7[9]，這也表明了布魯氏菌感染后1 h內(nèi)BCV的成熟過(guò)程。重要的是，BCV也會(huì)被迅速酸化，pH達(dá)到4.5～5.0[9]，這進(jìn)一步說(shuō)明了BCV成為吞噬溶酶體的成熟過(guò)程。 然而，通過(guò)免疫染色法檢測(cè)布魯氏菌感染早期溶酶體內(nèi)容物向BCV轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)證明BCV與溶酶體的融合卻未能觀察到組織蛋白酶D(cathepsin D)的集聚[9]。因此，研究者提出了這樣的猜想，盡管BCV已經(jīng)成熟，但仍會(huì)避免與末端溶酶體融合，從而防止布魯氏菌被免疫殺傷確保其胞內(nèi)存活。

幾項(xiàng)針對(duì)eBCV內(nèi)布魯氏菌生存能力的研究表明，由于eBCV內(nèi)存在殺菌環(huán)境，大部分(原代骨髓巨噬細(xì)胞中高達(dá)90%)進(jìn)入宿主細(xì)胞的布魯氏菌被殺死[9]。Starr T等[9]使用活細(xì)胞成像技術(shù)熒光標(biāo)記溶酶體檢測(cè)可溶性溶酶體抗原，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞中的eBCV雖與末端溶酶體融合，但程度有限，表明eBCV逐漸成熟為類(lèi)吞噬溶酶體的膜泡結(jié)構(gòu)。體外細(xì)胞模型中觀察到eBCV成熟同樣抑制了布魯氏菌的生存增殖能力，這有悖于人們對(duì)布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)存活的常規(guī)認(rèn)識(shí)。因此有人猜測(cè)，eBCV經(jīng)歷完整的溶酶體成熟過(guò)程不利于布魯氏菌的胞內(nèi)存活，但也不代表其完全被殺死，其中一小部分未沿著內(nèi)吞途徑成熟的BCV產(chǎn)生rBCV來(lái)完成菌體增殖和細(xì)胞內(nèi)存活。但是，相關(guān)研究表現(xiàn)結(jié)果與這種猜想并不太一致。首先，含有LAMP1 的eBCV與ER相互作用后獲得ER標(biāo)記物，暗示eBCV經(jīng)歷了向rBCV的轉(zhuǎn)化[11]。其次，eBCV酸化至末端溶酶體的pH值是rBCV的生成和布魯氏菌復(fù)制所必需，因?yàn)橐种迫苊阁w酸化會(huì)阻止eBCV向rBCV的轉(zhuǎn)化和布魯氏菌的增殖[9,13]。第三，抑制Rab7的活性可抑制eBCV與溶酶體的融合，阻礙eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV和布魯氏菌菌增殖的過(guò)程[9]，表明布魯氏菌后期需要功能性的內(nèi)吞和溶酶體融合途徑完成其細(xì)胞內(nèi)循環(huán)。第四，eBCV酸化對(duì)于誘導(dǎo)VirB T4SS表達(dá)至關(guān)重要[9]，eBCV成熟后T4SS迅速表達(dá)分泌，并在感染后4 h達(dá)到高峰[14]。綜上所述，eBCV階段是布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的必要步驟，該階段提供了誘導(dǎo)VirB T4SS表達(dá)和最終eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV所必需的條件，如溶酶體pH。

eBCV除了誘導(dǎo)布魯氏菌T4SS的表達(dá)外，還可以促進(jìn)復(fù)制性rBCV生成之前的布魯氏菌的生長(zhǎng)。 Deghelt T M等[15]建立的熒光顯微鏡方法觀測(cè)到eBCV內(nèi)含有LAMP1的布魯氏菌在感染后8 h(即eBCV到rBCV的轉(zhuǎn)化階段)染色體開(kāi)始復(fù)制，而G1阻滯期在菌體感染后6 h已經(jīng)開(kāi)始。是由eBCV的內(nèi)體條件還是由轉(zhuǎn)化為rBCV期間的菌小泡內(nèi)變化促發(fā)了這種宿主細(xì)胞的周期性變化仍值得研究。以上這些發(fā)現(xiàn)表明布魯氏菌對(duì)BCV內(nèi)環(huán)境異常敏感，并且在eBCV階段就已經(jīng)開(kāi)始生長(zhǎng)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了內(nèi)體階段在布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)中的重要性。

3.2 rBCV階段

3.2.1 ER在rBCV生成過(guò)程中的作用 rBCV的生成是布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的重要標(biāo)志，其將原始的內(nèi)體含菌小泡轉(zhuǎn)化為可促進(jìn)菌體增殖的ER來(lái)源的特殊細(xì)胞器。最初通過(guò)觀察rBCV的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，rBCV與ER融合并附有核糖體，后通過(guò)免疫熒光顯微鏡觀察、葡萄糖-6磷酸酶活性的膜內(nèi)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了其膜上含有ER相關(guān)蛋白。葡萄糖-6磷酸酶是一種ER腔內(nèi)酶，對(duì)ER空泡毒素溶血素(ER-vacuolating toxin aerolysin)敏感[11]。BCV與晚期內(nèi)吞和溶酶體區(qū)室相互作用可能發(fā)生于ER出口位點(diǎn)(ERES)，ERES是ER子室，通過(guò)形成COPⅡ外載物囊泡(COPⅡ-coated cargo vesicles)而引發(fā)分泌轉(zhuǎn)運(yùn)，其功能的發(fā)揮對(duì)rBCV生成很重要[16]。在eBCV到rBCV轉(zhuǎn)化過(guò)程中，依賴(lài)于T4SS與ERES COPⅡ外載物囊泡的持續(xù)相互作用(圖2)，并且抑制調(diào)控COPⅡ外套組裝以及ERES的形成和功能的小GTPase Sar1的表達(dá)，從而抑制了rBCV的生成和布魯氏菌增殖[16]。與這些結(jié)果相一致，另有研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌感染后通過(guò)未知機(jī)制上調(diào)了Sar1和COPⅡ組分Sec23和Sec24D的表達(dá)量[17]，表明布魯氏菌通過(guò)上調(diào)Sar1和COPⅡ介導(dǎo)的分泌囊泡的運(yùn)動(dòng)促進(jìn)rBCV生成。因此，布魯氏菌可能通過(guò)增強(qiáng)分泌小泡的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)ERES功能，從而促進(jìn)rBCV的生成，而分泌小泡的產(chǎn)生可能與eBCV融合，將其轉(zhuǎn)化為具有ER融合特性的小泡(圖2)，布魯氏菌可能因此繞開(kāi)典型的內(nèi)體-高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)程而直接進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

3.2.2 UPR在布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)中的作用 另一種ER介導(dǎo)的與布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)密切相關(guān)的功能是未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded-protein response,UPR)。當(dāng)ER內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白積聚觸發(fā)ER應(yīng)激時(shí)，ER上的UPR受體激活I(lǐng)RE1α、PERK、ATF6信號(hào)通路，并導(dǎo)致ER功能重組，增強(qiáng)ER的折疊能力，從而抑制蛋白質(zhì)合成以及引發(fā)自噬，以緩解ER應(yīng)激[18]。盡管對(duì)UPR過(guò)程還存在一定的分歧，但共識(shí)是布魯氏菌感染至少通過(guò)IRE1α途徑在巨噬細(xì)胞或HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)UPR[17,19]。此外，研究表明，IRE1α是布魯氏菌復(fù)制所必需的，?；撬崛パ跄懰釋?duì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的治療作用會(huì)抑制山羊種布魯氏菌的復(fù)制[19]，這說(shuō)明UPR有利于布魯氏菌的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)。但是，這種應(yīng)激反應(yīng)是否以及如何促進(jìn)rBCV生成和布魯氏菌的復(fù)制尚不清楚。Taguchi Y等[170]通過(guò)展示ERES定位蛋白Yip1A激活I(lǐng)RE1α的過(guò)程，揭示了UPR誘導(dǎo)、ERES和rBCV生成之間的聯(lián)系，Yip1A蛋白以依賴(lài)自噬相關(guān)蛋白Atg9和WIPI1的方式調(diào)控rBCV生成所必需的大型囊泡的形成。因此，這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明布魯氏菌可能通過(guò)IRE1α途徑的激活而主動(dòng)引起UPR從而促進(jìn)激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致自噬特性的囊泡在ERES的形成，最終引起rBCV的生成(圖2)。

圖2 rBCV的VirB T4SS依賴(lài)性生物發(fā)生模型[2]

3.2.3 自噬是否參與了rBCV的生物發(fā)生 自噬(autophagy)是一種基于膜的過(guò)程，通常將細(xì)胞內(nèi)容物(胞漿內(nèi)容物、受損的細(xì)胞器、微生物等)捕獲到稱(chēng)為自噬小體的雙膜囊泡中，并將其降解至溶酶體。雖然它具有先天性的免疫抗菌作用，但對(duì)某些病原體來(lái)說(shuō)該過(guò)程可能是有益的。基于IRE1α和Yip1A在rBCV生成和布魯氏菌增殖中的作用，在ERES處形成的自噬小體可能提供ER衍生的膜，從而有助于eBCV到rBCV的轉(zhuǎn)化。然而，是否正常的自噬級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與rBCV生物發(fā)生仍存在爭(zhēng)議。雖然最初提出自噬過(guò)程參與了HeLa細(xì)胞中rBCV的生成，BCVs中觀察到多膜結(jié)構(gòu)和溶酶體復(fù)合物單丹酰尸胺(monodansylcadaverine)的聚集[20]，但自噬結(jié)構(gòu)在巨噬細(xì)胞eBCVs中并未見(jiàn)到[11]。另外，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3也不在eBCV上積聚，這有悖于典型的自噬過(guò)程。此外，通過(guò)小干擾RNA(siRNA)抑制自噬因子(ULK1、beclin1、Atg5、Atg7、ATG16L和LC3B)參與的自噬體成核和延伸步驟，不能阻止rBCV的生成和布魯氏菌的復(fù)制[9]。因此，沒(méi)有實(shí)質(zhì)性證據(jù)證明自噬級(jí)聯(lián)反應(yīng)在rBCV生成中的作用。不過(guò)，自噬體成核蛋白WIPI1和自噬蛋白Atg9在rBCV生成中的作用已被證實(shí)[17]，暗示在rBCV生成過(guò)程中應(yīng)用了特定的自噬相關(guān)機(jī)制，這表明ERES和Atg9介導(dǎo)的膜傳遞過(guò)程和自噬體的形成過(guò)程介導(dǎo)了rBCV的生成。如要闡明自噬相關(guān)過(guò)程如何真正的促進(jìn)rBCV生成，還需要更深一步的研究。

3.2.4 宿主細(xì)胞分泌途徑在rBCV生成中的作用 由于rBCV具有ER性質(zhì)，因此布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)中宿主細(xì)胞分泌途徑必然起著至關(guān)重要的作用。除ER外，ER-高爾基體中間區(qū)、高爾基體和反式高爾基體網(wǎng)(trans-Golgi network)是否對(duì)布魯氏菌有重要作用，還是一個(gè)值得探究的問(wèn)題。研究表明，其他胞內(nèi)病原體可以充分利用這些細(xì)胞器室的功能，例如嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)通過(guò)阻逆依賴(lài)于Arf1和Rab1的分泌途徑來(lái)獲取ER衍生膜[21]，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)重定向高爾基體脂質(zhì)分泌途徑以獲取鞘脂(sphingolipids)[22]。通過(guò)藥物抑制宿主細(xì)胞分泌途徑發(fā)現(xiàn)，小GTP酶的顯性等位基因失活或siRNA沉默抑制ER-高爾基體分泌途徑，進(jìn)而抑制rBCV的生成和布魯氏菌增殖[23]。另外，使用布雷菲德菌素A(brefeldin A)或siRNA抑制Arf1分泌途徑，rBCV的生成減弱至與Sar1基因缺失時(shí)相同的水平。ER-高爾基體之間轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡所分泌的小GTPases Rab1a和Rab2的缺失阻礙了巨噬細(xì)胞中流產(chǎn)布魯氏菌的復(fù)制[23]，這均表明在eBCV轉(zhuǎn)化為rBCV的過(guò)程中，這些細(xì)胞器室之間復(fù)雜的囊泡分泌可能促進(jìn)布魯氏菌的增殖。同樣，與布魯氏菌利用宿主細(xì)胞分泌途徑相一致，宿主細(xì)胞感染布魯氏菌后分泌轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以依賴(lài)T4SS的方式發(fā)生改變[24]，這表明布魯氏菌通過(guò)分泌效應(yīng)子來(lái)主動(dòng)調(diào)節(jié)宿主分泌功能以促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)循環(huán)。

3.2.5 rBCV生成過(guò)程中的布魯氏菌效應(yīng)蛋白 近年發(fā)現(xiàn)了15種VirB T4SS效應(yīng)子(表1)，其中一些可以從分子水平開(kāi)始解讀rBCV生成機(jī)制和布魯氏菌增殖過(guò)程。VceC處于VirB T4SS核心位置，結(jié)合ER伴侶蛋白Grp78/BiP并誘導(dǎo)UPR，引發(fā)炎癥反應(yīng)[25]，但尚不清楚它是否在rBCV生成中發(fā)揮作用。TcpB/BtpA/ Btp1，一種含有TIR(Toll/interleukin-1 (IL-1) receptor)域的效應(yīng)子，可下調(diào)促炎癥反應(yīng)因子的表達(dá)[26-27]，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，一旦布魯氏菌形成rBCVs，也會(huì)誘導(dǎo)UPR并促進(jìn)菌體增殖[19]，但它可能不參與rBCV的生成過(guò)程。與之不同的是，SepA可能參與rBCV的生成過(guò)程，因?yàn)椴剪斒暇epA缺失突變體仍保留在eBCV中，無(wú)法生成rBCV[8]，但其作用方式仍然未知。

表1 布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白[2,28]

T4SS效應(yīng)蛋白BspA、BspB和BspF會(huì)抑制宿主蛋白分泌并促進(jìn)布魯氏菌增殖[23,24]，這與布魯氏菌特異性靶向宿主細(xì)胞多種分泌途徑的假說(shuō)相一致，可能是rBCV生成所必需的。雖然尚不清楚BspA和BspF的作用方式，但BspB的作用方式已被闡明[5]。BspB是rBCV生成和巨噬細(xì)胞中布魯氏菌增殖所必需的[23]。該效應(yīng)蛋白被布魯氏菌分泌到宿主細(xì)胞中并轉(zhuǎn)移至高爾基體，在這里它與保守寡聚高爾基復(fù)合體(conserved oligomeric Golgi,COG)[23]相互作用，COG是一種CATCHR家族多亞基復(fù)合體，作為高爾基體上分泌性Rab GTPases、高爾基系繩(Golgi tethers)和SNARE膜的相互作用中心，可沿著分泌途徑調(diào)節(jié)高爾基體和反向囊泡分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)[34]。COG的功能對(duì)于rBCV的生成和布魯氏菌復(fù)制很重要[23]，這暗示了布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)與高爾基體功能具有相關(guān)性。BspB-COG的相互作用改變了COG功能，并導(dǎo)致依賴(lài)于COG的高爾基體反向囊泡重定向至BCV，從而使BCV獲得了高爾基體來(lái)源的膜[23]，表明布魯氏菌在rBCV生成過(guò)程中可能從分泌物中吸收ER來(lái)源的膜(圖2)，但這一機(jī)制還有待確定。有趣的是，通過(guò)衰減Rab2的表達(dá)抑制高爾基體到ER的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程可減弱ΔbspB缺失突變體引起的布魯氏菌復(fù)制缺陷[23]，這表明BspB可能會(huì)影響宿主細(xì)胞逆向的分泌性轉(zhuǎn)運(yùn)，從而將COG依賴(lài)性的高爾基體囊泡重定向到BCV。更有趣的是，T4SS效應(yīng)子RicA可控制rBCV的生成過(guò)程，其可結(jié)合Rab2的GDP結(jié)合域[30]，但其作用方式尚不清楚，因?yàn)樗鼪](méi)有表現(xiàn)出任何GEF(鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子)活性，這表明布魯氏菌分泌的幾種效應(yīng)蛋白可以協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)Rab2依賴(lài)性的囊泡分泌轉(zhuǎn)運(yùn)并促進(jìn)rBCV的生成。

總之，通過(guò)研究靶向宿主分泌途徑的VirB T4SS效應(yīng)蛋白揭示了布魯氏菌與宿主細(xì)胞內(nèi)區(qū)室相互作用的一些機(jī)制，研究其效應(yīng)蛋白的特性及破壞宿主細(xì)胞分泌途徑的機(jī)制是全面了解布魯氏菌的關(guān)鍵。

3.3 aBCV階段

已知在ER結(jié)合的rBCV中增殖是布魯氏菌致病過(guò)程的關(guān)鍵步驟，但數(shù)十年來(lái)，布魯氏菌如何在增殖階段后完成其細(xì)胞內(nèi)循環(huán)仍是未知的。許多病原體致宿主細(xì)胞死亡后被釋放，而布魯氏菌卻會(huì)維持其細(xì)胞內(nèi)生存環(huán)境，阻止宿主細(xì)胞的死亡。Starr等[10]觀察到在rBCVs增殖階段，即感染48 h之后，布魯氏菌藏匿位置由ER來(lái)源的細(xì)胞器轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂型砥趦?nèi)體和溶酶體特性的大囊泡，該過(guò)程伴隨著LAMP1的積累和酸化。觀察其超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，這些囊泡源自新月形膜結(jié)構(gòu)融合吞噬體形成的rBCV，被多個(gè)膜所包圍，缺乏典型的自噬標(biāo)記物L(fēng)C3[10]。這些囊泡被稱(chēng)為aBCV，其形成需要宿主細(xì)胞自噬成核功能，而不需要延伸復(fù)合物，因?yàn)閎eclin1、ULK1和Atg14L的缺失或沉默抑制了aBCV的形成，而自噬蛋白Atg5、Atg7、Atg4或Atg16L的缺失或沉默卻沒(méi)有[10]。因此，aBCV的形成應(yīng)該需要自噬相關(guān)分子機(jī)制，這可能代表了另一種自噬過(guò)程或表明布魯氏菌正在積極利用自噬途徑的離散功能來(lái)產(chǎn)生aBCV。

重要的是，aBCV的形成與布魯氏菌的釋放緊密相關(guān)，因?yàn)閍BCV形成階段會(huì)產(chǎn)生新細(xì)胞的感染，而抑制aBCV的形成時(shí)則感染減少[10]。布魯氏菌是以自由狀態(tài)還是包含在結(jié)合膜的小泡中釋放仍然有待確定，但最初感染的細(xì)胞釋放布魯氏菌表明其釋放是一種非溶血性的胞外過(guò)程(圖1)?；赼BCV的自噬特性，有人提出一個(gè)科學(xué)假說(shuō)，認(rèn)為布魯氏菌的aBCV依賴(lài)性釋放過(guò)程是其利用宿主細(xì)胞自噬途徑的分泌功能將aBCV中的布魯氏菌傳遞到細(xì)胞外環(huán)境。

在細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的最終階段，布魯氏菌可能通過(guò)VirB T4SS來(lái)調(diào)控aBCV的形成。rBCV的形成依賴(lài)于布魯氏菌T4SS的表達(dá)，要證明這一說(shuō)法具有一定的難度，因?yàn)闊o(wú)法用反向遺傳學(xué)和構(gòu)建VirB T4SS缺失突變體等常用方法的形式進(jìn)行驗(yàn)證。Smith EP[35]通過(guò)控制啟動(dòng)子表達(dá)使 VirB11 ATPase短暫地在細(xì)胞內(nèi)分泌，從而使T4SS增能，進(jìn)而使布魯氏菌生成rBCV和增殖，然后在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)布魯氏菌T4SS進(jìn)行滅活，結(jié)果顯示，在aBCV形成和布魯氏菌釋放過(guò)程中需要VirB系統(tǒng)功能的表達(dá)，這表明T4SS效應(yīng)子可能調(diào)控布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)過(guò)程的最后階段。未來(lái)對(duì)于T4SS具體的特性研究可能會(huì)闡明aBCV形成和布魯氏菌釋放的分子機(jī)制。

4 展望

布魯氏菌與真核宿主緊密相關(guān)，其與宿主哺乳動(dòng)物的長(zhǎng)期共進(jìn)化已將其復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)過(guò)程表現(xiàn)為對(duì)內(nèi)吞、分泌和自噬途徑中細(xì)胞器室的連續(xù)利用。布魯氏菌使用一系列T4SS效應(yīng)子和其他毒力因子來(lái)調(diào)節(jié)這些區(qū)室的功能，將其原始吞噬體裝配成ER相關(guān)的細(xì)胞器，隨后依賴(lài)宿主細(xì)胞自噬功能以完成自身的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)，從而確保其胞內(nèi)存活、增殖和釋放。盡管已經(jīng)確定了十幾種布魯氏菌T4SS效應(yīng)子，但它們的作用方式以及對(duì)布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的作用還不甚明了。對(duì)于這些分泌蛋白功能特性的后續(xù)研究將會(huì)解決布魯氏菌在胞內(nèi)生存、致病過(guò)程以及調(diào)控宿主細(xì)胞功能等多方面問(wèn)題。