安巧云，魏敏，周劍，柴艷兵，張耀廣，王夢，曹玉蘭，李興佳

(1.君樂寶乳業(yè)集團，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部乳品質(zhì)量安全控制重點實驗室，石家莊 050021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081)

乳粉及乳制品在食品中的重要性日趨明顯，乳制品行業(yè)也一直是我國民生的重要產(chǎn)業(yè)［1］，其中，脂肪是膳食能量的重要來源，但攝入過多脂肪也會造成肥胖癥，故脂肪含量成為了乳粉的重要檢測項目［2–4］。穩(wěn)定性良好的脂肪標(biāo)準(zhǔn)樣品對于保障測定結(jié)果的準(zhǔn)確性起著關(guān)鍵作用，在乳制品檢驗中也發(fā)揮著重要意義。國內(nèi)外該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用范圍日益廣泛［5–6］。經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心網(wǎng)站查詢，目前乳粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)仍很欠缺。企業(yè)實驗室需要大量購置進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，既增加了成本，又使標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)行業(yè)受制于人，不利于行業(yè)的發(fā)展。因此開發(fā)乳粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有著重要的意義。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通常是包含被分析物的真實樣品，它們以自然形式存在于自然環(huán)境中，應(yīng)選擇與測試樣品基體相似的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并準(zhǔn)確定值。Gandra等［7］研制了全脂乳粉中水分、灰分、脂肪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；楊軼眉［8］采用充氮密封的方式研制了嬰幼兒配方奶粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。筆者采用真空密封及輻照處理，進(jìn)一步改善了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。定值方法的建立基于GB 5009.6—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》第三法［9］，原理是用無水乙醚和石油醚抽提樣品的堿（氨水）水解液，通過蒸餾或蒸發(fā)去除溶劑，測定溶于溶劑中的抽提物的質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值采用6家乳制品檢測相關(guān)或行業(yè)權(quán)威的實驗室聯(lián)合定值，并對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性檢驗及不確定度評估［10–11］，確保在使用過程中量值準(zhǔn)確可靠［12–13］。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電熱恒溫水浴鍋：HWS–26型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

鼓風(fēng)干燥箱：XT5118M–OV240型，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

三維混勻機：KSH-50型，北京錕捷玉城機械設(shè)備有限公司。

電子天平：ME204E，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒公司。

乙醇、無水乙醚、石油醚、剛果紅、鹽酸：分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司。

乳粉：君樂寶乳業(yè)有限公司。

氨水：分析純，石家莊市試劑廠。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法

稱取1.0 g乳粉樣品置于抽脂瓶中，加入10 mL 60 ℃的水，充分混合。加入2.0 mL氨水，充分混合后立即將抽脂瓶放入60 ℃的水浴中，加熱20 min，不時取出振蕩，靜置30 s。取出，冷卻至室溫。加入10 mL乙醇，緩慢地混合均勻（采用手搖式混勻，蓋上抽脂瓶塞，緩慢傾斜抽脂瓶，使抽脂瓶小球中的液體完全傾出，再使抽脂瓶恢復(fù)到垂直狀態(tài)，為一次混勻，反復(fù)此操作5次以上可達(dá)到徹底混勻的目的）。加入25 mL乙醚，輕輕振蕩搖勻。加入25 mL石油醚，輕輕振蕩搖勻。將抽脂瓶靜置至少30 min，直到上層液澄清，并明顯與水相分離。將上層液盡可能地倒入已準(zhǔn)備好的加入沸石的脂肪收集瓶中，避免倒出水層進(jìn)入抽脂瓶中。加入5 mL乙醇，用15 mL無水乙醚和15 mL石油醚，進(jìn)行第2次抽提。用15 mL無水乙醚和15 mL石油醚，進(jìn)行第3次抽提。合并所有提取液，于沸水浴上蒸發(fā)至干來除掉溶劑。將脂肪收集瓶放入(100±5)℃的烘箱中干燥1 h，取出后置于干燥器中冷卻0.5 h后稱量。重復(fù)以上操作至恒重(直至兩次稱量的差不超過2 mg)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物原料為與日常檢測水平相當(dāng)?shù)娜榉郏?jīng)過三維混勻機混勻，用避光鋁箔袋真空密封封裝，按5 g／袋包裝，共包裝800個單元，按輻照劑量為5.5 kGy，輻照時間為4 h進(jìn)行輻照，于–20 ℃冷凍保存。

1.4 均勻性和穩(wěn)定性檢驗

1.4.1 均勻性檢驗

根據(jù)JJG 1006—1994 《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》和JJF 1343—2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》［14–15］的要求，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝中隨機抽取25個單元，做標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性統(tǒng)計檢驗，每個單元中最小取樣量為1.00 g，平行取3次，檢驗方法與基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方法相同。

1.4.2 穩(wěn)定性檢驗

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗包括長期穩(wěn)定性檢驗和短期穩(wěn)定性檢驗，長期穩(wěn)定性檢驗按先密后疏的原則，分別在第0、1、2、4、6月進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗，實驗方法與定值方法相同，每次取二個獨立包裝，每個包裝取平行測定3次。

短期穩(wěn)定性檢驗根據(jù)模擬運輸條件，將樣品置于4 ℃和50 ℃下，分別在第0、1、3、5、7天進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測，實驗方法與定值方法相同。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值及數(shù)據(jù)處理

聯(lián)合6家實驗室按1.2定值方法進(jìn)行定值。數(shù)據(jù)處理為用達(dá)戈斯提諾法考察所有數(shù)據(jù)的正態(tài)性，用狄克遜檢驗法考察離群值，用科克倫檢驗法考察是否等精度。

2 結(jié)果與討論析

2.1 均勻性檢驗

對隨機抽取的25個單元進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。用F檢驗法對均勻性檢驗結(jié)果做方差分析，通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷不同單元中乳粉中脂肪含量的測量值之間有無系統(tǒng)性差異。從表1數(shù)據(jù)計算得F=1.05，查表得F臨界值F0.05(24,50)=1.86，F(xiàn)＜F0.05(24,50)，表明組內(nèi)與組間無明顯差異，滿足國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求，說明樣品是均勻的。

表1 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性檢驗

穩(wěn)定性檢驗以時間x為縱坐標(biāo)、乳粉中脂肪測定值y為橫坐標(biāo)，以檢測時間和結(jié)果擬合直線，采用趨勢分析法，對穩(wěn)定性檢驗結(jié)果統(tǒng)計分析。

長期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)見表2，擬合直線為y=0.000 064x+26.476，其中斜率β1=0.000 064，截距β0=26.476。

表2 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

由表2數(shù)據(jù)計算得s(β1)=0.000 106 6，自由度為n–2、置 信 水 平 為95%的t因 子t0.95，n–2=3.18。t0.95，3s(β1)=3.18×0.000 106 6=0.000 338 842 88。

因為|β1|=0.000 064，|β1|＜t0.95，3s(β1)，因此說明乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在該包裝儲存條件下，6個月內(nèi)是穩(wěn)定的。

短期穩(wěn)定性檢驗同樣采取趨勢分析法對4 ℃和50 ℃的穩(wěn)定性檢驗結(jié)果統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。

表3 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

4 ℃儲存條件下得到的擬合直線為y=0.000 271x+26.305，其中斜率β1=0.000 271，截距β0=26.305。由表3數(shù)據(jù)計算 得s(β1)=0.000 097 9，t0.95，3s(β1)=0.000 311 460 29，|β1|＜t0.95，3s(β1)，說明4 ℃條件下乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7天內(nèi)穩(wěn)定的。

50℃儲存條件下得到的擬合直線為y=–0.000 18x+26.368，其 中 斜 率β1=0.000 18，截 距β0=26.368。由表3數(shù)據(jù)計算 得s(β1)=0.000 097 9，t0.95，3s(β1)=0.001 204 116，|β1|＜t0.95，3s(β1)，說明50 ℃條件下乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在7天內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值結(jié)果

乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)6家實驗室定值結(jié)果列于表4，6家實驗室測定結(jié)果的總平均值為26.5%。

表4 乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合定值結(jié)果

2.3.1 正態(tài)檢驗

對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)D檢驗法(達(dá)戈斯提諾法)，得D值為0.273 1，大于臨界值0.271 7，因此該組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。

2.3.2 異常值檢驗

根據(jù)GB／T 4883—2008 《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋–正態(tài)樣本離群值的判斷和處理》［16］，采用狄克遜準(zhǔn)則對各實驗室定值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗，將定值結(jié)果按照由小到大的順序排序：X1=26.11，……Xn–2=26.85，Xn–1=26.87，Xn=26.88，n=54，由狄克遜檢驗表查?(0.05，54)=0.32，r1和rn均小于?(0.05，54)，故全部數(shù)據(jù)均應(yīng)保留。

2.3.3 等精度檢驗

6家實驗室均采用堿水解法作為定值方法，采用科克倫法檢驗平均值間是否等精度，先計算6組數(shù)據(jù)中每組9個數(shù)據(jù)的方差，再計算其中的最大方差與6組方差和之比。

根據(jù)科克倫檢驗準(zhǔn)則，計算統(tǒng)計量6組方差和為0.024，其中最大方差與6組方差和之比：

查表得C(0.05，6，9)=0.381 7，C＜C(0.05，6，9)，表明各平均值間為等精度。

因此，以6家實驗室測定結(jié)果的總平均值作為本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乳粉中脂肪定值結(jié)果w=26.5%。

2.4 不確定度評定

脂肪基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源由三個部分組成：（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值引入的不確定度；（2）測量方法引入的不確定度；（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性引入的不確定度；（4）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度［17–19］。

2.4.1 定值引入的不確定度

由于本研究工作采用堿水解法，其它合作定值單位也采用了堿水解法獨立測量，經(jīng)柯克倫檢驗和迪克遜檢驗數(shù)據(jù)無異常值，最終定值結(jié)果為6家實驗室的合作定值結(jié)果，將這6組實驗室的平均值w作為一組新的數(shù)據(jù)，則：

2.4.2 測量方法引入的不確定度

根據(jù)結(jié)果的計算過程，在定值過程中主要是稱量參與結(jié)果計算，B類不確定度主要由以下幾個部分引入：測量結(jié)果重復(fù)性；涉及稱量共5次，m、m1、m2、m3、m4分別為樣品質(zhì)量、恒重后脂肪收集瓶和脂肪的質(zhì)量、脂肪收集瓶的質(zhì)量、空白實驗中恒重后脂肪收集瓶和抽提物的質(zhì)量、空白實驗中脂肪收集瓶的質(zhì)量。需要考慮的質(zhì)量分量包括m、m1、m2、m3、m4，其中m是二次稱量，m2、m4都是一次稱量得到而只考慮天平的校準(zhǔn)，m1、m3不僅考慮天平的校準(zhǔn)還要考慮恒重的問題。

m2、m4引入的不確定度只需考慮天平的校準(zhǔn)，按照檢定證書給出天平校正產(chǎn)生的不確定度為0.5 mg（k=2），則um2=um4=0.5／2=0.25 (mg)，在 脂肪一次檢測過程中，m1=70.277 3 g，m2=70.012 2 g，m3=70.682 3 g，m4=70.682 2 g。

2.4.3 均勻性引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性以獨立測定平行實驗來表示，即以瓶間和瓶內(nèi)均勻性檢驗結(jié)果的相對準(zhǔn)偏差SH表示。

由表1均勻性試驗結(jié)果得出：瓶間方差Q1=0.004 172，瓶內(nèi)方差Q2=0.008 247 9。

均勻性引入的相對不確定度：

ubb,rel=ubb／w=0.000 18／(26.5%)=0.065%

2.4.4 穩(wěn)定性引入的不確定度

脂肪乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性引入的不確定度根據(jù)表2數(shù)據(jù)計算：

ults=st=s(β1)t=0.000 106 6×6=0.000 64

脂肪乳粉基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期性穩(wěn)定性實驗引入的相對不確定度：

ults,rel=0.000 64／(26.5%)=0.241%

短期穩(wěn)定性引入的不確定度根據(jù)表3按50℃的數(shù)據(jù)計算：

usts=st=s(β1)t=0.000 378 7×7=0.002 65

短期穩(wěn)定性引入的相對不確定度按50℃的數(shù)據(jù)計算：

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的合成不確定度：

擴展不確定度：

UCRM=UCRM,relw=(2.160%)×(26.5%)=0.6%

2.5 定值結(jié)果

乳粉中脂肪分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果：

3 結(jié)語

研制了乳粉中脂肪成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其定值結(jié)果為26.5%，擴展不確定度為0.6%。該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲批為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可用于方法評價確認(rèn)，實驗室質(zhì)控樣品等，為我國乳品質(zhì)量安全檢測提供有力的保障手段。