李石竹，方文宇，駱明飛，盧建國*

(1.中山大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，廣東 珠海 519082； 2.珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，廣東 珠海 519000)

脊椎動物的性腺發(fā)育與成熟主要受下丘腦-垂體性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG)為核心的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控[1]。促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)作為HPG軸重要的信號分子，在生殖活動中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。在哺乳動物中，GnRH由下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞合成，以脈沖式釋放，經(jīng)下丘腦-垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)垂體前葉，與促性腺釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)結(jié)合從而發(fā)揮作用[2]。大部分硬骨魚類缺乏門脈系統(tǒng)，下丘腦合成的GnRH通過軸突末梢作用于垂體，與垂體中GnRHR結(jié)合，誘導(dǎo)促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黃體生成激素(luteinizing hormone, LH)的合成和釋放。FSH和LH通過循環(huán)系統(tǒng)作用于性腺，調(diào)控類固醇激素的合成、配子發(fā)育和成熟[3]。此外，GnRH還可通過旁分泌或自分泌的方式，調(diào)整血液中局部促性腺激素的含量及固醇類性激素水平，從而調(diào)控動物的性行為[4]。

GnRHR隸屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族，其由7個α跨膜螺旋構(gòu)成，包括3個胞內(nèi)環(huán)和3個胞外環(huán)。通常G蛋白偶聯(lián)受體的胞內(nèi)C末端，對于受體的脫敏和內(nèi)化十分重要[5]。然而，GnRHR有包含和不包含胞內(nèi)C末端兩種蛋白變體。最早被鑒定的小鼠GnRHR蛋白缺乏一個典型的細(xì)胞內(nèi)C末端[6]。在其他哺乳動物及某些低等脊椎動物和軟骨魚類中，也相繼發(fā)現(xiàn)了缺少胞內(nèi)C末端的GnRHR蛋白[7-8]。近年來，在哺乳動物和非哺乳動物中，還發(fā)現(xiàn)了具有典型胞內(nèi)C末端的GnRHR蛋白。因此，依據(jù)是否存在細(xì)胞內(nèi)C末端結(jié)構(gòu)域，Roch等[7]將缺乏細(xì)胞內(nèi)C末端的GnRHR歸類為GnRHRⅠ，將具有C末端的GnRHR歸類為GnRHRⅡA和GnRHRⅡB；Williams等[8]又將GnRHRⅡA進(jìn)一步分為GnRHRⅡA-1、GnRHRⅡA-2和GnRHRⅡA-3。

硬骨魚中存在GnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅱ和GnRH-Ⅲ 3種GnRH旁系同源基因，其中，GnRH-Ⅱ存在于目前已經(jīng)分析的所有硬骨魚中[9]，GnRH-Ⅰ存在于大多數(shù)的硬骨魚中，其主要起刺激垂體合成和分泌促性腺激素的作用，而GnRH-Ⅱ和GnRH-Ⅲ主要起神經(jīng)遞質(zhì)的作用[3, 9]。在魚類生殖內(nèi)分泌活動中，GnRH與GnRHR的結(jié)合是GnRH發(fā)揮作用的重要基礎(chǔ)。因此，研究GnRHR的分子特征和表達(dá)模式對于理解GnRH-GnRHR信號通路的生理學(xué)功能具有重要意義。

黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes鲇形目Siluriformes鲿科Bagridae黃顙魚屬Pelteobagrus，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、無肌間刺，是中國重要的淡水養(yǎng)殖品種。黃顙魚精巢成熟比卵巢晚，雄性生長速率比雌性快，因而雄性個體偏大。在相同養(yǎng)殖條件下，第一年雄性黃顙魚比同齡雌魚的生長速度快30%左右，第二年雌雄生長差異甚至能接近3倍[10-11]。本實驗室前期工作構(gòu)建了黃顙魚高密度遺傳連鎖圖譜，鑒定出11個與性別相關(guān)的數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)，并從這些QTL附近的參考基因組區(qū)域鑒定出6個性別相關(guān)基因，其中包括黃顙魚GnRHR基因[12]，GnRHR可能參與黃顙魚性別分化和性腺發(fā)育。本研究中，克隆了黃顙魚GnRHR基因，分析其序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和組織表達(dá)模式，并利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建和篩選出黃顙魚GnRHR突變體，以期為深入研究GnRHR突變體在生殖發(fā)育過程中的作用提供材料，為進(jìn)一步了解黃顙魚生殖調(diào)控機制及探索黃顙魚人工繁殖技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用黃顙魚取自珠海市斗門長源苗場，選取健康無病的黃顙魚活體運回實驗室。經(jīng)過麻醉和放血后，取心、肝、脾、腎、端腦、中腦、小腦、下丘腦、垂體、精巢及卵巢等組織，在液氮中速凍后于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

用于人工繁殖的黃顙魚雌雄親本同樣取自珠海市斗門長源苗場，在繁殖季節(jié)，選取發(fā)育狀況良好的黃顙魚雌雄親本活體運回實驗室，于28 ℃水溫、自然光周期和持續(xù)充氧條件下暫養(yǎng)3 d，之后進(jìn)行催熟和人工授精。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 按照50～100 mg組織樣品與1 mL Trizol (Invitrogen)的比例，向各個樣品管中加入適量Trizol，用均質(zhì)破碎儀(托莫斯)勻漿40 s，其后按照操作手冊提取總RNA。總RNA的質(zhì)量和濃度通過15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析和紫外分光光度儀(島津)確定。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)操作手冊，以1 μg總RNA作為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 黃顙魚GnRHR基因克隆、序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將黃顙魚基因組中GnRHR片段在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索，發(fā)現(xiàn)與已提交的一個黃顙魚GnRHR基因序列(GenBank ID：113661459)一致性高達(dá)99%以上。因此，設(shè)計引物GnRHR-F1和GnRHR-R1，以腦和性腺混合cDNA文庫為模板，擴增黃顙魚GnRHRcDNA。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并回收目的產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，送廣州天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序。

將所得序列利用ORF Finder查找開放閱讀框，并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列。從GenBank中查詢出其他物種GnRHR的氨基酸序列，利用Blast進(jìn)行氨基酸同源性分析。利用MEGA6軟件采用最大相似性法(Maximum-likelihood method)，進(jìn)行1 000次自展重復(fù)，構(gòu)建基于GnRHR氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.3 基因的組織表達(dá) 采用RT-qPCR法檢測GnRHR在黃顙魚心、肝、脾、腎、端腦、中腦、小腦、下丘腦、垂體、精巢及卵巢組織中的表達(dá)情況。采用2ΔΔCT法計算GnRHR的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因，以GnRHR-F2和GnRHR-R2作為特異引物進(jìn)行RT-qPCR擴增(表1)。

表1 試驗用引物及其序列

1.2.4 黃顙魚人工繁殖 黃顙魚人工催熟和催產(chǎn)：雌魚注射促黃體生成素釋放激素類似物(LHRH-A2) 20 μg/kg；10～12 h后，雌魚注射LHRH-A2 15 μg/kg、地歐酮(DOM)10 mg/kg和人絨毛膜促性腺激素(HCG)800 U/kg，雄魚注射劑量為雌魚的1/3～1/2，催產(chǎn)水溫為28～29 ℃。黃顙魚人工授精：解剖雄魚取出精巢，用干凈的剪刀剪碎，加2 mL生理鹽水稀釋，收集到干凈的EP管中4 ℃下避光保存；輕輕擠壓雌魚腹部將魚卵收集到無水的玻璃培養(yǎng)皿中，加入50 μL精液，充分混勻，在裝有干凈飽氣水的玻璃皿中鋪開受精。5～10 min后，用水輕輕清洗去除廢液和雜質(zhì)。

1.2.5 黃顙魚GnRHR基因敲除突變體的構(gòu)建與篩選 根據(jù)黃顙魚GnRHR基因組序列，利用Cas9靶位點預(yù)測網(wǎng)站設(shè)計2個打靶位點(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)。對試驗所需的黃顙魚雌雄親本剪尾鰭，利用Tissue DNA Kit (Omega)提取基因組DNA，采用引物GnRHR-E2-F和GnRHR-E2-R PCR擴增靶位點附近序列，PCR產(chǎn)物送去測序，確認(rèn)靶點序列不存在單核苷酸多態(tài)性。設(shè)計并合成特異的gRNA引物(表1)，以pUC19-gRNA-scaffold質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物采用Gel Extraction Kit(Omega)回收純化。隨后采用Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo)體外轉(zhuǎn)錄gRNA。另外，pCS2-Cas9質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XbaⅠ線性化后回收并純化，隨后采用mMESSAGE mMACHINE T7 Kit(Invitrogen)體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA。

按照300、30、30 ng/μL的最終濃度混合Cas9 mRNA、GnRHR-gRNA1和GnRHR-gRNA2。將1 nL上述混合物注射到黃顙魚的1細(xì)胞期胚胎中，于28 ℃下培養(yǎng)，受精72 h后收集40尾小魚苗，提取基因組DNA。以上述基因組DNA為模板，用引物GnRHR-E2-F和GnRHR-E2-R進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物回收純化后克隆到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選40個陽性克隆送去測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃顙魚GnRHR基因的克隆及序列分析

將黃顙魚基因組中GnRHR片段在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源檢索，發(fā)現(xiàn)與已提交的一個黃顙魚GnRHR基因序列(GenBank ID：113661459)一致性高達(dá)99%以上。

從圖1可見，在腦和性腺混合cDNA文庫中擴增得到的GnRHR片段符合預(yù)期大小，經(jīng)克隆和測序證實與NBCI上提供的序列一致。本試驗中擴增到的黃顙魚GnRHRcDNA長為 2 894 bp，其中，包含5′非編碼區(qū)239 bp、開放閱讀框1 155 bp和3′非編碼區(qū)1 500 bp，編碼384個氨基酸。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，黃顙魚GnRHR含有典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain，TM)，表明其屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員(圖2)。

M—DL 10000 Maker; 1—GnRHR.

cDNA序列和氨基酸殘基的編號位于左側(cè)；終止密碼子用*標(biāo)出；7次跨膜結(jié)構(gòu)域用方框標(biāo)出。

將黃顙魚GnRHR與其他物種GnRHR的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析(表2)，結(jié)果表明：黃顙魚GnRHR與魚類GnRHR氨基酸序列的一致性較高(66%～96%)，其中，與斑點叉尾鮰GnRHR的一致性最高(96%)，與斑馬魚、鯉和銀鯽等鯉科魚類GnRHR的一致性超過80%；黃顙魚GnRHR與其他非魚類GnRHR的一致性較低(42%～55%)，其中與爪蟾GnRHR的一致性為55%，與雞GnRHR的一致性為48%，與人、小鼠、牛等哺乳類動物的GnRHR一致性低于45%。

表2 黃顙魚與其他物種GnRHR氨基酸序列的同源性比較

2.2 GnRHR氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過最大相似性法構(gòu)建脊椎動物GnRHR進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖3)，結(jié)果顯示，脊椎動物GnRHR形成3個分支，黃顙魚與斑點叉尾鮰、鯉、銀鯽、虹鱒等的GnRHR聚類到GnRHRⅡB分支，爪蟾、雞及魚類等其他一些GnRHR聚類到GnRHRⅡA分支，人、小鼠、牛等哺乳動物形成另一個獨立的GnRHRⅠ分支。這表明，黃顙魚GnRHR與斑點叉尾鮰GnRHR親緣關(guān)系最近，這與氨基酸同源性分析結(jié)果一致。從3種類型的GnRHR中各選3個物種進(jìn)行氨基酸序列比對,結(jié)果如圖4所示，Ⅰ型GnRHR明顯缺失了C末端，Ⅱ型GnRHR雖然都具有C端尾巴，但相比于GnRHRⅡA，GnRHRⅡB仍然缺失了兩小段氨基酸序列。因此，系統(tǒng)進(jìn)化樹和氨基酸序列比對結(jié)果均證明，克隆得到的黃顙魚GnRHR為ⅡB型GnRHR。

圖3 黃顙魚GnRHR氨基酸序列和其他物種同源氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 不同類型的GnRHR氨基酸序列比對

2.3 黃顙魚GnRHR基因的組織分布

利用RT-qPCR檢測黃顙魚GnRHRmRNA的組織分布(圖5)，結(jié)果表明：黃顙魚GnRHR基因主要在黃顙魚端腦、中腦、下丘腦、垂體和精巢等組織中高表達(dá)，其中，在下丘腦和垂體中的表達(dá)量最高，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腦和卵巢等組織中幾乎檢測不到；雌雄魚在垂體中的相對表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)，在性腺中的相對表達(dá)量有極顯著性差異(P<0.01)，在其他組織中無顯著性差異(P>0.05)。

*表示組間有顯著性差異(P<0.05)；**表示組間有極顯著性差異(P<0.01)。

2.4 黃顙魚GnRHR基因敲除突變體的構(gòu)建與篩選

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建黃顙魚GnRHR基因敲除突變體，結(jié)果表明，黃顙魚GnRHR基因全長9 797 bp，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，起始密碼子位于第二外顯子上。CRISPR/Cas9基因編輯靶位點的原則為：

1)靶位點包含20個堿基，其中，5′端應(yīng)為GG，這是由于本研究中所用的gRNA體外轉(zhuǎn)錄采用的是T7啟動子，T7啟動子要求轉(zhuǎn)錄起始位點的前兩位為GG，并且第三位最好為G或A；

2)緊鄰靶位點3′端的3個堿基構(gòu)成PAM區(qū)，要求序列為NGG(N為任意堿基)；

3)靶位點盡量選在基因CDS的前2/3區(qū)域且在ATG之后，但不要在最后一個外顯子上，最好能破壞重要的結(jié)構(gòu)域；

4)靶位點也可選在外顯子和內(nèi)含子交界處，以破壞基因的剪接。

基于以上原則，本試驗中選取黃顙魚GnRHR第二外顯子上的兩個靶點，設(shè)計gRNA。將2個位點的gRNA和Cas9 mRNA共注射至1細(xì)胞期胚胎，以提高編輯效率(圖6(a))。顯微注射后的胚胎存活率為62.25%(381/612)，而對照組的胚胎存活率為72.32%(473/654)，可能是因為試驗組中顯微注射的機械損傷對胚胎的存活有一定的影響。如圖6(b)、(d)所示，Sanger測序檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代胚胎產(chǎn)生了各種突變類型,包括1～56 bp的缺失突變和1～17 bp的插入突變,其中，大部分突變會導(dǎo)致開放閱讀框移碼和終止突變。圖6(c)、(f)顯示了野生型和F0代突變體代表性的測序峰圖。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，靶點1的基因編輯效率為25%，靶點2的基因編輯效率為27.5%，總的編輯效率為45.6%。至此，本試驗中成功構(gòu)建了黃顙魚F0代GnRHR基因敲除突變體，為后續(xù)的雜交篩選和基因功能研究提供了基礎(chǔ)資料。

圖6 CRISPR/Cas9構(gòu)建黃顙魚GnRHR突變體

3 討論

3.1 GnRHR在進(jìn)化上的保守與分歧

GnRHR主要位于促性腺激素細(xì)胞的細(xì)胞膜上，通過與來自下丘腦的十肽激素GnRH結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶-cAMP-蛋白激酶體系，促進(jìn)垂體前葉合成和釋放促性腺激素，從而調(diào)控性腺發(fā)育和生殖細(xì)胞的成熟[3]。自1992年從小鼠垂體細(xì)胞中克隆鑒定出首個GnRHR基因之后，研究人員陸續(xù)在包括哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類、魚類等多個物種中克隆到GnRHR基因的全長序列或部分序列[13-16]。本研究中,以中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類黃顙魚為研究材料，克隆了黃顙魚GnRHR基因序列，通過氨基酸序列分析，證明黃顙魚GnRHR與其他物種的GnRHR蛋白具有較高的保守性，均具有G蛋白偶聯(lián)受體特有的7次跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)。氨基酸同源性分析表明，黃顙魚GnRHR氨基酸序列與斑點叉尾鮰、斑馬魚、鯉、銀鯽的一致性較高，分別為96%、87%、83%和82%(表2)，表明黃顙魚GnRHR在進(jìn)化上比較保守。

在大多數(shù)脊椎動物中存在著3種GnRH，暗示其受體可能也以相似方式存在3種GnRHR。目前，通常將所有缺乏細(xì)胞內(nèi)尾巴的GnRHR歸類為GnRHRⅠ，而將具有典型胞內(nèi)C末端尾巴的GnRHR歸類為GnRHRⅡ[7-8]。在人中，僅保留了功能性的GnRHRⅠ，而GnRHRⅡ由于存在移碼突變可能導(dǎo)致功能缺失[17]。在人促性腺激素細(xì)胞、促甲狀腺激素細(xì)胞和促生長激素細(xì)胞中，均能檢測到GnRHRⅠ的表達(dá)[18]。在猴和豬中，GnRHRⅠ和GnRHRⅡ同時存在，其中，GnRHRⅠ主要參與調(diào)控垂體促性腺激素的合成和分泌，而GnRHRⅡ的作用還不清楚，也有可能如同在人中一樣功能缺失[19]。在一些非哺乳類脊椎動物中，如兩棲類、爬行類、鳥類和硬骨魚類中，GnRHRⅠ基因似乎已經(jīng)缺失，取而代之的是發(fā)現(xiàn)了多個GnRHRⅡ亞型[3]。在許多硬骨魚中已發(fā)現(xiàn)了多種類型的GnRHR，如青鳉Oryziaslatipes[20]、樸麗魚Haplochromisburtoni[21]、歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[22]、河豚[23]。本試驗中對黃顙魚與其他物種的GnRHR氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖3)，從結(jié)果可以看出，黃顙魚GnRHR與斑點叉尾鮰GnRHRⅡ、鯉GnRHRⅡ-like、銀鯽GnRHRⅡ-like、虹鱒GnRHR聚類到GnRHRⅡB分支,斑馬魚GnRHRⅠ、青鳉GnRHRⅡ、銀漢魚GnRHⅠB、羅非魚GnRHRⅡ及樸麗魚GnRHRⅠ也聚類到GnRHRⅡB這一分支；同時，斑馬魚GnRHRⅡ、青鳉GnRHRⅠ與GnRHRⅢ、銀漢魚GnRHRⅠ與ⅡA、樸麗魚GnRHRⅡ-like、雞GnRHRⅡ和爪蟾GnRHR聚類到GnRHRⅡA分支；而人、小鼠、牛、羊、狗等哺乳動物的GnRHR形成另一個獨立的分支。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，有些物種中的GnRHR可能需要重新命名，例如斑馬魚中的兩個GnRHR可能是按照發(fā)現(xiàn)時間先后順序來命名的，但根據(jù)進(jìn)化分析表明，斑馬魚GnRHR Ⅰ其實屬于GnRHRⅡB類型。另外，斑馬魚、銀漢魚和青鳉等魚類中存在多種GnRHR，聚類到不同的進(jìn)化分支，可能是源于硬骨魚中發(fā)生了額外的全基因組復(fù)制事件，且這些不同類型的GnRHR在隨后的進(jìn)化過程中有著不同的演化方向。在黃顙魚基因組和轉(zhuǎn)錄組中進(jìn)行檢索顯示：基因組中預(yù)測到的2個GnRHR序列，均對應(yīng)為本研究中所述的序列(僅有3個核苷酸的差異)；轉(zhuǎn)錄組中找到3個GnRHR片段，與本研究中所述的黃顙魚GnRHR序列一致性為99%～100%。因此，黃顙魚中只有一個GnRHR。序列比對和進(jìn)化分析結(jié)果表明，黃顙魚GnRHR應(yīng)為ⅡB型GnRHR。

3.2 GnRH、GnRHR的表達(dá)及其功能多樣性

GnRH基因的表達(dá)并不完全局限于HPG軸，在腦、胃、胰臟及交感神經(jīng)節(jié)等組織中也發(fā)現(xiàn)有GnRH存在[24-26]。GnRH可以通過旁分泌調(diào)節(jié)生物體的免疫能力[27], GnRH還能夠作為自分泌調(diào)節(jié)因子，在性腺中調(diào)控類固醇激素的合成和代謝[4]。這表明GnRH是一種多功能肽類，能夠廣泛參與神經(jīng)、內(nèi)分泌、生殖、消化及免疫系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)。GnRH通過形成GnRH-GnRHR復(fù)合物才能產(chǎn)生功能效應(yīng)，因此，推測GnRHR同樣在HPG軸以外的其他組織和器官中存在。研究表明，不同物種GnRHR基因的組織表達(dá)模式存在一定差異，如中華鱘AcipensersinensisGnRHR主要表達(dá)于性腺、腦和肌肉[28]，斑紋隱小鳉KryptolebiasmarmoratusGnRHR主要表達(dá)于腦、垂體、性腺、腸和肝臟[29]。這表明，GnRHR可能在不同物種中發(fā)揮不同功能。GnRHR的組織表達(dá)定位可能與相應(yīng)的GnRH分布密切相關(guān)，已有研究表明，GnRHⅠ主要在下丘腦表達(dá)，GnRHⅡ主要在中腦表達(dá)，GnRHⅢ主要在端腦表達(dá)，且GnRHⅠ主要作用是刺激垂體合成和分泌促性腺激素，而GnRHⅡ和GnRHⅢ主要作為神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用[30-32]。本研究表明，黃顙魚GnRHR主要表達(dá)于下丘腦、垂體、中腦和端腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，因此,GnRHR可能既參與促性腺激素的合成和分泌，同時也參與其他的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用。另外，黃顙魚GnRHR的表達(dá)呈現(xiàn)顯著的兩性異形，GnRHR在精巢中有表達(dá)，但在卵巢中幾乎檢測不到。類似的結(jié)果在歐洲鰻鱺中也有報道，歐洲鰻鱺GnRHRⅠB也是在精巢中表達(dá)，而在卵巢中基本不表達(dá)[22]。這種表達(dá)模式可能暗示著黃顙魚GnRHR對黃顙魚精巢發(fā)育起著重要作用。

3.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在黃顙魚及其他養(yǎng)殖魚類中的成功應(yīng)用

近年來，基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展使得在經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類中進(jìn)行基因功能性研究變得相對簡單。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前最常用的基因編輯技術(shù)之一，已在多種養(yǎng)殖魚類中成功應(yīng)用，如鱘、羅非魚、大西洋鮭、黃顙魚等[33-37]。Baloch等[33]在小體鱘Acipenserruthenus中通過CRISPR/Cas9敲除原始生殖細(xì)胞(PGC)遷移關(guān)鍵基因dnd1，成功獲得不育的小體鱘，可作為其他晚熟和大型鱘生殖細(xì)胞移植的不育受體。在羅非魚Oreochromismossambicus中，通過CRISPR/Cas9分別敲除性別相關(guān)基因gsdf和amhy來解析其基因功能[34-35]，發(fā)現(xiàn)gsdf可能是羅非魚dmrt1的下游基因，并通過抑制雌激素的分泌誘導(dǎo)精巢分化,而amhy敲除會導(dǎo)致羅非魚由雄向雌性反轉(zhuǎn)，因此，amhy可能是羅非魚的性別決定基因。人工養(yǎng)殖的大西洋鮭Salmosalar外逃到自然環(huán)境中，可能會導(dǎo)致基因滲入，影響野生群體的遺傳完整性。而培育出不育的大西洋鮭品系則可以解決這個問題，Wargelius等[36]利用CRISPR/Cas9敲除大西洋鮭dnd基因，成功獲得了不育的大西洋鮭，可以有效阻止人工養(yǎng)殖家系和野生品系間的基因流。黃顙魚是中國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一，具有明顯的雌雄生長二態(tài)性，在相同養(yǎng)殖環(huán)境下，雄魚生長顯著快于雌魚。因此，研究黃顙魚性別發(fā)育相關(guān)基因的功能不僅能對魚類性別發(fā)育分子機制提供新的見解，同時對黃顙魚基于性別控制的遺傳育種也具有重要的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價值。然而目前黃顙魚性別發(fā)育關(guān)鍵基因的功能研究還比較薄弱，Dan等[37]在黃顙魚中通過CRISPR/Cas9敲除Y染色體上的pdz1基因，導(dǎo)致XY型雄魚的精巢向卵巢分化，證明黃顙魚pdz1基因是一個雄性決定和分化的重要基因。本研究中，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建和篩選出了黃顙魚GnRHR基因敲除F0代突變體，基因敲除的胚胎存活率為62.25%，2個靶向位點附近的突變率為45.6%，產(chǎn)生了多種多樣的插入/缺失突變類型，由此可見，在黃顙魚中可進(jìn)行高效的基因編輯。基于此，作者在黃顙魚中，還對其他生殖發(fā)育相關(guān)的基因如vasa、dmrt1、amh和cyp11b等也進(jìn)行了基因編輯，獲得了許多F0突變體(成果尚未發(fā)表)。因黃顙魚性成熟周期為1年，雜合突變體和純合突變體的篩選工作仍在進(jìn)行，獲得這些基因的純合突變體也是研究這些基因的功能和作用機制必不可少的基礎(chǔ)之一。

4 結(jié)論

1)本研究中克隆出黃顙魚GnRHR基因，其cDNA長度為 2 894 bp，其中包含239 bp的5′非編碼區(qū)、1 155 bp的開放閱讀框和1 500 bp的3′非編碼區(qū)，編碼384個氨基酸。

2)系統(tǒng)進(jìn)化分析和氨基酸序列分析結(jié)果顯示，黃顙魚GnRHR的進(jìn)化類型為GnRHRⅡB型。

3)黃顙魚GnRHR基因在黃顙魚下丘腦和垂體中的表達(dá)量最高，在端腦、中腦和精巢等組織中表達(dá)量較高，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腦和卵巢等組織中幾乎不表達(dá)。

4)通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了黃顙魚GnRHR基因缺失F0代突變體，F(xiàn)0代基因編輯效率為45.6%。