莫霄云，楊 朔，黃 琛，何貴新

三七為五加科人參屬植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根莖，為廣西地道藥材[1]?！队耖彼幗狻份d “和營(yíng)止血，通脈行瘀，行瘀血而斂新血”[2]。三七具有散瘀止血、消腫定痛的功效。扶芳藤[Euonymus fortunei(Turcz.)Hand.-Mazz]為衛(wèi)矛科常綠藤本灌木，又名衛(wèi)生草、巖青藤、巖青杠等，《本草拾遺》記載：“扶芳藤，無(wú)毒，味苦，小溫，主一切氣，一切血，一切冷，去百病……久服延年”[3]。扶芳藤具有益氣血、補(bǔ)肝腎、舒筋活絡(luò)、止血化瘀等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，三七、扶芳藤具有抗氧化、抗血栓、心臟保護(hù)、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗內(nèi)毒素等多種藥理作用，其對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等均有良好的臨床治療效果[4-5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，探究疾病及藥物的相互作用機(jī)制，與復(fù)雜疾病的治療理念相吻合，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)及中藥作用機(jī)制的闡述方面[6]。本研究以三七-扶芳藤藥對(duì)為研究對(duì)象，建立三七-扶芳藤“成分-靶點(diǎn)-心力衰竭”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度闡釋三七-扶芳藤治療心力衰竭的有效成分及其關(guān)鍵靶點(diǎn)，揭示三七-扶芳藤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和治療心力衰竭的療效機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 檢索數(shù)據(jù)庫(kù) 檢索數(shù)據(jù)庫(kù)包括：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systema pharmacolgy databas and analysis platform，TCMSP)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https：// www.uniprot.org/)，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)(https：// www.genecards.org/)，STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)，Venny2.1在線(xiàn)軟件作圖工具平臺(tái)(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，CytoScape3.7.1軟件，R3.6.0軟件等。

1.2 藥物作用靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索三七、扶芳藤，并結(jié)合文獻(xiàn)收集三七-扶芳藤藥對(duì)內(nèi)各藥物的化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息，使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，將藥物的靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行矯正統(tǒng)一，并使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藥物的靶點(diǎn)信息進(jìn)行補(bǔ)充。

1.3 疾病作用靶點(diǎn)篩選 使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“heart failure”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得疾病作用靶點(diǎn)。

1.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選 在Venny2.1在線(xiàn)軟件作圖工具平臺(tái)上分別錄入三七-扶芳藤與心力衰竭的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析 使用CytoScape3.7.1軟件，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer功能對(duì)中藥復(fù)方的主要活性成分進(jìn)行分析。

1.6 構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖 將上述藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，選取minimum required interaction score>0.4，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)蛋白之間的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序。

1.7 通路富集分析 在R軟件安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運(yùn)行，將藥物-疾病共同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成entrezID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrezID，以P<0.05，Q<0.05進(jìn)行關(guān)鍵靶基因本體(gene ontology，GO)注釋及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖形式輸出。

2 結(jié) 果

2.1 三七-扶芳藤藥對(duì)有效活性成分及靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)定生物利用度(OB)≥30%、類(lèi)藥性(DL)≥0.18，對(duì)2味藥物的有效成分進(jìn)行篩選，結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充納入三七[7]中的人參皂苷rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1，扶芳藤[8]中的衛(wèi)矛醇、兒茶素、木栓酮、沒(méi)食子酸。去重后共得到有效活性成分16個(gè)，分別包括三七12個(gè)、扶芳藤4個(gè)。詳見(jiàn)表1、表2。將活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)，并使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行補(bǔ)充，刪除去重，共篩選出345個(gè)藥物靶點(diǎn)(其中三七187個(gè)，扶芳藤193個(gè))。

表1 三七-扶芳藤藥對(duì)中藥物-成分-靶標(biāo)基本信息

表2 三七-扶芳藤藥對(duì)的有效活性成分信息

2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的獲取 以“heart failure”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，去重后共獲得相關(guān)靶點(diǎn)1 0961個(gè)，取排名居前2 000位作為研究靶點(diǎn)。在Venny2.1在線(xiàn)軟件作圖工具平臺(tái)上輸入345個(gè)藥物靶點(diǎn)、2 000個(gè)疾病靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)148個(gè)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 三七-扶芳藤與心力衰竭靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將三七-扶芳藤藥對(duì)中16個(gè)潛在活性成分與148個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件中，繪制出藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。詳見(jiàn)圖2。圖中紫色代表藥物，藍(lán)色代表中藥復(fù)方中的15種活性成分(1個(gè)活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)無(wú)交集，予刪除)，綠色代表包括環(huán)加氧酶1(PTGS1)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGFA)、蛋白激酶(AKT1)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白介素-6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、低聚果糖(FOS)在內(nèi)的148個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表疾病。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白相關(guān)作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中錄入上述148個(gè)共同靶點(diǎn)，分析得到蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)。詳見(jiàn)圖3。每條邊代表蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線(xiàn)條越多代表關(guān)聯(lián)度越大，得到PPI圖中包括IL-6、AKT1、VEGFA、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等排名居前30位的靶點(diǎn)排序。詳見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，148個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)可能是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的核心，三七-扶芳藤藥對(duì)可能是通過(guò)這些靶點(diǎn)對(duì)心力衰竭起作用。

圖3 靶點(diǎn)相互作用PPI圖

圖4 PPI圖中的靶點(diǎn)排序(排名前30位)

2.5 靶點(diǎn)生物功能及通路分析 將148個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行后GO分析選取生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能3部分。GO結(jié)果顯示，交集基因集合共富集至2 243條生物學(xué)過(guò)程通路中(見(jiàn)圖5)，其中，富集基因數(shù)>10個(gè)(富集度>20%)為428條，主要與對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖反應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、對(duì)類(lèi)固醇激素的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、體液水平的調(diào)節(jié)相關(guān)等；交集基因集合共富集至73條細(xì)胞組分表達(dá)過(guò)程中(見(jiàn)圖6)，其中，富集基因數(shù)目>10個(gè)(富集度>20%)為24條，主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)域、卡維多拉、質(zhì)膜筏、囊泡腔細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔分泌顆粒腔等有關(guān)；交集基因集合共富集至 156個(gè)與分子功能相關(guān)的過(guò)程中(見(jiàn)圖7)，其中，富集基因數(shù)目>10個(gè)(富集度>20%)為26項(xiàng)，主要與細(xì)胞因子受體結(jié)合、類(lèi)固醇結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、輔因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、絲氨酸水解酶活性等有關(guān)。

圖5 三七-扶芳藤藥對(duì)GO富集分析的生物過(guò)程條形圖

圖6 三七-扶芳藤藥對(duì)GO富集分析的細(xì)胞組分條形圖

圖7 三七-扶芳藤藥對(duì)GO富集分析的分子功能條形圖

將148個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行后共得到144條KEGG通路，前30條的結(jié)果形成KEGG功能富集的條形圖，P代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。結(jié)果顯示共同靶點(diǎn)主要富集于如AGE-RAGE通路、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路、兩面神激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(JAK-STAT)通路、胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路等。詳見(jiàn)圖8。

圖8 三七-扶芳藤藥對(duì)治療心力衰竭的KEGG富集分析

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，通過(guò)對(duì)三七-扶芳藤藥對(duì)進(jìn)行成分、靶點(diǎn)與疾病的生物信息學(xué)綜合網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，探究三七-扶芳藤藥對(duì)治療心力衰竭的整體機(jī)制，呈現(xiàn)出中藥治療的多成分、多靶點(diǎn)、整合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，并進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析揭示具核心作用通路。

通過(guò)整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)室報(bào)道，發(fā)現(xiàn)三七-扶芳藤藥對(duì)的主要化學(xué)成分包含人參皂苷Rb1(Gs-Rb1)、槲皮素、β-谷甾醇、兒茶素、沒(méi)食子酸等[7-8]，部分關(guān)鍵化合物分子具有高度的中心性，并且應(yīng)用于心血管領(lǐng)域的研究中。相關(guān)研究表明，人參皂苷Rb1可在AMPK信號(hào)級(jí)聯(lián)介導(dǎo)下減輕心肌細(xì)胞的缺血缺氧損傷[9]。李龍飛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1可以阻止阿霉素引起的心肌細(xì)胞活力降低，還能夠減少阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，人參皂苷Rb1對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬而實(shí)現(xiàn)的。槲皮素(quercetin)具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等廣泛生理活性[11]，已被證明可以減少動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成[12]。β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低膽固醇、抗腫瘤等功效，研究表明，β-谷甾醇可以降低膽固醇小腸吸收，還能通過(guò)抑制膽固醇合成酶(HMG-CoA)的表達(dá)，減少膽固醇的體內(nèi)合成，是治療高膽固醇血癥的有效藥劑[13-15]。研究表明，兒茶素可緩解大鼠心力衰竭，其作用機(jī)制可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)磷酸二酯酶(PEDs)的活性位點(diǎn)，使 PEDs 的催化活性降低而產(chǎn)生催化延遲效應(yīng)，而且可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而起到緩解心力衰竭的作用[16]。卜麗梅等[17]研究表明，沒(méi)食子酸可明顯降低血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平，縮小心肌梗死區(qū)范圍，對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與沒(méi)食子酸分別下調(diào)促凋亡基因Bax和上調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)降低心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。這些關(guān)鍵化合物在炎癥反應(yīng)、抗氧化、改善血流灌注、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能、抑制心肌細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬等方面均有一定的作用，與三七-扶芳藤藥對(duì)前期功效的研究結(jié)論有一定契合性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心室重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭不斷進(jìn)展的生理病理基礎(chǔ)[18]。心肌細(xì)胞肥大、炎癥反應(yīng)和心臟纖維化是心室重構(gòu)相關(guān)的主要病理變化，心室重構(gòu)引起心肌細(xì)胞自噬水平變化，提高自噬可以抑制心肌重構(gòu)及心肌肥厚，對(duì)自噬信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制的研究將是治療心力衰竭非常有前景的策略。

本研究通過(guò)分析篩選出三七-扶芳藤藥對(duì)的有效活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路，構(gòu)建與心力衰竭相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，用以分析三七-扶芳藤藥對(duì)治療心力衰竭的潛在作用機(jī)制。根據(jù)藥物-疾病-成分網(wǎng)絡(luò)圖，三七-扶芳藤藥對(duì)各成分通過(guò)包括PTGS1、MMP-3、STAT1、VEGFA、AKT1、CRP、IL-6、MMP-9、FOS等多種靶點(diǎn)協(xié)同作用，最終達(dá)到治療心力衰竭的作用。賈彩霞等[19]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PTGS1與炎癥、細(xì)胞凋亡相關(guān)，能夠降低血清促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)的水平，明顯改善心功能。孫奇林等[20]研究發(fā)現(xiàn)MMP-3屬于細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶，通過(guò)藥物干預(yù)降低MMP-3的表達(dá)達(dá)到延緩心肌纖維化的作用。IL-6可通過(guò)抑制一氧化氮(NO)合成能力直接影響心臟的收縮能力。馬偉利等[21]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藥物降低IL-6水平可提高心肌收縮力，改善心功能，減輕心臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，延緩心室重構(gòu)進(jìn)程，從而有效治療心力衰竭。研究表明，VEGFA對(duì)血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用[22]，VEGFA為冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化治療的新方案，VEGFA可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠的自噬水平，從而改善心功能[23]。MMP-9可促進(jìn)Ⅰ型膠原水平(ICTP)降解，致使室壁壓力增加、室壁變薄，心肌壞死致使其正常張力喪失，在室壁壓力下心肌重新排列，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)[24]。

通過(guò)KEGG富集分析，三七-扶芳藤藥對(duì)可能通過(guò)AGE-RAGE通路、AMPK通路、JAK-STAT通路、PI3K-AKT通路等多條通路發(fā)揮作用。AMPK是細(xì)胞的“代謝和能量感受器”[25]，AMPK 介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是調(diào)節(jié)自噬的重要通路之一，AMPK 可感知細(xì)胞能量狀態(tài)并調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)，通過(guò)線(xiàn)粒體自噬保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的損傷[26]。自噬在能量代謝和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用，且已發(fā)現(xiàn)其在病理狀態(tài)下有益于心臟功能的恢復(fù)[27]。人參皂苷Rb1可能通過(guò) AMPK 信號(hào)通路介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的自噬作用進(jìn)而調(diào)控缺氧心肌細(xì)胞的耐缺氧能力[9]。發(fā)生心力衰竭或心律失常時(shí)，AMPK 的表達(dá)在心臟代謝功能障礙中發(fā)揮重要作用[28]。研究表明，JAK-STAT通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、炎癥和凋亡[29]；曾勇等[30]研究發(fā)現(xiàn)中藥可以通過(guò)抑制JAK-STAT通路的激活，減輕細(xì)胞凋亡，改善心功能。PI3K-AKT信號(hào)通路也對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用；王萌等[31]發(fā)現(xiàn)激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制心室重構(gòu)，控制心力衰竭的進(jìn)展。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)綜合考察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，提示中藥相關(guān)藥理作用靶點(diǎn)、篩選中藥有效靶成分可大大減少實(shí)驗(yàn)工作量，降低重要新藥開(kāi)發(fā)及研究的風(fēng)險(xiǎn)，有助于加速中藥現(xiàn)代化及源于中藥的創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)[32]。中藥對(duì)心力衰竭自噬的調(diào)控作用可能為促進(jìn)，也可能為抑制，中藥治療疾病的機(jī)制是復(fù)雜交互的網(wǎng)絡(luò)而并非單獨(dú)起作用，因其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞自噬機(jī)制復(fù)雜，可能涉及多條通路、多個(gè)靶蛋白。中藥的抗病機(jī)制有待豐富，有關(guān)中藥調(diào)控自噬的物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制也有待更深入的研究。隨著自噬相關(guān)機(jī)制進(jìn)一步研究，中藥對(duì)自噬的調(diào)控有望成為治療心力衰竭的新思路和新途徑。本研究初步預(yù)測(cè)了三七-扶芳藤藥對(duì)治療心力衰竭的基本藥理基礎(chǔ)及功效機(jī)制，與現(xiàn)代臨床用藥規(guī)律契合，為下一步深入驗(yàn)證奠定了良好理論基礎(chǔ)。