冉鳳霞，金文杰，端智卓瑪，黃屾，劉艷慧，李梓瑄，王振吉，吳明輝，簡(jiǎn)生龍，王國(guó)杰，李長(zhǎng)忠*

(1.青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，青海 西寧 810012)

重金屬因其潛在毒性、難降解及富集等危害，已成為重要的環(huán)境污染源。研究表明，通過重金屬的瞬時(shí)超標(biāo)或者長(zhǎng)期微量積累常常對(duì)魚類產(chǎn)生脅迫，影響早期生長(zhǎng)發(fā)育，如增加胚胎發(fā)育時(shí)間、降低胚胎孵化率、增加畸形率等[1-4]，并引起魚體組織細(xì)胞(如肝細(xì)胞、鰓和性腺等)超微結(jié)構(gòu)的損傷[5-7]。重金屬污染物對(duì)魚類脅迫造成的危害因重金屬離子種類、脅迫濃度、脅迫時(shí)間和魚種等因素變化而不同。水體中重金屬離子濃度超過一定閾值時(shí)，其毒理效應(yīng)會(huì)表現(xiàn)出來，并造成水生動(dòng)物受傷、死亡[8]。鋅是生命活動(dòng)所必需的微量元素之一，具有催化和調(diào)節(jié)功能，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，也是糾正免疫應(yīng)答功能的關(guān)鍵元素[9]。當(dāng)Zn2+缺乏時(shí)，會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化性降低，細(xì)胞免疫反應(yīng)受損[10]。但是，當(dāng)Zn2+濃度超過一定濃度時(shí)，也會(huì)抑制水生生物的生理功能。Zn2+對(duì)魚類的毒害作用與其和魚類體內(nèi)生物大分子上的活性位點(diǎn)結(jié)合有關(guān)，表現(xiàn)為魚卵的孵化、發(fā)育和繁殖過程受阻，甚至死亡[9]。在Zn2+脅迫下，魚體會(huì)產(chǎn)生一種非特異性免疫機(jī)制以應(yīng)對(duì)Zn2+引起的免疫和氧化損傷。

多種環(huán)境污染物可誘導(dǎo)水生生物產(chǎn)生氧化應(yīng)激進(jìn)而產(chǎn)生活性氧(ROS)，同時(shí)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞損傷等一系列生理生化反應(yīng)，因此，氧化應(yīng)激和抗氧化酶活性水平常作為評(píng)價(jià)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)[11]。核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)屬于CNC亮氨酸拉鏈家族(Cap‘n’Collar basic leucine zipper, CNC-b ZIP)成員，是細(xì)胞內(nèi)緩解氧化損傷和抵抗外來毒性化合物的重要核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)參與機(jī)體內(nèi)抗氧化和抗炎應(yīng)激反應(yīng)、重金屬解毒等生理過程[12-13]。Nrf2可通過調(diào)控一系列抗氧化蛋白因子的組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)，減輕活性氧和親電體引起的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，維持機(jī)體氧化還原動(dòng)態(tài)平衡[11,14]。但金屬暴露會(huì)影響Nrf2介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路，包括Keap1中巰基的還原、MAPK活性的激活、Nrf2的磷酸化等[15]。機(jī)體在受到脅迫應(yīng)激時(shí)，Nrf2基因被激活并轉(zhuǎn)運(yùn)入核，調(diào)控包括超氧化物氣化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等下游抗氧化靶基因的轉(zhuǎn)錄，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[12]。Nrf2 mRNA表達(dá)的上調(diào)主要是由核易位造成的，核易位由氧化信號(hào)誘導(dǎo)，重金屬脅迫促使氧化信號(hào)增多，導(dǎo)致核易位細(xì)胞數(shù)量增多[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化基因CAT、GPx、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD等表達(dá)水平顯著增加[13-14]，以及抗氧化酶SOD和CAT等酶活性顯著升高，而這些基因表達(dá)水平的上調(diào)與Nrf2/Keap1信號(hào)通路有關(guān)，因?yàn)镹rf2與Keap1的解離是Nrf2核易位的主要機(jī)制[14]。因此，研究魚類對(duì)重金屬脅迫的分子應(yīng)答機(jī)制，有助于篩選出評(píng)估水體污染狀況[18]的分子標(biāo)記物，掌握魚類生存狀況，提供水體污染預(yù)警，為魚類保護(hù)和資源恢復(fù)提供對(duì)策。

花斑裸鯉Gymnocypriseckloni俗稱大嘴魚，隸屬于裂腹魚亞科Schizothoracinae裸鯉屬Gymnocypris[19]，分布于黃河上游段、扎陵湖、鄂陵湖等淡水水域，是黃河上游水域中生物多樣性的重要組成部分，具有重要的生態(tài)保護(hù)價(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值。近年來，由于大型水利工程的建設(shè)、人為的偷捕亂撈和水環(huán)境的局部污染，花斑裸鯉資源量大幅度減少[20]。目前，國(guó)家通過實(shí)施花斑裸鯉等土著魚類“三場(chǎng)”(即產(chǎn)卵場(chǎng)、索餌場(chǎng)、越冬場(chǎng))的生態(tài)修復(fù)工程，建立了花斑裸鯉人工增殖放流站，嚴(yán)格執(zhí)行漁政執(zhí)法，使得人為因素對(duì)土著魚類造成的危害得到有效緩解，而水域環(huán)境污染物尤其是重金屬污染對(duì)土著魚類的影響日益受到關(guān)注。近年來，雖然黃河上游青海段水質(zhì)符合國(guó)家漁業(yè)二類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，但局部水域因采礦、雨水沖蝕、生活污水和地表徑流等污染會(huì)引起瞬時(shí)的重金屬離子濃度超標(biāo)或某些重金屬離子的長(zhǎng)期微量污染風(fēng)險(xiǎn)依然存在，尤其是繁殖季節(jié)產(chǎn)卵場(chǎng)的重金屬污染直接威脅著花斑裸鯉等土著魚類的生存。野生花斑裸鯉的孵化、發(fā)育和繁殖是其資源保護(hù)和恢復(fù)的關(guān)鍵，因此，本研究中選擇對(duì)野生花斑裸鯉繁育活動(dòng)影響最直接的Zn2+作為重金屬脅迫源，通過分析Zn2+脅迫下花斑裸鯉特定組織抗氧化關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶的應(yīng)答模式，篩選產(chǎn)生脅迫應(yīng)答的生物標(biāo)記物，從而更加直接地反映所在水體的Zn2+污染狀況，以期為花斑裸鯉的資源保護(hù)與恢復(fù)，以及作為水質(zhì)監(jiān)測(cè)預(yù)警指標(biāo)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用花斑裸鯉由青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站提供，取體格健康的花斑裸鯉，體長(zhǎng)為(15±3)cm，體質(zhì)量為(10±3)g，于青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院水生實(shí)驗(yàn)室水族箱內(nèi)暫養(yǎng)適應(yīng)兩周，期間每天10:00投喂一次。試驗(yàn)用水為曝氣一周的自來水，溶解氧為6.8～7.8 mg/L，pH為6.8～7.5，溫度為(18±2)℃。試驗(yàn)前用高錳酸鉀(1～200 mg/L)對(duì)試驗(yàn)水族箱進(jìn)行消毒處理。

1.2 方法

1.2.1 急生毒性試驗(yàn) ZnSO4·7H2O購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(St Louis, MO, USA)。采用靜態(tài)水質(zhì)接觸法[6]進(jìn)行金屬脅迫試驗(yàn)。Zn2+脅迫濃度以中國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(Zn2+質(zhì)量濃度為0.1 mg/L)為基準(zhǔn)，分別將質(zhì)量濃度擴(kuò)大10、20、50、100、200倍，即1、2、5、10、20 mg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置一個(gè)平行組，每組投放15尾健康的花斑裸鯉。試驗(yàn)期間觀察并記錄Zn2+脅迫24、48、72、96 h時(shí)魚的死亡數(shù)，并觀察魚體的活動(dòng)狀況，以魚靜臥魚缸底部，不見鰓蓋有呼吸運(yùn)動(dòng)，多次觸碰無反應(yīng)來判斷魚死亡現(xiàn)象。及時(shí)撈出死亡個(gè)體，記錄死亡數(shù)量。采用改進(jìn)寇氏法公式[21]計(jì)算出各脅迫時(shí)間下的半致死濃度(LD50,mg/L)，安全濃度為96 h LD50×0.1。

1.2.2 LD50濃度的計(jì)算 根據(jù)所記錄的魚死亡數(shù)，計(jì)算出死亡率(P)。改進(jìn)寇氏法計(jì)算公式為

LD50=lg-1[xmax-i(∑P-0.5)]。

其中：xmax為lg(最大劑量)；i為lgd2-lgd1，d2、d1為相鄰兩組劑量；P為各脅迫組花斑裸鯉的死亡率(用小數(shù)表示)；∑P為各組P的總和。

lg LD50的標(biāo)準(zhǔn)誤(s50)計(jì)算公式為

s50=i×[(∑P- ∑P2)/(n-1)]1/2，

LD50的95%可信限=lg-1(x50±1.96s50),

LD50的平均可信限=LD50±(LD50高限-LD50低限)/2。

其中：n為每組中魚的數(shù)量；x50=lg LD50。

1.2.3 樣品的采集 根據(jù)本試驗(yàn)中獲得的Zn2+脅迫不同時(shí)間段的半致死濃度，并以中國(guó)地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第Ⅲ類(GB/T 14848—93)為標(biāo)準(zhǔn)，將Zn2+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L作為本試驗(yàn)脅迫濃度。在1.0 mg/L Zn2+脅迫12、24、48、72、96 h時(shí)，采集不同脅迫時(shí)間下的鰓、腎臟和肝臟組織，用液氮速凍后保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 總RNA提取 用RNA提取試劑盒(TaKaRa, Japan)提取總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的完整性和質(zhì)量。

1.2.5 熒光定量PCR 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)，以β-actin為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR儀(Light Cycler 96 SW1.1，羅氏)測(cè)定Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx的mRNA表達(dá)量變化。PCR擴(kuò)增總體系(共25 μL)：iQTMSYBR Green Supermix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，60 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行。運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR檢測(cè)的基因及引物序列

1.2.6 基因的應(yīng)答層次分析 試驗(yàn)材料與方法同“1.2.3”節(jié)和“1.2.5”節(jié)。基因的應(yīng)答層次以熱圖方式呈現(xiàn)。將各基因在鰓、腎臟和肝臟組織中的mRNA表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2均一化處理，然后將所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用HemI 1.0.3.7軟件進(jìn)行分析作圖?；虮磉_(dá)的強(qiáng)弱采用不同顏色表示，可直觀地分析出同一基因mRNA表達(dá)量的變化趨勢(shì)和不同基因mRNA表達(dá)的先后層次。

1.2.7 抗氧化酶活性分析 用電動(dòng)勻漿器分別對(duì)已得到的花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織進(jìn)行勻漿。按照南京建成生物工程公司試劑盒說明書進(jìn)行操作，并用吸光度法測(cè)定SOD、CAT和GPx酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基因的mRNA表達(dá)量及抗氧化酶活力數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用 SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用SNK法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn2+對(duì)花斑裸鯉的急性毒性影響

從表2可見：不同Zn2+濃度脅迫24、48、72、96 h時(shí)，花斑裸鯉表現(xiàn)出不同的死亡率，其中，1 mg/L Zn2+脅迫96 h內(nèi)，花斑裸鯉未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；2 mg/L Zn2+脅迫48 h內(nèi)，花斑裸鯉未出現(xiàn)死亡，脅迫72 h時(shí)出現(xiàn)7%的死亡率；5 mg/L Zn2+脅迫24 h時(shí)，出現(xiàn)26.7%的死亡率，脅迫48 h死亡率為46.6%，脅迫96 h時(shí)累積死亡率達(dá)到93.3%；10、20 mg/L Zn2+脅迫24 h時(shí)，花斑裸鯉全部死亡。

表2 不同Zn2+質(zhì)量濃度下花斑裸鯉的死亡率

Zn2+對(duì)花斑裸鯉脅迫24、48、72、96 h時(shí)的LD50、LD50的95%可信限、LD50的平均可信限和安全濃度見表3，其中,LD50隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì)，24 h LD50最高，為5.0 mg/L，96 h LD50最低，為2.0 mg/L，其安全濃度為0.2 mg/L。

表3 Zn2+對(duì)花斑裸鯉24、48、72、96 h的LD50及安全濃度

2.2 Zn2+脅迫下抗氧化關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化

從圖1、圖2可見：在1.0 mg/L Zn2+脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵基因Nrf2、SOD、CAT和GPx的mRNA表達(dá)量均有增加，但關(guān)鍵基因表達(dá)量上調(diào)的幅度各異，表達(dá)量的變化趨勢(shì)也不完全相同；Zn2+脅迫12 h時(shí)，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表達(dá)量在鰓中上調(diào)幅度最大，分別為對(duì)照組的4.05倍和3.46倍，而它們?cè)谀I臟中的上調(diào)幅度不大；Zn2+脅迫12 h時(shí)，Nrf2表達(dá)量在肝臟中上調(diào)幅度最大，為對(duì)照組的15.11倍，而在鰓和腎臟中的上調(diào)幅度不大；Zn2+脅迫48 h時(shí)，GeCAT和GeGPx表達(dá)量在鰓中上調(diào)幅度最大，分別為對(duì)照組的7.96倍和6.56倍，而它們?cè)谀I臟和肝臟中的上調(diào)幅度不大。

標(biāo)有不同大寫字母者表示同一組織不同時(shí)期間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有不同小寫字母者表示同一時(shí)期不同組織間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。

圖2 Zn2+脅迫對(duì)花斑裸鯉CAT和GPx基因表達(dá)的影響

在鰓中，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的表達(dá)量在脅迫12 h時(shí)即達(dá)到最高值，而GPx在脅迫48 h時(shí)才達(dá)到最高值；在腎臟中，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT表達(dá)量在脅迫96 h時(shí)達(dá)到最高值，而GPx在脅迫24 h時(shí)即達(dá)到最高值；在肝臟中，Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT表達(dá)量在脅迫96 h時(shí)達(dá)到最高值，而Nrf2、GPx表達(dá)量分別在12、48 h即達(dá)到最高值(圖1、圖2)。

2.3 Zn2+脅迫下各基因的應(yīng)答層次分析

從圖3可見，在1.0 mg/L Zn2+脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中各基因表現(xiàn)出不同的應(yīng)答水平，并表現(xiàn)出組織特異性，即5種基因在3種組織中的表達(dá)量達(dá)到最高值所需要的時(shí)間各異，在3種組織中的表達(dá)量明顯上調(diào)的關(guān)鍵基因的種類各異。

圖3 Zn2+脅迫下花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟中Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx的mRNA表達(dá)量熱圖

從熱圖(圖3)分析可知：在Zn2+脅迫96 h內(nèi)，花斑裸鯉鰓組織中除了Nrf2基因總體表達(dá)水平上調(diào)不明顯外，其他4個(gè)基因均有明顯上調(diào)；在腎臟中，Nrf2總體表達(dá)水平低于其他4個(gè)基因，但是5個(gè)基因的變化幅度均不大；在肝臟中，Nrf2的總體表達(dá)量低于其他4個(gè)基因，但Nrf2和Cu/Zn-SOD、Mn-SOD基因的上調(diào)幅度最大。

這表明，與3種組織中Nrf2的4個(gè)下游基因表達(dá)量相比，Nrf2表達(dá)量相對(duì)較低，尤其在腎臟和肝臟組織中表現(xiàn)更為明顯，但在鰓組織中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Nrf2表達(dá)量不僅未上調(diào)反而出現(xiàn)下調(diào)。Cu/Zn-SOD的表達(dá)量在3種組織中上調(diào)幅度最為明顯，CAT和GPx的表達(dá)量在肝臟中上調(diào)的幅度最為明顯。

2.4 Zn2+脅迫對(duì)花斑裸鯉組織抗氧化酶活性的影響

從圖4可見,未經(jīng)Zn2+脅迫的花斑裸鯉，SOD、CAT和GPx酶活性分別在鰓、肝臟和腎臟中最高，經(jīng)Zn2+脅迫后3種酶在相應(yīng)組織的最大值分別為對(duì)照組的1.19倍、1.90倍和1.27倍。

在Zn2+脅迫96 h之內(nèi)，隨著Zn2+脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中SOD、CAT和GPx的酶活性均有升高，但升高幅度各異，酶活性變化趨勢(shì)也不完全相同；Zn2+脅迫后，SOD酶活性上調(diào)的幅度在腎臟中脅迫72 h最大，為對(duì)照組的2.2倍，而在鰓和肝臟中SOD酶活性達(dá)最大值的時(shí)間分別為12、24 h，分別為對(duì)照組的1.19倍和1.6倍；CAT酶活性上調(diào)幅度在鰓中脅迫96 h時(shí)最大，為對(duì)照組的2.76倍，而在肝臟和腎臟中CAT酶活性達(dá)最大值的時(shí)間分別為24、48 h，分別為對(duì)照組的2.46倍和1.99倍；GPx酶活性上調(diào)幅度在鰓中脅迫48 h時(shí)最大，為對(duì)照組的20.93倍，而在腎臟和肝臟中GPx酶活性達(dá)最大值的時(shí)間分別為24、12 h，分別為對(duì)照組的2.08倍和1.26倍(圖4)。

圖4 Zn2+脅迫對(duì)花斑裸鯉組織中抗氧化酶活性的影響

3 討論

3.1 Zn2+對(duì)花斑裸鯉的急性毒性特征

研究表明，Zn2+對(duì)體質(zhì)量為(5.97±0.84)g的黃姑魚幼魚Nibeaalbiflora脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為0.752 3、0.661 6、0.561 8、0.495 9 mg/L[22]；Zn2+對(duì)七帶石斑魚Inephelusseptemfasciatus初孵仔魚脅迫24、48、72 h的半致死濃度分別為2.493、1.814、1.561 8、1.12 mg/L[23]； Zn2+對(duì)體質(zhì)量為(13.10±0.30)g的錦鯉Cryprinuscarpiod脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為140、118、104、93 mg/L[24]。本試驗(yàn)條件下，隨著水體中Zn2+濃度的增加，花斑裸鯉的死亡率不斷增加，Zn2+對(duì)體質(zhì)量為(10±3)g的花斑裸鯉幼魚脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L，由此可見，本試驗(yàn)中得到的各時(shí)段下的Zn2+半致死濃度與其他魚種存在差異，可能與魚類的種類、個(gè)體大小及對(duì)水環(huán)境中Zn2+的脅迫抵抗能力有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，花斑裸鯉對(duì)Zn2+脅迫表現(xiàn)出一定的耐受性，但是其耐受能力與錦鯉相差較大。

3.2 Zn2+脅迫后抗氧化關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化及應(yīng)答層次

肝臟、鰓和腎臟是重金屬污染魚類的主要目標(biāo)器官[25]。細(xì)胞內(nèi)金屬離子水平的調(diào)控機(jī)制主要包括金屬的吸收(鰓)、儲(chǔ)存和解毒(肝臟和腎臟)[26]。本研究中，花斑裸鯉被Zn2+脅迫96 h內(nèi)，在鰓、腎和肝臟組織中抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵基因Nrf2、SOD、CAT和GPx的mRNA表達(dá)量均有增加，但關(guān)鍵基因表達(dá)量上調(diào)的幅度各異，這與Kim等[26]對(duì)暗紋東方鲀Takifuguobscurus和Cho等[27]對(duì)條石鯛Oplegnathusfasciatus受到重金屬Cd脅迫，Moniruzzaman等[28]對(duì)卷須鯪Cirrhinuscirrhosus受到重金屬Zn和Pb脅迫，以及斑馬魚Daniorerio[13]等魚種暴露在重金屬中的研究結(jié)果是一致的。本研究顯示，Zn2+脅迫后Nrf2表達(dá)量在肝臟中的上調(diào)幅度最大是對(duì)照組的15.11倍，而Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx上調(diào)幅度均在鰓中最大，這表明，各基因表達(dá)對(duì)Zn2+脅迫具有組織特異性，不同組織通過不同基因的表達(dá)產(chǎn)生不同的抗氧化應(yīng)激應(yīng)答，從而發(fā)揮不同的解毒功能。

本研究顯示，Zn2+脅迫下花斑裸鯉5種基因在3種組織中的表達(dá)量達(dá)到最高值所需要時(shí)間各異，在鰓和肝臟組織中Zn2+脅迫后，除了GPx外，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT表達(dá)量均在脅迫12 h時(shí)達(dá)到最高值，而在腎臟中除了GPx外，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT在脅迫后達(dá)到最高值的時(shí)間均為96 h。這表明，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其下游靶基因在鰓和肝臟中最先應(yīng)答，而在腎臟中最晚應(yīng)答，這表明鰓和肝臟是最重要的抗重金屬離子脅迫的器官，這與Kim等[26]對(duì)暗紋東方鲀受到重金屬Cd影響的結(jié)果一致，表明肝臟具有非常強(qiáng)的抗氧化防御系統(tǒng)，對(duì)魚類起著關(guān)鍵的重金屬解毒作用。

整體而言，花斑裸鯉Cu/Zn-SOD的mRNA應(yīng)答水平最快且最強(qiáng)，CAT和GPx的mRNA水平上調(diào)比較緩慢，體現(xiàn)出SOD的歧化作用產(chǎn)生了過量的H2O2，從而促進(jìn)CAT和GPx的mRNA水平顯著升高，這與Giuliani等[29]對(duì)南極銀魚Pleuragrammaantarctica中的研究結(jié)果相似。

花斑裸鯉在Zn2+脅迫96 h之內(nèi)，一方面3個(gè)組織中Nrf2的表達(dá)量低于4個(gè)下游基因的表達(dá)量(圖3)，另一方面在受到Zn2+脅迫后，花斑裸鯉Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加的趨勢(shì)與其他抗氧化因子CAT、GPx和兩個(gè)SOD的轉(zhuǎn)錄水平增加的趨勢(shì)基本一致。這一結(jié)果與對(duì)草魚Ctenopharyngodonidellus[17]受到饑餓脅迫時(shí)的研究結(jié)果相似，證實(shí)了該轉(zhuǎn)錄因子作為抗氧化劑激活因子在魚類應(yīng)對(duì)應(yīng)激時(shí)的重要作用，此外，還體現(xiàn)出Nrf2在調(diào)節(jié)魚類抗氧化防御系統(tǒng)激活中的作用來自轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯間的功能應(yīng)答[29]。在金屬離子脅迫下核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的微量上調(diào)，通過細(xì)胞信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)放大作用而使得下游靶基因明顯上調(diào)，同時(shí)通過不同基因在不同組織中的不同程度的信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子脅迫的整體應(yīng)答。

本研究條件下，Zn2+脅迫后，花斑裸鯉的鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化系統(tǒng)關(guān)鍵基因表達(dá)量均有增加，但在各組織中表達(dá)量上調(diào)的幅度、上調(diào)達(dá)到最大量所需的時(shí)間，以及在3種組織中表現(xiàn)出明顯上調(diào)的基因種類都不盡相同，展示了關(guān)鍵基因應(yīng)答的時(shí)間相關(guān)性和組織特異性。這表明，重金屬會(huì)誘導(dǎo)刺激花斑裸鯉抗氧化防御系統(tǒng)的激活，使得相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，從而在分子層面揭示了魚類對(duì)重金屬的解毒機(jī)制。

研究者通常通過在不同水域設(shè)置監(jiān)測(cè)斷面，以檢測(cè)出的水體重金屬離子濃度來反映水質(zhì)質(zhì)量。但部分水域由于各種原因引起的某些重金屬離子濃度的瞬時(shí)升高，以及重金屬離子在水體的富集，對(duì)魚類的健康尤其是繁殖方面的影響常常被忽略。而通過檢測(cè)魚體對(duì)重金屬離子脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的關(guān)鍵基因的表達(dá)量，可更加直接地反映水體質(zhì)量。

3.3 Zn2+脅迫對(duì)抗氧化關(guān)鍵酶活性的影響

重金屬誘導(dǎo)下相關(guān)酶活性水平的變化，可進(jìn)一步反映重金屬脅迫下機(jī)體不同組織的應(yīng)答能力。研究顯示，斑馬魚在重金屬Zn、Cd、Pb暴露下，SOD酶活性水平顯著增加[30]。在對(duì)鯉Cyprinuscarpio[11]進(jìn)行Zn、Cd、Pb脅迫處理96 h后，在肝臟和腎臟中的抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性水平顯著升高。本研究中，花斑裸鯉受到Zn2+脅迫時(shí)，SOD、CAT、GPx 3種酶的活性在3種不同組織中均有不同程度的升高，酶活性達(dá)到的最高值、達(dá)到最高值的時(shí)間、酶的種類均各不相同。由此可見，在Zn2+脅迫下花斑裸鯉不同組織首先引起核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的上調(diào)導(dǎo)致相應(yīng)的下游靶基因表達(dá)量升高，酶活性也相應(yīng)升高，即通過從基因mRNA水平上調(diào)到酶活性提升，從而實(shí)現(xiàn)整體應(yīng)答。以上研究表明，魚類面對(duì)重金屬危害會(huì)激活抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致抗氧化基因表達(dá)量和酶活性的升高，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激帶來的損傷。

4 結(jié)論

1)不同濃度、不同時(shí)間的Zn2+脅迫對(duì)花斑裸鯉幼魚的毒性作用是明顯的。以1、2、5、10、20 mg/L為Zn2+脅迫濃度, 得到Zn2+對(duì)體質(zhì)量為(10±3)g 花斑裸鯉幼魚脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L，安全濃度為0.2 mg/L。

2)重金屬會(huì)誘導(dǎo)刺激花斑裸鯉抗氧化防御系統(tǒng)的激活，使得相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，從而在分子層面揭示了魚類對(duì)重金屬的解毒機(jī)制。Zn2+脅迫下花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及抗氧化酶基因SOD、CAT和GPx的轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高，且Zn2+使得抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性升高。

3)抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其下游靶基因表達(dá)和酶活性的增加，展示了不同的脅迫應(yīng)答機(jī)制，表現(xiàn)為應(yīng)答層次上的組織特異性。這提示，可以通過檢測(cè)Zn2+脅迫的抗氧化關(guān)鍵基因及其酶活性來提前預(yù)警水體環(huán)境質(zhì)量。