寇娜 郝鈺 趙瑞珍 趙子珺 唐啟盛

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中等原因所致的認(rèn)知功能障礙綜合征，是繼阿爾茨海默病后第二大癡呆類型，約占所有癡呆類型的20%[1-2]。多項(xiàng)臨床研究表明VD患者可能合并甲狀腺激素水平的變化，且低甲狀腺激素可進(jìn)一步加速VD患者認(rèn)知功能障礙[3-6]。VD患者多表現(xiàn)為思維遲滯、不寐、乏力、腰膝酸軟、胸脅脹滿、面色晦暗、舌淡或暗、苔白、脈沉細(xì)或沉弦，中醫(yī)辨證多屬腎虛肝郁證型。先前的研究表明頤腦解郁方能夠改善腎虛肝郁型VD大鼠的認(rèn)知功能，但是否與調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平相關(guān)少有報(bào)道[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察VD大鼠下丘腦—垂體—甲狀腺軸(hypothalamus pituitary thyroid axis，HPT)相關(guān)因子的變化，探討頤腦解郁方是否通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平來(lái)改善VD大鼠的認(rèn)知功能障礙。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(6周齡，體質(zhì)量200～220 g)由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供動(dòng)物許可證：SCXK(京)2016-0006。大鼠適應(yīng)性預(yù)養(yǎng)1周，自由攝食和飲水，動(dòng)物房室溫22～25℃，相對(duì)濕度55%～65%，光照周期晝夜各12小時(shí)。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

大鼠VD模型參考Longa等[8]報(bào)道的線栓造模方法，手術(shù)過(guò)程中室內(nèi)溫度保持27～30℃，并采用數(shù)字量表評(píng)價(jià)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)神經(jīng)功能，選擇術(shù)后24小時(shí)評(píng)分為7～12分中度損傷大鼠，不予干預(yù)4周后自然癡呆經(jīng)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)篩選后選出[9]。

實(shí)驗(yàn)將30只VD大鼠隨機(jī)分為VD模型組、VD中藥組，每組15只。15只假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎外，其余步驟完全與VD造模方法相同。正常組選取15只正常大鼠不予任何干預(yù)。其中VD中藥組大鼠灌胃中藥頤腦解郁方(大鼠灌胃劑量根據(jù)成人用量的7倍進(jìn)行計(jì)算，配成419 mg/kg混懸液，每日劑量為10 mL/kg，灌胃量根據(jù)每周大鼠的體質(zhì)量變化調(diào)整)。正常組、假手術(shù)組、VD模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，灌胃0.9%生理鹽水，每日劑量10 mL/kg，連續(xù)4周。動(dòng)物保健及使用經(jīng)過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)協(xié)議批準(zhǔn)。

1.3 主要儀器和試劑

二甲苯購(gòu)于天津市進(jìn)豐化工有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)于北京化工廠；促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)放免試劑盒、游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)放免試劑盒、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)放免試劑盒由北京華英公司提供；戊巴比妥購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。Morris水迷宮設(shè)備由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；DTT-2跳臺(tái)儀由中國(guó)科學(xué)研究院提供；生物組織包埋機(jī)(型號(hào)YD-6L)購(gòu)于金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司；石蠟切片機(jī)(型號(hào)FINESSE 325)購(gòu)于SHANDON公司；超純水儀(型號(hào)D7411)購(gòu)于美國(guó)Barnstead公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)BN-2)購(gòu)于日本Olympus公司。圖片處理運(yùn)用NIS-Elements B R Version2.34及AMT Image Capture Engine圖片成像軟件完成。

1.4 主要藥品

頤腦解郁方(刺五加20 g、梔子10 g、五味子10 g、郁金10 g)購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房，配方顆粒由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。灌胃劑量按照成人常用量(20 mg·60 kg-1·d-1)的7倍計(jì)算大鼠用量，濃度為0.62 g/mL，4℃冰箱冷藏備用，灌胃前加熱。

1.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

各組大鼠于灌胃1周與4周末次30分鐘后進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。跳臺(tái)裝置為15 cm×30 cm×30 cm的被動(dòng)回避反應(yīng)箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)先將大鼠放入箱中訓(xùn)練3分鐘，然后通36 V交流電，記錄每只大鼠第一次跳下安全區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和錯(cuò)誤次數(shù)。

1.6 Morris水迷宮

各組大鼠于灌胃1周與4周末次行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄逃避潛伏期時(shí)間及穿越平臺(tái)次數(shù)。(1)定位航行試驗(yàn)：將大鼠于第1象限入點(diǎn)處面向池壁放入水中，記錄大鼠在120秒內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期時(shí)間，之后分別從其他3個(gè)象限入水點(diǎn)將大鼠放入水中，連續(xù)訓(xùn)練5天。(2)空間探索試驗(yàn)：于第6天撤去平臺(tái)，在第1象限入點(diǎn)處將大鼠放入水中，記錄大鼠在60秒內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，并計(jì)算其穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.7 下丘腦病理學(xué)觀察

各組大鼠灌胃1周與4周末次，隨機(jī)選擇6只大鼠在行為學(xué)檢測(cè)后麻醉處死，斷頭取腦組織投入預(yù)先配好的固定液(4%多聚甲醛)使其蛋白質(zhì)變性凝固后，切取下丘腦部位進(jìn)行常規(guī)固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀切片、再脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、常規(guī)脫水，透明，封片，觀察大鼠下丘腦病理學(xué)變化。

1.8 HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4的含量

各組大鼠灌胃4周末次，隨機(jī)選擇8只大鼠在行為學(xué)檢測(cè)后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4℃離心10分鐘取血清，并用全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀按試劑盒說(shuō)明的放射免疫法測(cè)定血清TSH、FT3、FT4含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

與正常組相比，假手術(shù)組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期及錯(cuò)誤次數(shù)均無(wú)明顯差異(P>0.05)，VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時(shí)間顯著下降，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時(shí)間顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，錯(cuò)誤次數(shù)在灌胃1周后統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，灌胃4周后顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

與正常組相比，假手術(shù)組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期與穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)，VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃4周逃避潛伏期時(shí)間明顯增多(P<0.05，P<0.01)；VD模型組大鼠灌胃1周穿越平臺(tái)次數(shù)顯著下降(P<0.01)，VD模型組及VD中藥組大鼠灌胃4周穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯下降(P<0.05)。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠灌胃1周與4周逃避潛伏期時(shí)間減少，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響

表3 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)的影響

2.3 下丘腦病理學(xué)觀察

光鏡顯示，正常組大鼠灌胃1周下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列有序，細(xì)胞核大，淡染，染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，未見(jiàn)變性、壞死等病變，且灌胃4周與1周相比未見(jiàn)差異。與正常組相比，假手術(shù)組大鼠下丘腦病理形態(tài)變化不明顯；VD模型組大鼠灌胃1周下丘腦見(jiàn)大片液化性壞死灶，呈篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，壞死區(qū)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且大鼠灌胃4周較1周后下丘腦細(xì)胞變性、壞死程度更明顯。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠灌胃1周下丘腦細(xì)胞變性程度減輕，但仍見(jiàn)大片液化性壞死灶，呈篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，壞死區(qū)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且大鼠灌胃4周較1周下丘腦細(xì)胞變性減輕明顯(見(jiàn)圖1)。

圖1 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠下丘腦形態(tài)的影響(HE,×400)

2.4 HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4含量測(cè)定

與正常組相比，假手術(shù)組大鼠血清FT3、FT4、TSH含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；VD模型組、VD中藥組大鼠血清FT3、FT4含量顯著下降(P<0.05,P<0.01)，血清TSH含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。與VD模型組相比，VD中藥組大鼠血清FT3、FT4含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，血清TSH含量顯著下降(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 頤腦解郁方對(duì)VD大鼠HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇改良版的線栓法造成大鼠腦血管性病變后4周不予任何干預(yù)，待其自然癡呆的VD模型更好的模擬了現(xiàn)實(shí)生活中人腦血管病變后出現(xiàn)癡呆的病況，避免了一系列復(fù)雜因素的影響[10]。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是研究實(shí)驗(yàn)室嚙齒類動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶的常用方法[11]。本研究數(shù)據(jù)表明腦血管病變后隨著病程的延長(zhǎng)，VD大鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力也逐漸下降，導(dǎo)致認(rèn)知障礙，與臨床VD患者不同階段出現(xiàn)的反應(yīng)遲鈍、思維混亂、記憶模糊、智力障礙等癥狀表現(xiàn)類似[12]。

HPT軸的功能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展和正常功能的維持有重要的作用。研究表明，VD認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能與海馬組織的病理性損傷相關(guān)，而下丘腦是否損傷的報(bào)道研究甚少[13]。本研究通過(guò)HE染色技術(shù)觀察大鼠下丘腦的病理形態(tài)，發(fā)現(xiàn)VD模型組大鼠下丘腦可見(jiàn)大片液化性壞死灶，小膠質(zhì)細(xì)胞增生，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。臨床研究表明，VD患者發(fā)生腦梗死病灶侵及基底節(jié)區(qū)等部位可引起HPT軸功能紊亂，垂體反應(yīng)性不佳致TSH分泌不足時(shí)，甲狀腺激素的合成及外周代謝發(fā)生障礙，血清中FT3、FT4顯著降低，代償性刺激TSH的分泌[14-16]。本課題組通過(guò)放射免疫法檢測(cè)HPT軸相關(guān)激素水平發(fā)現(xiàn)，VD可導(dǎo)致FT3、FT4的含量減少，TSH含量升高，與先前研究一致[17]。

VD屬中醫(yī)學(xué)“呆病”“健忘”等范疇[18]。課題組認(rèn)為此病的病變部位在腦，多肝腎不足，中醫(yī)辨證多屬腎虛肝郁證型。頤腦解郁方由刺五加、郁金、梔子、五味子組成，方中刺五加、郁金二藥為君臣，兩者配伍既益氣補(bǔ)腎，填精益髓，又疏肝利膽，行氣解郁，腎氣足則腦髓漸充，肝氣達(dá)則郁氣自疏。梔子清解腦絡(luò)痰濁瘀毒，五味子澀精滋腎安神，又可防郁金、梔子苦寒清瀉過(guò)度，斂正氣而不斂邪氣，共為佐藥[19]。本課題組先前研究表明，頤腦解郁方可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)含量相關(guān)[20]。本次研究結(jié)果表明，頤腦解郁方可改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減輕下丘腦細(xì)胞變性、壞死程度，并能調(diào)節(jié)HPT軸的TSH、FT3、FT4含量。

綜上所述，頤腦解郁方對(duì)VD認(rèn)知功能有改善作用，機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPT軸相關(guān)激素TSH、FT3、FT4含量有關(guān)。