申 杰，楊 迪，陳夢圓，郭新彪

(北京大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學系，北京 100191)

內皮細胞(endothelial cells，ECs)是MWCNTs進入血液輸送至靶器官之前需要接觸的細胞[6]。生理條件下，ECs參與調節(jié)代謝平衡、血管血流動力學、血管通透性、凝血和細胞募集。內皮細胞活化是指內皮細胞對環(huán)境刺激發(fā)生的細胞表型或功能的改變，最顯著的特征是內皮細胞-白細胞相互作用的增加，該活化過程還包括趨化因子和細胞表面黏附因子的表達上調[7]。內皮細胞活化在缺血再灌注損傷、血栓形成以及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]。探討MWCNTs對內皮細胞活化的作用規(guī)律及其機制，評估MWCNTs暴露對ECs的毒性以及改善MWCNTs的生物相容性有重要意義。

炎性小體是胞漿中激活半胱氨酰天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate-specific proteases caspase)-1的多聚蛋白復合物,核苷酸結合寡聚結構域樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小體是目前研究最深入和最具特征的炎性小體[9]，它可識別多種病原信號并誘導炎癥反應。動物和體外實驗表明，NLRP3炎性小體的激活參與內皮細胞活化[10-11],然而現(xiàn)有研究尚缺少MWCNTs激活ECs內NLRP3炎性小體的相關證據(jù)，不同長度和化學修飾的MWCNTs對ECs內NLRP3炎性小體的激活作用也尚未見報道。本研究旨在比較不同長度和化學修飾的MWCNTs對內皮細胞活化的作用并探討NLRP3炎性小體相關機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

杜氏培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、RPMI 1640 培養(yǎng)液、L-谷氨酰胺、青鏈霉素均購自美國Sigma-Aldrich公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自德國PAN-Biotech公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均購自北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶檢測試劑盒、細胞增殖檢測(cell counting kit，CCK)-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，小鼠血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，活細胞示蹤劑 CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)購自上海翊圣生物科技有限公司，GAPDH抗體、NLRP3抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗購自美國Cell Signaling Technology公司，磷酸化蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司，考馬斯亮藍法蛋白質定量試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。

1.2 MWCNTs的理化表征及染毒液制備

研究使用的MWCNTs分別為未修飾的短MWCNT(short MWCNT，S-MWCNT)、未修飾的長MWCNT(long MWCNT，L-MWCNT)、羧基修飾的長MWCNT(long carboxyl-functionalized MWCNT，L-MWCNTs-COOH)、羥基修飾的長MWCNT(long hydroxyl-functionalized MWCNT，L-MWCNT-OH)和氨基修飾的長MWCNT(long amino-functionalized MWCNT，L-MWCNT-NH2)均購自中國科學院成都有機化學有限公司，采用化學氣相沉積法(chemical vapor deposition，CVD)合成。產(chǎn)品說明中MWCNTs的基本特征信息見表1。

表1 廠家提供的MWCNTs理化性質信息Table 1 The physicochemical information of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) provided by the manufacturer

為進一步表征MWCNTs，前期研究采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM，JEM-1400 Plus，日本JEOL公司)對MWCNTs的形態(tài)和粒徑進行觀察，具體方法和結果參考本課題組前期研究[12-13]。本研究應用動態(tài)光散射粒度分析儀(dynamic light scattering and Zetasizer，Zetasizer nano ZS，英國Malvern公司)對MWCNTs在DMEM(含質量分數(shù)2% FBS)培養(yǎng)液中的分散狀態(tài)、平均水化粒徑及Zeta電位進行表征。

將MWCNTs粉末以1 g/L的濃度分散在含1%(質量分數(shù))BSA的PBS溶液中，在冰水中超聲分散3 h得到儲備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｃ看问褂们?，將儲備液超聲處? min，然后在含有2%(質量分數(shù)) FBS的培養(yǎng)液中稀釋至最終染毒濃度。

1.3 小鼠腦微血管內皮細胞株b.End3和人外周血單核細胞株THP-1培養(yǎng)

本研究使用的細胞模型為小鼠腦血管內皮細胞株b.End3和人外周血單核細胞株THP-1，均購自美國模式培養(yǎng)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。b.End3是目前常用的永生化血管內皮細胞系之一，具有純度高、易獲取、易操作、各代細胞間變異小等優(yōu)點[14]。該細胞系在活化狀態(tài)下表達較豐富的黏附因子和選擇素，常用于內皮細胞活化的相關研究[15]。b.End3細胞在含有10%(質量分數(shù))FBS、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1%(質量分數(shù))青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、飽和濕度、5%(體積分數(shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗測定在 3～20代細胞的對數(shù)生長期進行。

人外周血單核細胞系THP-1在含有10% FBS、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1% 青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗測定在3～20代細胞的對數(shù)生長期進行。

第四，要錘煉高尚的品格和堅韌不拔的耐力。一個國家、一個民族，沒有一種精神力量，就形不成很強的凝聚力。習近平總書記說：“中華民族偉大復興，絕不是輕輕松松、敲鑼打鼓就能實現(xiàn)的。全黨必須準備付出更為艱巨、更為艱苦的努力?！敝腥A民族的復興，是一個很長的過程，要注重培養(yǎng)一種積極的生活態(tài)度，展示良好的精神風貌，使平凡者變得偉大，平庸者擺脫平庸。古往今來，無數(shù)商業(yè)巨子、政壇領袖、文學大師，都是飽經(jīng)風雨，以頑強的毅力，在風浪中搏擊。我們要敢于直面困難、直面挑戰(zhàn)、堅韌不拔、百折不撓，一步一個腳印，全力寫好人生的答卷。

1.4 細胞毒性測定

采用CCK-8和LDH釋放試劑盒測定細胞毒性，b.End3細胞暴露于不同濃度的MWCNTs(0～125 μg/cm2)24 h后，進行CCK-8檢測，細胞上清液15 000 ×g，離心30 min后用于LDH釋放測定。使用多功能酶標儀(Varioskan Flash,美國賽默飛世爾科技公司)在450 nm(用于CCK-8)或490 nm(用于LDH釋放試驗)測定光密度。

1.5 ELISA測定細胞上清中可溶性VCAM-1含量

使用小鼠VCAM-1酶聯(lián)免疫試劑盒測定MWCNTs染毒后的細胞上清中可溶性VCAM-1(soluble VCAM-1，sVCAM-1)含量，使用多功能酶標儀在450 nm處測定光密度，根據(jù)標準系列測定的D值繪制標準曲線，并根據(jù)樣本D值和標準曲線計算樣本濃度。

1.6 單核細胞-內皮細胞黏附試驗

通過活細胞示蹤劑 CMFDA(cell tracker green 5-chloromethylfluorescein diacetate)標記THP-1單核細胞，并將標記好的THP-1與暴露MWCNTs后的b.End3在正常生長條件下孵育1 h，孵育完畢，使用PBS沖洗b.End3細胞3次，將未黏附在b.End3細胞上的THP-1去除。采用倒置熒光顯微鏡觀察黏附在b.End3細胞上的THP-1(綠色熒光標記)，每組選取10個視野拍攝并保存圖片，使用Image J軟件計算每張圖片中熒光THP-1細胞個數(shù)。

1.7 Western blot

b.End3細胞暴露于6.25 μg/cm2的MWCNTs不同時間(4、12和24 h)后，使用磷酸化蛋白提取試劑盒提取蛋白質,使用考馬斯亮藍蛋白定量法對提取蛋白定量。以50 μg蛋白/槽上樣至10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，40 mA恒流電泳1.5 h；然后250 mA 2.5 h將蛋白轉移至PVDF膜上。將膜在含5%(質量分數(shù))BSA的TBST中室溫封閉2 h后，4 ℃孵育一抗(NLRP3抗體)1∶300、GAPDH抗體(內參)1∶1 000過夜。然后與山羊抗兔或山羊抗鼠-HRP標記二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。使用化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)檢測蛋白條帶并拍照，使用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計學分析

每個實驗重復2～3次，計量資料以均數(shù)±標準差表示，使用Graphpad prism7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析和作圖。采用Studentt檢驗進行兩組間的比較，單因素方差分析進行多組間的比較；若有差異，則采用Turkey’s檢驗進行組間兩兩比較。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MWCNTs的理化表征

根據(jù)廠家提供的信息(表1)，所有類型碳管的純度均>98%，且具有相似的外徑。使用動態(tài)光散射儀對分散在細胞培養(yǎng)液DMEM(含2%FBS)中的MWCNTs進行了表征，MWCNTs的平均水化粒徑為80～250 nm(表2)，多分散系數(shù)(polydispersity，PDI)為0.248～0.310，各組的Zeta電位均為負，且絕對值相差不大，均在10左右，提示各組碳管在培養(yǎng)液中分散狀況均良好。

表2 MWCNTs的理化性質Table 2 Physicochemical characterization of the multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)

2.2 MWCNTs對b.End3的細胞毒性

采用CCK-8和LDH測定MWCNTs對內皮細胞b.End3增殖活性和細胞膜完整性的影響，為后續(xù)試驗測定提供劑量設置依據(jù)。隨著染毒劑量的增加，所有類型的MWCNTs均會引起b.End3的細胞活性降低，細胞膜完整性受損，LDH釋放增加(圖1)。在125 μg/cm2的濃度下，所有類型的MWCNTs作用24 h后均誘導b.End3細胞活性顯著降低，LDH釋放顯著增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。在較高濃度62.5 μg/cm2下，亦可觀察到部分碳納米管對b.End3細胞活性和LDH釋放的影響。相同濃度下，未觀察到各MWCNTs處理組對細胞增殖活性影響的顯著差異。在125 μg/cm2的濃度下，L-MWCNT作用后的細胞LDH釋放顯著高于S-MWCNT組(P<0.01)，也高于L-MWCNT-COOH、L-MWCNT-OH和L-MWCNT-NH2處理組(P<0.01)；在62.5 μg/cm2的濃度下，S-MWCNT作用后的細胞LDH釋放顯著低于L-MWCNT處理組(P<0.01)。

Cells were treated with different concentrations of MWCNTs for 24 h,and cell proliferation rate and cell membrane damage were detected by CCK-8 (A) and LDH (B) release assay,respectively.*P<0.05 or △P<0.01 vs. controls.#P<0.05 or ▲P<0.01 vs. L-MWCNT group.圖1 MWCNTs對b.End3的細胞毒性Figure 1 Cytotoxicity of MWCNTs in b.End3 cells

2.3 不同長度的MWCNTs對b.End3內皮細胞活化效應的影響

采用ELISA測定碳管染毒后的b.End3細胞上清sVCAM-1水平，并采用細胞黏附試驗檢測b.End3對單核細胞THP-1的黏附力，共同評價MWCNTs對b.End3對內皮細胞活化的影響(圖2)，在6.25 μg/cm2和12.5 μg/cm2的濃度下，兩種長度MWCNTs作用b.End3細胞24 h后均誘導細胞上清sVCAM-1水平顯著增加，b.End3對THP-1的黏附力顯著增強(P<0.05和P<0.01)。在相同濃度下，L-MWCNT處理組的細胞上清sVCAM-1水平及細胞對THP-1的黏附力顯著強于S-MWCNT處理組(P<0.05，P<0.01)。

After exposure to different concentrations for 24 h,effects of S-MWCNT and L-MWCNT on the endothelial activation of b.End3 were determined by the measurement of soluble vascular adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentration in cell supernatant (A) and adhesion assay of THP-1 cells to b.End3 (B).*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.# P<0.05,▲P<0.01 vs. S-MWCNT group.圖2 不同長度MWCNTs誘導b.End3內皮細胞活化效應比較Figure 2 Comparison of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs of different lengths

2.4 不同化學修飾的MWCNTs對b.End3內皮細胞活化效應的影響

比較相同長度下未修飾，羧基、氨基和羥基修飾的MWCNTs對b.End3內皮細胞活化的影響(圖3)，在6.25 μg/cm2和12.5 μg/cm2的濃度下，所有類型的MWCNTs作用b.End3細胞24 h后均誘導細胞上清sVCAM-1水平顯著增加，b.End3對THP-1的黏附力顯著增強(P<0.01)。而在相同濃度下，不同化學修飾的MWCNTs對內皮細胞活化的影響差異無統(tǒng)計學意義。

After exposure to different concentrations for 24 h,effects of L-MWCNT,L-MWCNT-COOH,L-MWCNT-NH2 and L-MWCNT-OH on the endothelial activation of b.End3 were determined by the measurement of soluble vascular adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentration in cell supernatant (A) and adhesion assay of THP-1 cells to b.End3 (B).△P<0.01 vs.untreated controls.圖3 不同化學修飾的MWCNTs誘導b.End3內皮細胞活化效應比較Figure 3 Comparison of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs of different chemical modification

2.5 不同長度和化學修飾的MWCNTs誘導b.End3內皮細胞活化的時效關系

探討MWCNTs誘導b.End3內皮細胞活化的時效關系(圖4A、4B)，6.25 μg/cm2的L-MWCNT和S-MWCNT作用12 h后，b.End3細胞上清sVCAM-1水平顯著增加，b.End3對THP-1的黏附力顯著增強(P<0.05，P<0.01)，而作用24 h后，上述效應更加明顯，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。作用24 h后，L-MWCNTs處理組細胞上清sVCAM-1水平顯著高于S-MWCNT處理組(P<0.05和P<0.01)；作用12 h后，L-MWCNTs處理組細胞對THP-1的黏附力顯著強于S-MWCNT處理組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

對于相同長度下4種不同化學修飾的MWCNTs(圖4C、4D)，6.25 μg/cm2的MWCNTs作用12 h后，L-MWCNT、L-MWCNT-COOH和L-MWCNT-OH處理組細胞上清sVCAM-1含量顯著增加，4種MWCNTs誘導細胞對 THP-1的黏附力均顯著增強(P<0.05，P<0.01)，而作用24 h后，上述效應更加明顯，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在相同的作用時間下，不同化學修飾的MWCNTs對內皮細胞活化的影響差異無統(tǒng)計學意義。

After exposure to 6.25 μg/cm2 MWCNTs for 4 h,12 h or 24 h,time-dependent effects of S-MWCNTs and L-MWCNTs on the endothelial activation of b.End3 were determined (A,B).Similarly,time-dependent effects of L-MWCNT,L-MWCNT-COOH,L-MWCNT-NH2 and L-MWCNT-OH on the endothelial activation were also evaluated (C,D).sVCAM-1,soluble vascular adhesion molecule-1.*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.▲P<0.01 vs. S-MWCNT group.圖4 不同長度或化學修飾的MWCNTs誘導b.End3內皮細胞活化的時效關系Figure 4 Time-dependent effects of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs with different length or chemical modification

2.6 MWCNTs的長度和羧基修飾對b.End3細胞NLRP3蛋白表達的影響

由于羧基、羥基或氨基修飾對MWCNTs誘導內皮細胞活化未見明顯影響，因此,為進一步探討MWCNTs誘導內皮細胞活化在長度和修飾形式兩個方面產(chǎn)生效應差異的可能機制，選取了S-MWCNT、L-MWCNT、L-MWCNT-COOH 3種碳管，在 6.25 μg/cm2濃度下作用b.End3細胞不同時間后，比較長度和羧基修飾對細胞內NLRP3蛋白表達水平的影響(圖5)，3種MWCNTs作用后，細胞內NLRP3蛋白表達水平均表現(xiàn)為隨時間增加而增加的趨勢。作用24 h后，S-MWCNT誘導細胞NLRP3表達水平顯著增加(P<0.05)，而L-MWCNT和L-MWCNT-COOH處理組在作用4 h后觀察到細胞中NLRP3表達水平的顯著增加并持續(xù)至24 h(P<0.05，P<0.01)。作用4 h和12 h時，L-MWCNT處理組細胞NLRP3蛋白表達水平顯著高于S-MWCNT處理組(P<0.05)，而L-MWCNT與L-MWCNT-COOH兩組間效應差異無統(tǒng)計學意義。

Cells were treated with 6.25 μg/cm2 S-MWCNT,L-MWCNT or L-MWCNT-COOH for 4 h,12 h or 24 h,and the protein expression of NLRP3 were determined by western blot analysis.NLRP3,nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3;GADPH,glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.# P<0.05 vs. S-MWCNT group.圖5 MWCNTs的長度和羧基修飾對b.End3細胞NLRP3蛋白表達的影響Figure 5 Effects of length and carboxyl modification of MWCNTs on the expression of NLRP3 in b.End3 cells

3 討論

MWCNTs的生物學效應與其理化特性(包括長度、直徑、表面化學修飾等)有關[16-17]?，F(xiàn)有研究中，用于構建藥物載體的MWCNTs最長可達30 μm[18]，最短為 0.3 μm[19]；羧基修飾可以改善MWCNTs的分散性和親水性，可作為鉑類藥物載體用于乳腺癌治療[20]；羥基修飾的MWCNTs參與構建復合納米纖維可用于膠質瘤治療[21]；氨基修飾的MWCNTs具有穿過血腦屏障向腦部運輸藥物的可能[22]。本研究比較了長(10～30 μm)和短(0.5～2.0 μm)兩種MWCNTs，以及未修飾與羧基、氨基、羥基4種常用化學修飾的MWCNTs。細胞毒性檢測結果顯示，所有類型的MWCNTs在高劑量下均會對內皮細胞造成明顯的毒性損傷，而長度的縮短以及羧基、氨基或羥基修飾可以不同程度地減弱MWCNTs的細胞毒性。研究通過細胞毒性測定選取未對內皮細胞造成明顯毒性的低劑量(0～12.5 μg/cm2)進行后續(xù)實驗。

MWCNTs可誘導內皮細胞活化，主要表現(xiàn)為黏附分子的表達和分泌增加及對單核細胞的黏附力增強。Cao等[23]發(fā)現(xiàn)16～64 mg/L的MWCNTs作用于人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)24 h，可誘導VCAM-1表達增加，并導致HUVEC對單核細胞的黏附增強。本研究發(fā)現(xiàn)，在無明顯細胞毒性的劑量下(≥6.25 μg/cm2)，所有類型的MWCNTs均可誘導b.End3內皮細胞活化，表現(xiàn)為VCAM-1分泌增加，THP-1黏附增加，且觀察到了明顯的量效和時效關系。進一步比較發(fā)現(xiàn)，相同條件下，長度改變對MWCNTs誘導內皮細胞活化影響明顯，但相同長度下，化學修飾對MWCNTs誘導內皮細胞活化效應無明顯影響。既往的體外研究亦發(fā)現(xiàn)未修飾、羧基修飾和羥基修飾的MWCNTs均誘導HUVEC內皮細胞活化，但無明顯差異[24-25]，這提示在無明顯毒性劑量下，與化學修飾的改變相比，長度的改變對MWCNTs誘導內皮細胞活化的影響可能更明顯。

有研究表明NLRP3炎性小體的激活是MWCNTs誘導炎癥反應的重要機制[26-27]。體內外的多項研究證實NLRP3炎性小體激活參與調控內皮細胞活化[10-11]。然而，現(xiàn)有研究中缺乏MWCNTs激活內皮細胞中NLRP3炎性小體的相關證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，MWCNTs可以誘導b.End3細胞中NLRP3蛋白表達增加，在相同濃度下，長MWCNTs誘導NLRP3表達水平高于短MWCNTs，而未修飾和羧基修飾的MWCNTs之間無明顯差異，與MWCNTs誘導內皮細胞活化的結果趨勢高度一致。時效關系結果顯示，MWCNTs對細胞NLRP3表達的影響出現(xiàn)在誘導細胞內皮細胞活化之前，提示MWCNTs可能是通過激活NLRP3蛋白表達來誘導內皮細胞活化；與化學修飾的改變相比，長度的改變對MWCNTs誘導內皮效應的影響更明顯，提示長度可能是MWCNTs誘導NLRP3蛋白表達的重要因素。

綜上所述，本研究通過比較長度和化學修飾在MWCNTs誘導b.End3內皮細胞活化效應的影響，發(fā)現(xiàn)無明顯毒性劑量下，與化學修飾的改變相比，長度的改變對MWCNTs誘導內皮效應的影響更明顯。MWCNT通過誘導NLRP3蛋白表達水平升高參與內皮細胞活化,因此，MWCNTs對內皮細胞活化的影響可能與NLRP3炎性小體的激活有關。在生物及醫(yī)療領域應用中，與化學修飾相比，改變MWCNTs的長度也許對于改善其生物相容性更有意義，這有待進一步研究加以驗證。此外，鑒于在生物醫(yī)療領域相關的應用中，MWCNTs有可能直接接觸血管內皮細胞，其安全性評價中應關注對血管內皮的生物效應。