馬苑萍 張振庭 楊圣輝 程 倩 王 昊

牙周炎是最常見的口腔疾病之一，是成年人失牙的主要原因，是主要由牙菌斑引起的牙周支持組織的炎性破壞性、感染性疾病[1]。目前牙周炎治療的主要方法是牙周基礎(chǔ)治療即齦上潔治術(shù)、齦下刮治術(shù)和根面平整(scaling and root planing，SRP)[2,3]。但是受牙齒解剖形態(tài)、牙周袋深度等原因的影響，治療效果常受到限制，而且有些患者齦上菌斑控制不好，口腔衛(wèi)生差，治療效果也會受到影響，因此局部使用藥物成為了牙周炎基礎(chǔ)治療重要的輔助手段之一[4,5]。與全身給藥相比，牙周局部抗菌緩釋劑具有用藥劑量小，到達(dá)病變部位的藥物濃度可保持在有效范圍內(nèi)，有效血藥濃度維持時間長，血藥濃度峰谷波動小等優(yōu)點(diǎn)?？谇痪植拷o藥亦可避免首過效應(yīng)，提高病人服藥的順應(yīng)性，在牙周炎的臨床治療中展示了良好的治療效果和應(yīng)用前景。近年來，尋找具有良好的生物降解性和高度生物相容性，價格低廉，緩釋效果較好的緩釋材料成為牙周緩釋劑的研究熱點(diǎn)，目前牙周緩釋材料主要有脂質(zhì)體、水凝膠、殼聚糖、聚乳酸等[6,7]。本實(shí)驗(yàn)使用的緩釋材料為可溶性膠原(Atelocollagen)。

可溶性膠原(Atelocollagen)是將膠原分子中免疫原性最強(qiáng)的成分-端肽用酶等物質(zhì)處理后再合成，它具有特定的生物學(xué)性能，如免疫活性及抗原性低、生物相容性好、能被身體組織吸收、能促進(jìn)細(xì)胞分化及組織再生修復(fù)等。膠原所具有的羧基和氨基經(jīng)化學(xué)修飾后，可成為新的生物材料。牛皮來源的可溶性膠原很早就已經(jīng)在國外作為整形美容材料用于人體了。去除了端肽后的牛皮膠原，雖然能引起人體的免疫反應(yīng)，但是對人體是沒有任何危害的[8]。因可溶性膠原良好的生物學(xué)性能，它已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域，如人工腎臟透析膜、人工心肺、人工角膜、人工血管、外科手術(shù)縫合線等[9]，尤其引人注目的是，可溶性膠原的細(xì)胞分化活性可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的粘附及分化[10]，這對牙周組織的修復(fù)也有重要的意義。近年來，國外以膠原為緩釋材料的牙周緩釋制劑已被商品化(periodental plus AB)[11,12]，還有研究將膠原作為緩釋材料與甲硝唑聯(lián)合制備成牙周緩釋劑，發(fā)現(xiàn)其有很好的臨床效果[13]。目前，膠原緩釋材料在國內(nèi)還沒有得到很好的應(yīng)用，本文以牛皮膠原作為緩釋材料，聯(lián)合藥物二甲胺四環(huán)素和環(huán)丙沙星，看其對牙周致病菌的抑菌作用，為下一階段可溶性膠原緩釋劑體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)，為緩釋劑的研制提供理論依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 可溶性膠原緩釋劑的制備

1.1.1 可溶性膠原緩釋材料的制備 將牛皮膠原進(jìn)行可溶性處理。取生牛皮網(wǎng)狀層做原料，將其絞碎，用10%氯化鈉抽取去除溶解性球蛋白，用乙醚抽取去除脂肪，再用pH8 磷酸緩沖液和pH3.5磷酸三羧酸反復(fù)抽取后，經(jīng)酶蛋白水解，低溫分離出可溶性膠原。將可溶性膠原配制成三種不同濃度(1%，2%和3.5%)的膠原原液。(緩釋材料的制備由日本株式會社高研研究所完成)(圖1)。

圖1 可溶性膠原(atelocollagen)

1.1.2 可溶性膠原緩釋劑制備與分組 將二甲胺四環(huán)素(Sunstar INC，日本)與可溶性膠原緩釋材料混合，制備出可溶性膠原二甲胺四環(huán)素緩釋劑，稱為二甲胺四環(huán)素組。將環(huán)丙沙星(中國藥品生物制品檢定所)與可溶性膠原緩釋材料混合，制備出膠原濃度為2%的可溶性膠原環(huán)丙沙星緩釋劑，稱為環(huán)丙沙星組。將環(huán)丙沙星組與二甲胺四環(huán)素組(膠原濃度也為2%)相比，比較兩組牙周緩釋劑對4 種牙周致病菌的抑菌能力差異。

二甲胺四環(huán)素組根據(jù)膠原濃度不同分為一、二、三組，膠原濃度分別為3.5%，2%和1%。對照組為鹽酸米諾環(huán)素軟膏(派麗奧)組(二甲胺四環(huán)素濃度20mg/ g，Sunstar INC，日本)，未添加膠原成分。二甲胺四環(huán)素組與派麗奧組相比，比較它們的抑菌能力差異。

1.2 配置藥敏培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)使用的4 種常見牙周炎致病菌，牙齦卟啉單胞菌(P.g)(ATCC 33277)、中間型普氏菌(P.i)(ATCC 25261)、具核梭桿菌(F.n)(ATCC 10953)、粘性放線菌(A.v)(ATCC 19246)(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院研究所提供)。采用定量懸液法，將這4 種菌株活化、提純和增菌，制作菌懸液，分別取0.1ml 均勻涂入CDC 厭氧血瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 五組牙周緩釋劑最低抑菌濃度(MIC)檢測 對四組可溶性膠原牙周緩釋劑(二甲胺四環(huán)素三組和環(huán)丙沙星組)以及派麗奧軟膏分別進(jìn)行活性測定，測量這五組牙周緩釋劑對4 種牙周炎致病菌的最低抑菌濃度(MIC)。將二甲胺四環(huán)素組和環(huán)丙沙星組用膠原原液依次做3 倍稀釋，派麗奧軟膏用生理鹽水依次做3 倍稀釋，使得五組藥物濃度均由高到低分為10 個梯度(1-10)，分別是21.1mg/ mL，7.033mg/ mL，2.344mg/ mL，0.781mg/ mL，0.260mg/ mL，0.086mg/ mL，0.028mg/ mL，0.009mg/ mL，0.003mg/ mL，0.001mg/ mL。將藥物與CDC 培養(yǎng)基混合后，鋪平皿。每組藥物從濃到稀鋪10 個平皿，并設(shè)有兩個空白對照，將稀釋的菌液點(diǎn)種至藥物平皿上，厭氧37℃，培養(yǎng)5d，觀察MIC[14]。

1.3.2 牙周致病菌對五組牙周緩釋劑的藥敏實(shí)驗(yàn) 采用鋼管法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，在藥敏培養(yǎng)基上放上消毒過的鋼管，向管內(nèi)加注不同藥物濃度的可溶性膠原緩釋劑和派麗奧，厭氧37℃，培養(yǎng)5d，測量鋼管周圍緩釋劑抵制細(xì)菌的生長直徑并記錄。每組重復(fù)5 次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSSl3.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用K-S 檢驗(yàn)證實(shí)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，Levene 檢驗(yàn)證實(shí)數(shù)據(jù)方差齊，應(yīng)用單因素方差分析對多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間進(jìn)行檢驗(yàn)，運(yùn)用T檢驗(yàn)對兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P﹤0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.結(jié)果

所有實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均生長良好。表1 是五組藥物對4 種常見菌的最低抑菌濃度，均小于0.009mg/ mL。環(huán)丙沙星組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.009mg/ mL，二甲胺四環(huán)素組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.003mg/ mL。表2 是二甲胺四環(huán)素組中的第二組與環(huán)丙沙星組(膠原濃度均為2%)在藥物濃度為0.009mg/ mL、0.003mg/ mL 及0.001mg/ mL 時對4 種常見菌的抑菌環(huán)直徑比較。藥物濃度在0.009mg/ mL 時，二甲胺四環(huán)素組對4 種細(xì)菌均表現(xiàn)出比環(huán)丙沙星組更強(qiáng)的抑菌能力(P﹤0.05)；藥物濃度在0.003mg/ mL 時，二甲胺四環(huán)素組對P.g 和F.n 菌株的抑菌能力比環(huán)丙沙星組更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)；藥物濃度在0.001mg/ mL 時，二甲胺四環(huán)素組對F.n 和A.v 菌株的抑菌效果比環(huán)丙沙星更好(P﹤0.05)。

表1 五組藥物對4 種牙周致病菌的最低抑菌濃度(mg/ mL)

圖2 為四組藥物對P.g 菌株、P.i 菌株、F.n菌株、A.v 菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對于P.g 菌株，當(dāng)濃度較高時(﹥2.344mg/ mL)，派麗奧組和二甲胺四環(huán)素組的抑菌效果無明顯差異，隨著藥物濃度的降低，二甲胺四環(huán)素組中的三組牙周緩釋劑的抑菌能力普遍高于派麗奧組，尤其在藥物濃度為0.781mg/ mL(F=96.60，P﹤0.05)和0.009mg/ mL(F=45.11，P﹤0.05)時，表現(xiàn)出比派麗奧明顯更強(qiáng)的抑菌作用(圖2a、圖3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；對于P.i 菌株，藥物濃度為21.1mg/ mL(F=36.59，P﹤0.05)，7.033 mg/ mL(F=72.40，P﹤0.05)以及2.344mg/ mL(F=85.15，P﹤0.05)時，派麗奧組比膠原濃度為2%和1%的二甲胺四環(huán)素組具有更強(qiáng)的抑菌作用，藥物濃度降低至0.086mg/ mL(F=39.87，P﹤0.05)，0.028mg/ mL(F=48.54，P﹤0.05)和0.009mg/ mL(F=20.38，P﹤0.05)時，派麗奧組的抑菌能力則明顯低于二甲胺四環(huán)素組(圖2b、圖4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；對于F.n 菌株，當(dāng)藥物濃度為0.009mg/ mL(F=67.24，P﹤0.05)，0.003mg/ mL(F=21.80，P﹤0.05)，0.001mg/ mL(F=32.12，P﹤0.05)時，二甲胺四環(huán)素組具有較強(qiáng)的抑菌作用(圖2c、圖5)；對于A.v 菌株，當(dāng)藥物濃度為0.009mg/ mL(F=15.48，P﹤0.05)和0.001mg/ mL(F=22.77，P﹤0.05)時，二甲胺四環(huán)素組比派麗奧組抑菌能力更強(qiáng)(圖2d、圖6)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 四組藥物對4 種常見菌的抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果趨勢圖

圖3 四組藥物對P.g 菌株抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果。

圖4 四組藥物對P.i 菌株抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果。

圖5 四組藥物對F.n 菌株抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果。

圖6 四組藥物對A.v 菌株抑菌環(huán)直徑測量結(jié)果

3.討論

牙周緩釋劑是牙周基礎(chǔ)治療有效的輔助手段。牙周緩釋劑中的緩釋材料十分重要，緩釋材料可避免藥物突釋，確保藥物在一定濃度內(nèi)緩慢穩(wěn)定釋放，還可增強(qiáng)藥物的生物相容性和組織靶向性。膠原蛋白因其良好的生物相容性，低免疫原性，優(yōu)良的止血性能成為了緩釋材料的研究熱點(diǎn)[15,16]，本實(shí)驗(yàn)使用的是牛皮膠原中提取的可溶性膠原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星組對中間型普氏菌和具核梭桿菌的MIC 高于二甲胺四環(huán)素組。環(huán)丙沙星組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.009mg/ mL，而二甲胺四環(huán)素組對4 種菌株的最低抑菌濃度小于0.003mg/ mL，且在藥物濃度較低時(﹤0.009 mg/ mL)，膠原濃度相同(2%)的環(huán)丙沙星組和二甲胺四環(huán)素組相比，二甲胺四環(huán)素組對4 種牙周致病菌的抑菌能力普遍要高于環(huán)丙沙星組，提示二甲胺四環(huán)素與可溶性膠原結(jié)合后的抑菌能力更強(qiáng)。有研究顯示環(huán)丙沙星和二甲胺四環(huán)素都是比較好的牙周炎治療藥物[14]，但是本實(shí)驗(yàn)顯示二甲胺四環(huán)素組的抑菌效能更高，與可溶性膠原結(jié)合后，表現(xiàn)出比環(huán)丙沙星組更強(qiáng)的抑菌作用，是牙周緩釋劑比較好的藥物選擇。

在對P.g 菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)中(圖2a、圖3)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度較高時(﹥2.344mg/ mL)，派麗奧組和二甲胺四環(huán)素組的抑菌效果無明顯差異，但是當(dāng)藥物濃度為小于0.781mg/ mL，濃度逐漸降低時，二甲胺四環(huán)素組卻比派麗奧組有更強(qiáng)的抑菌作用，表明可溶性膠原緩釋劑可以比較穩(wěn)定地維持藥物的療效，避免藥物的突釋，促進(jìn)藥物地緩慢釋放，這也提示可溶性膠原作為緩釋材料的可行性。

在對P.i 菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)中(圖2b、圖4)，可以看出當(dāng)藥物濃度處于較高的水平時(﹥2.344mg/ mL)，可溶性膠原濃度為3.5%的二甲胺四環(huán)素組比膠原濃度為1%和2%的二甲胺四環(huán)組的抑菌作用更強(qiáng)，提示膠原的濃度可能影響藥物的抑菌作用，但是兩者之間量效關(guān)系如何，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。此外，在對P.i 菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)中，高藥物濃度時，派麗奧組出現(xiàn)了比膠原濃度為1%和2%的二甲胺四環(huán)組更強(qiáng)的抑菌作用，但是隨著藥物濃度的降低，派麗奧組的抑菌能力則逐漸低于二甲胺四環(huán)素組，這也進(jìn)一步表明可溶性膠原緩釋劑藥效的穩(wěn)定性。在對F.n 和A.v 菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)中(圖2c、圖2d，圖5、圖6)在藥物濃度較高時，二甲胺四環(huán)素組和派麗奧組均表現(xiàn)出了良好的抑菌作用，但是在藥物濃度較低時(﹤0.009mg/ mL)，派麗奧組的抑菌作用則低于二甲胺四環(huán)素組?？扇苄阅z原牙周緩釋劑在藥物濃度較低時還能保持比較好的抑菌效能，在一定程度上說明了可溶性膠原較好的緩釋作用，促使藥物能比較穩(wěn)定緩慢地釋放，這在臨床上是有很有意義的，但是受實(shí)驗(yàn)樣本量的限制，未來我們還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一觀點(diǎn)。

可溶性膠原牙周緩釋劑良好穩(wěn)定的抑菌性能是其能運(yùn)用于臨床的基礎(chǔ)條件之一?，F(xiàn)在臨床上廣泛應(yīng)用的派麗奧軟膏的主要成分也是二甲胺四環(huán)素，添加物的主要成分是羥乙基纖維素，派麗奧抗菌作用強(qiáng)，局部濃度高，藥物緩慢釋放，在牙周袋內(nèi)停留時間長，是非常好的牙周緩釋劑，但是它是一種溶性油脂緩釋劑，遇水變?yōu)檩^硬的高粘度凝膠狀，不易從牙周袋流出，不能被組織吸收，這是需要改善的地方，而可溶性膠原可以在體內(nèi)完全降解，可代謝吸收，這也是當(dāng)前臨床使用的派麗奧所不能達(dá)到的[17]。此外，可溶性膠原與宿主細(xì)胞之間有良好的相互作用，可促進(jìn)不同類型細(xì)胞生長，它的成骨作用可以促進(jìn)牙周組織的修復(fù)，這也是它對于其它緩釋材料的優(yōu)勢[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可溶性膠原牙周緩釋劑對4 種口腔牙周常見致病菌均有良好的抑菌作用。在藥物濃度降低時，其作用優(yōu)于牙周緩釋劑派麗奧，提示可溶性膠原作為牙周緩釋材料的應(yīng)用價值，但是從實(shí)驗(yàn)階段過渡到臨床應(yīng)用，還需要做大量的工作和更深入的研究。