趙 樂(lè)，趙鵬昊，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是食品發(fā)酵技術(shù)中使用最為廣泛的乳桿菌之一，已被證實(shí)有能力在人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物的腸道中定植[1]，并具有良好的代謝和耐酸能力[2]。植物乳桿菌具有調(diào)節(jié)人體免疫[3]、抵制胃腸道致病菌感染的功效[4]，同時(shí)其對(duì)腸上皮細(xì)胞具有較好的黏附能力，在強(qiáng)酸和高濃度膽鹽下仍具有較高存活率[5]，且其代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素等無(wú)毒副作用和耐藥性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[6]。細(xì)菌素是由核糖體合成并分泌至胞外介質(zhì)的具備生物活性的多肽，當(dāng)其達(dá)到一定濃度時(shí)可抑制親緣關(guān)系相近的致病菌或腐敗菌的生長(zhǎng)[7]，它們對(duì)熱穩(wěn)定且易被蛋白酶水解，因此細(xì)菌素作為生物防腐劑廣泛應(yīng)用于各種發(fā)酵食品[8]。

植物乳桿菌可以在食品基質(zhì)中的熱、冷、酸、鹽等應(yīng)激條件下存活，這表明它對(duì)于復(fù)雜惡劣環(huán)境已經(jīng)形成了耐受性和抗性機(jī)制。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物乳桿菌在環(huán)境脅迫下的應(yīng)激機(jī)制主要從分子機(jī)制和蛋白質(zhì)組學(xué)角度進(jìn)行研究，盡管一些應(yīng)激基因已經(jīng)在這個(gè)物種中被鑒定出來(lái)[9]，但是對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍然知之甚少。有研究表明環(huán)境脅迫可以正向調(diào)控細(xì)菌素的合成，Leroy 等[10]研究了不同環(huán)境脅迫對(duì)Enterococcus faeciumRZSC5 產(chǎn)生細(xì)菌素的調(diào)控作用，研究發(fā)現(xiàn)中等鹽濃度能夠促進(jìn)細(xì)菌素的分泌。Hurtado 等[11]研究了Lactobacillus pentosusB96 在鹽脅迫下細(xì)菌素編碼基因表達(dá)的變化，研究表明4%和6%濃度的鹽脅迫可以促進(jìn)細(xì)菌素的生物合成，plnE和plnN基因的表達(dá)受脅迫影響顯著上調(diào)，但其并未深入研究鹽脅迫如何調(diào)控細(xì)菌素的合成。乳酸菌細(xì)菌素雖然具備無(wú)毒、高效抑菌等優(yōu)點(diǎn)，但產(chǎn)量較低，在工業(yè)化批量生產(chǎn)中大大受限。

目前利用基因工程技術(shù)提高細(xì)菌素產(chǎn)量雖理論上可行，但普遍存在細(xì)菌素活性較低及安全問(wèn)題。而環(huán)境脅迫對(duì)細(xì)菌素的調(diào)控是基于轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)，并不涉及安全性問(wèn)題。由于環(huán)境脅迫調(diào)控細(xì)菌素合成的機(jī)制較為復(fù)雜，調(diào)控因子及調(diào)控通路尚不明確，通過(guò)施加環(huán)境壓力提升菌體細(xì)菌素合成量的方法依然難以投入到實(shí)際應(yīng)用中。因此完善關(guān)于環(huán)境脅迫對(duì)細(xì)菌素合成的分子調(diào)控機(jī)制的研究，對(duì)促進(jìn)生物保護(hù)發(fā)酵劑的發(fā)展有著重要意義。

1 植物乳桿菌細(xì)菌素合成的分子調(diào)控機(jī)制

1.1 Al-2 介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是指細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境刺激，分泌自誘導(dǎo)物或自誘導(dǎo)多肽作為信號(hào)分子，當(dāng)其濃度達(dá)到一定閾值時(shí)會(huì)啟動(dòng)菌體某些功能性基因的表達(dá)進(jìn)而影響菌體生命活動(dòng)，如調(diào)控細(xì)菌素的合成及分泌[12]。Saucier 等[13]在Carnobacterium piscicolaLV17 中首次發(fā)現(xiàn)乳酸菌存在群體感應(yīng)現(xiàn)象。少數(shù)Ⅰ類(lèi)和多數(shù)Ⅱ類(lèi)細(xì)菌素的生物合成受QS 系統(tǒng)調(diào)控。調(diào)節(jié)Ⅱ類(lèi)細(xì)菌素產(chǎn)生的QS 系統(tǒng)由自誘導(dǎo)肽（auto-inducing peptide，AIP）、監(jiān)測(cè)環(huán)境的膜定位組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HPK）以及細(xì)胞質(zhì)感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（response regulator，RR）等3 種調(diào)控蛋白組成，被稱(chēng)為三組分系統(tǒng)，其中HPK和RR 也被稱(chēng)為雙組份系統(tǒng)（two component system，TCS）[14]。Al-2 以具備生物活性的信號(hào)分子身份參與QS 信息交流進(jìn)程，從分子結(jié)構(gòu)層面來(lái)看，Al-2 是一種呋喃酰硼酸二酯類(lèi)化合物[15]。它由luxS基因編碼的關(guān)鍵酶催化S-核糖高半胱氨酸（SRH）生成，其中SRH 是通過(guò)pfs基因編碼合成酶催化S-腺苷高半胱氨酸（SAH）而形成的。植物乳桿菌與其他誘導(dǎo)菌共培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌素也會(huì)被誘導(dǎo)進(jìn)而殺死或抑制其它微生物。Di 等[16]研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后L.plantarumDC400 細(xì)菌素的合成量顯著上升，luxS基因表達(dá)量也較純培養(yǎng)顯著提升，由此推斷l(xiāng)uxS介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)間接調(diào)控植物乳桿菌細(xì)菌素的合成。Man等[17]研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumKLDS1.0391 與瑞士乳桿菌KLDS1.9207 共培養(yǎng)時(shí)，編碼細(xì)菌素的pln基因簇相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)。與此同時(shí)，Ruiz-Barba等[18]研究發(fā)現(xiàn)，L.plantarumNC8 與戊糖片球菌FBB63 等革蘭氏陽(yáng)性菌共培養(yǎng)時(shí)，L.plantarumNC8 細(xì)菌素調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄效率有所上升。綜上表明，細(xì)菌素產(chǎn)量的提高可能是微生物的存在刺激生產(chǎn)者生長(zhǎng)的結(jié)果，也可能是自誘導(dǎo)物Al-2 產(chǎn)量增加的結(jié)果。

1.2 植物乳桿菌pln 基因簇

植物乳桿菌細(xì)菌素調(diào)控系統(tǒng)除上述提到的Al-2 介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)以外，還受基因組中pln基因簇的調(diào)控。Saenz 等[19]證實(shí)了L.plantarumC11、WCFS1、J51、YM-4-3 中均含有5 個(gè)誘導(dǎo)操縱子：分別是plnABCD、plnJKLR、plnEFI、plnGHSTUVW、plnMNOP。各誘導(dǎo)操縱子的具體功能如下：負(fù)責(zé)編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)并可啟動(dòng)其他操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)操縱子plnABCD，其中plnA編碼自誘導(dǎo)肽（AIP），plnB編碼可跨膜的組氨酸激酶（HPK），plnC和plnD編碼兩種功能相反的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子[20]，plnC編碼的蛋白激活基因簇轉(zhuǎn)錄，plnD編碼的蛋白則起抑制作用；編碼細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因的plnJKLR和plnEFI，其中PlnI 及PlnL 為abi基因編碼免疫蛋白；編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)并參與細(xì)菌素分泌運(yùn)輸?shù)倪\(yùn)輸操縱子plnGHSTUVW；plnMNOP等功能還未可知。Diep等[21]認(rèn)為plnEFI和plnJKLR操縱子編碼雙肽細(xì)菌素、PlnEF 和PlnJK 及其相應(yīng)的免疫蛋白。plnGHSTUVWXY操縱子編碼ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，該系統(tǒng)負(fù)責(zé)分泌并處理細(xì)菌素前體。2003 年，Diep 等[22]進(jìn)一步驗(yàn)證了PlnA 肽誘導(dǎo)上述五個(gè)操縱子的轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，自身也是一種抑菌物質(zhì)。Maldonado-Barragan 等[23]通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了L.plantarumWCFS1 中的plnABCD以及L.plantarumNC8 中的plnNC8IF-HK-D對(duì)細(xì)菌素的合成至關(guān)重要。Tai 等[24]對(duì)L.plantarumWCFS1、C11、V90、J23、J51、NC8、JDM1、UL4 的pln基因簇進(jìn)行了總結(jié)（圖1）。

2 植物乳桿菌抵御脅迫的反應(yīng)機(jī)制

2.1 植物乳桿菌面臨的環(huán)境脅迫

利用植物乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的特性提高食品安全性是食品防腐保鮮的一種手段，但無(wú)論是在加工運(yùn)輸中還是攝入體內(nèi)發(fā)揮其益生效應(yīng)均會(huì)面臨諸多脅迫（圖2）。在菌體生長(zhǎng)、存儲(chǔ)保藏、經(jīng)過(guò)人體腸胃道等過(guò)程中，菌體自身會(huì)受酸、冷凍、高溫、鹽、饑餓等脅迫作用而損傷甚至死亡。例如人體胃腸道的低pH 環(huán)境或食品加工基質(zhì)中遇到的酸脅迫，會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)質(zhì)子積累同時(shí)降低跨膜推動(dòng)力，進(jìn)而降低對(duì)酸敏感的酶活性，也會(huì)損害蛋白質(zhì)和DNA 等生物大分子；作為發(fā)酵劑在加工貯存中遇到的低溫環(huán)境不僅會(huì)減弱細(xì)胞膜流動(dòng)性，還會(huì)影響基因表達(dá)使菌體產(chǎn)生冷休克反應(yīng)，相反，環(huán)境溫度過(guò)高又會(huì)致使蛋白降解；細(xì)菌代謝過(guò)程產(chǎn)生的活性氧（ROS）、超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）以及過(guò)氧化自由基（O·）等物質(zhì)會(huì)使菌體細(xì)胞受損[25]；細(xì)菌繁殖過(guò)程中，若營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得不到及時(shí)補(bǔ)充，便會(huì)引發(fā)營(yíng)養(yǎng)脅迫現(xiàn)象，導(dǎo)致代謝能力大大降低，如細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物合成量降低。

圖2 植物乳桿菌面臨的環(huán)境脅迫Fig.2 Environmental stress encountered by Lactobacillus Plantarum

2.2 植物乳桿菌抵御鹽脅迫的調(diào)控機(jī)制

植物乳桿菌抵御鹽脅迫通常依靠相容性溶質(zhì)調(diào)控系統(tǒng)、胞內(nèi)離子平衡、熱休克蛋白調(diào)控系統(tǒng)及其他途徑關(guān)鍵酶調(diào)控系統(tǒng)。在高滲透壓條件下，植物乳桿菌主要通過(guò)從細(xì)胞外部吸收甘氨酸甜菜堿（glycine betaine，GB）等相容性溶質(zhì)來(lái)抵御鹽脅迫[26]。其中L.plantarum主要采取QacT 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)相似相容類(lèi)物質(zhì)[27]，有研究指出L.plantarumATCC14917 依靠QacT 系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)甜菜堿、肉堿和脯氨酸[28]，而L.plantarumWCFS1 擁有兩個(gè)相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，即ChoQS、OpuABCD[29]。植物乳桿菌還可以利用質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞內(nèi)Na+外排，進(jìn)而維持胞內(nèi)離子平衡[30]。此外，有研究報(bào)道指出L.plantarumST-III 中存在編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因[31]。近期還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，L.plantarumSTIII 的質(zhì)粒上包含一個(gè)由kdpABCDE操縱子編碼的K+轉(zhuǎn)運(yùn)基因簇[32]。另一方面，當(dāng)菌體外部滲透壓升高時(shí)，編碼普遍應(yīng)激蛋白（GSPs）、熱激蛋白（HSPs）和鹽脅迫蛋白（SSPs）的基因表達(dá)量會(huì)顯著上升。HSPs 作為分子伴侶蛋白通常包括DnaK、GroEL、DnaJ 和GroES，在蛋白折疊修復(fù)和降解中起到關(guān)鍵作用[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)蛋白FtsH 和細(xì)胞看家蛋白HtrA 在鹽脅迫下表達(dá)上調(diào)。糖酵解途徑是植物乳桿菌生成乳酸的重要途徑，有學(xué)者指出糖酵解關(guān)鍵酶基因pfk、fba、pgk、ldh的表達(dá)也會(huì)隨 著NaCl 濃度的升高而上調(diào)。鹽脅迫也可以誘導(dǎo)腺苷酸琥珀酸合酶PurA 的合成，有研究發(fā)現(xiàn)參與嘌呤代謝的PurH 蛋白在5 mol/L NaCl 脅迫下表達(dá)上調(diào)。這些關(guān)鍵酶數(shù)量的增加可以使核苷酸積累用于DNA、RNA 和ATP 的合成，維持菌體正常生長(zhǎng)代謝。

2.3 植物乳桿菌抵御酸脅迫的調(diào)控機(jī)制

植物乳桿菌可以通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)pH 動(dòng)態(tài)平衡、改變細(xì)胞膜生理功能以及分泌抗脅迫應(yīng)激蛋白等方式來(lái)應(yīng)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)有機(jī)酸帶來(lái)的酸脅迫。胞內(nèi)pH 的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于L.plantarum抵御酸脅迫至關(guān)重要，乳酸菌能夠通過(guò)H+-ATPase、谷氨酸脫氫酶體系，精氨酸脫羧酶途徑等機(jī)制維持胞內(nèi)pH 的動(dòng)態(tài)平衡（圖3）[34]。當(dāng)胞內(nèi)pH 處于菌體能耐受的范圍外時(shí)，F(xiàn)0F1-ATPase 聚合體會(huì)消耗胞內(nèi)ATP，將胞內(nèi)水解產(chǎn)物H+泵出至胞外，以維持胞內(nèi)pH 的穩(wěn)定。此外，菌體的精氨酸脫氨酶體系可以通過(guò)催化精氨酸產(chǎn)生NH3，隨后胞內(nèi)H+與產(chǎn)物NH3結(jié)合，從而使pH 升高至正常范圍，此過(guò)程產(chǎn)生的ATP 有助于F0F1-ATPase泵出質(zhì)子。細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分在抵御酸脅迫的過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用，如調(diào)整膜脂肪酸中的長(zhǎng)鏈脂肪酸和單不飽和脂肪酸的比例。有研究嘗試闡明植物乳桿菌的耐酸機(jī)制，Liu 等[35]認(rèn)為植物乳桿菌SA-680 包含一個(gè)耐酸基因mdt，其序列與多種植物乳桿菌膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼區(qū)序列很接近，猜測(cè)基因mdt可能與質(zhì)子流動(dòng)有關(guān)。

圖3 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的耐酸機(jī)制[34]Fig.3 Acid resistance mechanism of gram-positive bacteria[34]

2.4 植物乳桿菌抵御冷熱脅迫的調(diào)控機(jī)制

植物乳桿菌作為冷凍發(fā)酵劑在儲(chǔ)存過(guò)程中、干酪成熟階段及冷藏產(chǎn)品的低溫發(fā)酵階段會(huì)引發(fā)大量的冷誘導(dǎo)蛋白（Cold Induced Proteins，CIP）表達(dá)。Derzelle 等[36]從受到冷脅迫的植物乳桿菌Lp80 和C3.8 中分別克隆出cspL和cspP兩種冷休克蛋白基因。此外，工業(yè)生產(chǎn)中噴霧干燥、巴斯德滅菌等高溫過(guò)程帶來(lái)的熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致DnaK、DnaJ、HrcA、GroES、GroEL、Hsp84、Hsp85、Hsp100、C1p、HtrA 和FtsH 等熱休克蛋白和蛋白酶表達(dá)上調(diào)。Castaldo 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，L.plantarumLM3-2 含有以cis 啟動(dòng)的CIRCE 序列為特征的DnaK 和GroESL熱激操縱子。劉倩穎[38]通過(guò)KEGG 通路富集結(jié)果分析出L.plantarumLIP-1 在冷脅迫下嘌呤代謝通路最顯著，冷應(yīng)激蛋白CspC 的表達(dá)顯著上調(diào)。

2.5 植物乳桿菌抵御氧脅迫的調(diào)控機(jī)制

植物乳桿菌的呼吸代謝產(chǎn)物活性氧（ROS），包括超氧陰離子自由基（O2-），過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH-）等，這類(lèi)物質(zhì)會(huì)打破胞內(nèi)的氧化還原平衡進(jìn)而促使ROS 濃度升高進(jìn)而造成氧脅迫。乳酸菌抵御氧脅迫多依賴(lài)于SOD、CAT 和GSH-PX 等ROS解毒酶類(lèi)。Eric 等[39]發(fā)現(xiàn)在L.plantarum中，兩個(gè)谷胱甘肽還原酶同源物可以有效降低由膽鹽脅迫引起的氧化損傷。與此同時(shí)，過(guò)氧化物響應(yīng)調(diào)控因子PerR、氧氣響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子FNR 以及Rex 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在抵抗氧化脅迫和生物膜形成方面也有重要調(diào)控作用。另一方面，F(xiàn)lpA 和FlpB 通過(guò)上調(diào)Zn2+的攝取來(lái)增加菌體對(duì)胞內(nèi)巰基蛋白的保護(hù)從而提高菌體氧化脅迫抗性。此外，有研究為闡明L.plantarumCAUH2 的抗氧化脅迫機(jī)制，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子GopR 具有抗氧化功能。

3 環(huán)境脅迫對(duì)植物乳桿菌細(xì)菌素合成量的影響

不同植物乳桿菌菌株由于自身的差異性，面對(duì)不同脅迫時(shí)其細(xì)菌素的合成能力存在較大差異。食品基質(zhì)中的低溫、低pH 和高NaCl 等脅迫因素會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)和細(xì)菌素的合成。Engelhardt 等[40]研究結(jié)果指出L.plantarumESB202 與P.acidilacticiHA6111-2 在7.5% NaCl 濃度下分別培養(yǎng)，二者細(xì)菌素抑菌活性均被顯著抑制。而Lim 等[41]研究發(fā)現(xiàn)適宜的NaCl 濃度（1%或3%）使L.plantarumKC21細(xì)菌素的合成量翻倍，抑菌活性升至12800 BU/mL，當(dāng)NaCl 濃度大于5%時(shí)會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)和細(xì)菌素的合成。Leal-Sanchez 等[42]同樣發(fā)現(xiàn)低濃度的NaCl 脅迫（2.3%～2.5%）也會(huì)促進(jìn)L.plantarumLPCO10 細(xì)菌素的合成。此外，Vazquez 等[43]發(fā)現(xiàn)外源添加1.5 g/L 的半胱氨酸或色氨酸對(duì)Nisin 的合成有促進(jìn)作用。Yi 等[44]以Glu、Gly、Cys、Tyr和Ala 為研究對(duì)象，其結(jié)果表明只有Cys 和Gly 對(duì)細(xì)菌素的合成有誘導(dǎo)作用，其余氨基酸作用不顯著。但上述氨基酸是通過(guò)影響菌體生長(zhǎng)進(jìn)而影響細(xì)菌素的產(chǎn)量，還是作為前體物質(zhì)直接參與細(xì)菌素的合成或是作為中間調(diào)控因子還有待深入研究。另一方面，Parlindungan 等[45]發(fā)現(xiàn)L.plantarumB21受到營(yíng)養(yǎng)脅迫如葡萄糖脅迫時(shí)，生長(zhǎng)速度明顯降低，且不產(chǎn)生酸，但細(xì)菌素的活性仍能被檢測(cè)。與此相反，受吐溫80 的脅迫時(shí)，盡管生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酸量大，但細(xì)菌素活性不明顯。上述結(jié)果都僅為表觀(guān)研究，沒(méi)有針對(duì)內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行深入探討。

4 環(huán)境脅迫調(diào)控細(xì)菌素合成的分子機(jī)制

4.1 細(xì)胞分泌途徑中重要調(diào)控基因及蛋白

生物體面對(duì)壓力變化時(shí)通常會(huì)誘導(dǎo)大量基因表達(dá)并合成應(yīng)激蛋白質(zhì)，進(jìn)而適應(yīng)不良環(huán)境。也有報(bào)道指出，菌體面臨環(huán)境脅迫會(huì)激活多種代謝途徑[46]。細(xì)菌素作為一種分泌蛋白，在其運(yùn)輸分泌過(guò)程中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為一種載體起主要作用。同時(shí)，由于細(xì)菌素自身結(jié)構(gòu)及底物信號(hào)序列的不同，其分泌轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可分為NisT 型、SunT 型、Sec 型、SRP 型途徑以及其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑[47]（圖4）。其中Sec 型分泌途徑是細(xì)菌蛋白分泌到胞外的常見(jiàn)方式之一，有研究報(bào)道指出，SecY、SecE 和SecG 三種調(diào)控蛋白共同構(gòu)成細(xì)菌蛋白異位復(fù)合體，形成蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通道，該分泌途徑中SecA 蛋白是分泌蛋白跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白。此外，有研究表明，當(dāng)菌體面臨氧化應(yīng)激時(shí)，分泌調(diào)控蛋白SecA 的C 末端特異性結(jié)合一種胞質(zhì)蛋白MrgA，據(jù)報(bào)道該蛋白與氧化應(yīng)激有關(guān)[48]。除此之外，SRP 型蛋白分泌途徑也較為常見(jiàn)，大多數(shù)膜蛋白和分泌蛋白在其靶向定位過(guò)程中都會(huì)受信號(hào)識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）的嚴(yán)格調(diào)控。目前針對(duì)乳酸菌SRP 途徑的研究主要集中在信號(hào)識(shí)別顆粒Ffh、受體FtsY 的結(jié)構(gòu)與功能。Froderberg 等[49]研究發(fā)現(xiàn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)酶YidC 在細(xì)菌素分泌過(guò)程及Sec 易位過(guò)程中均起重要作用，信號(hào)識(shí)別顆粒Ffh 可與細(xì)菌素形成復(fù)合體，再與受體FtsY 結(jié)合并定位于細(xì)胞膜。另一方面，Neumann 等[50]認(rèn)為信號(hào)識(shí)別顆粒SRP 和分泌調(diào)控蛋白SecA 在分泌蛋白跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起協(xié)同作用，二者可協(xié)助細(xì)菌蛋白的分泌。還有研究報(bào)道，當(dāng)菌體面臨鹽脅迫時(shí)，busR基因編碼的調(diào)控子會(huì)刺激BusA 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)菌素的分泌[51]。綜上所述，脅迫下細(xì)菌分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)使得蛋白共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)速率提升，分泌蛋白的數(shù)量增加，由此推測(cè)脅迫通過(guò)影響細(xì)胞膜分泌系統(tǒng)進(jìn)而影響細(xì)菌素的合成。

圖4 細(xì)菌蛋白質(zhì)分泌途徑[52]Fig.4 Secretion pathway of bacterial protein[52]

4.2 氨基酸代謝途徑中重要調(diào)控基因及蛋白

天冬氨酸及谷氨酸代謝途徑是合成纈氨酸、組氨酸、脯氨酸、賴(lài)氨酸以及色氨酸等多種氨基酸的有效途徑，這些氨基酸可以進(jìn)一步被生物體利用合成細(xì)菌素等相關(guān)蛋白。宋雪飛等[53]的研究結(jié)果顯示基因asnA、hisA、hisC、metE在15 g/L 濃度的NaCl脅迫下表達(dá)均顯著下調(diào)，其中asnA、hisA、metE分別是參與天冬氨酸代謝、組氨酸代謝和半胱氨酸代謝的關(guān)鍵基因。同時(shí)，有研究報(bào)道指出，鹽脅迫下L.plantarumWCFS1 中除了參與絲氨酸代謝途徑的基因表達(dá)下調(diào)，編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)也顯著下調(diào)。細(xì)菌素本質(zhì)也是一種多肽，其合成過(guò)程受上述氨基酸代謝的影響，這也在一定程度上解釋了脅迫下細(xì)菌素合成量發(fā)生變化的原因。

另一方面，由argG和argH基因編碼的ArgG和ArgH 蛋白在天冬氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸過(guò)程中起到關(guān)鍵的催化作用，張明陽(yáng)[54]發(fā)現(xiàn)酸脅迫環(huán)境下過(guò)量表達(dá)上述兩種蛋白會(huì)提高氨基酸代謝基因如精氨酸代謝基因arcA、arcB和argR的轉(zhuǎn)錄效率。其中arcA、arcB、argR、argG和argH等基因編碼的蛋白能夠使精氨酸分解并產(chǎn)生氨和ATP，由此推測(cè)上述基因可間接為細(xì)菌素的合成提供原料及能量，利于菌體抵抗酸脅迫[55]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)隨著外界滲透壓升高，編碼氨基肽酶PepX 的基因pepX表達(dá)顯著上調(diào)，該基因是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，推斷其與細(xì)菌素的水解及轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

4.3 脂肪酸代謝途徑中重要調(diào)控基因及蛋白

乳酸菌面臨環(huán)境脅迫時(shí)，脂肪酸代謝途徑中的?；d體蛋白聚合物FabZ2、FabG2、FabH 作為主導(dǎo)酶發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用，菌體生長(zhǎng)速率加快，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌素合成量顯著升高。相反，Heunis 等[56]發(fā)現(xiàn)酸脅迫條件下L.plantarum423 胞內(nèi)FabD 蛋白質(zhì)的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，推斷由于脂肪酸生物合成量減少進(jìn)而抑制菌體自身生長(zhǎng)，最終細(xì)菌素合成量隨菌體生長(zhǎng)能力減弱而降低。此外，還有研究表明基因accA、accB、accC、fabD及fabZ也參與脂肪酸生物合成途徑，其中基因accA、accB及accC負(fù)責(zé)編碼乙酰輔酶A 羧化酶，基因fabD負(fù)責(zé)編碼丙二酰輔酶A[57]。王茜茜等[58]基于iTRAQ 技術(shù)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜合成相關(guān)基因fabG和fabZ表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)支鏈脂肪酸的合成從而提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，進(jìn)而利于細(xì)菌素的翻譯和分泌。

4.4 核苷酸代謝途徑中重要調(diào)控基因及蛋白

嘌呤核苷酸不僅作為DNA 與RNA 分子合成的主要底物，同時(shí)也參與ATP 和GTP 等物質(zhì)的合成代謝，為細(xì)菌素合成及運(yùn)輸供給能量。嘌呤代謝通路的上游基因purL調(diào)控肌苷一磷酸（IMP）與焦磷酸硫胺素（TPP）的生物合成，二者對(duì)于細(xì)菌素及毒力因子的合成有一定影響。此外，基因sat及編碼RNA 聚合酶的基因rpoB過(guò)表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)ATP 產(chǎn)量增多，為機(jī)體的生長(zhǎng)代謝提供了更多的能量，有助于細(xì)菌素的合成與分泌。有學(xué)者基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下L.plantarumWCFS1 中編碼嘌呤合成的基因purD、編碼腺嘌呤琥珀酸合酶的基因purA、編碼腺嘌呤脫氫酶的基因adeC、編碼單磷酸鳥(niǎo)苷還原酶的基因guaC的表達(dá)均顯著下調(diào)，直接導(dǎo)致嘌呤代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性減弱，間接導(dǎo)致細(xì)菌素產(chǎn)量下降[59]。Sun 等[60]的研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，差異蛋白結(jié)果顯示酸脅迫條件下菌體中基因adk與基因purA的表達(dá)也有所下調(diào)。此外，Pang 等[61]研究表明，胞內(nèi)次黃嘌呤的濃度會(huì)隨著基因purA轉(zhuǎn)錄水平的降低而增加，最終導(dǎo)致RNA 和DNA 合成量升高。由于細(xì)菌素作為一種分泌肽，RNA 和DNA 又作為其合成模板，因此推斷出當(dāng)菌體受脅迫時(shí)GuaC、PurH、PurA 和PurB 等蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)菌素有重要調(diào)控作用。綜上所述，脅迫可以通過(guò)影響核苷酸代謝途徑中能量的生成進(jìn)而影響細(xì)菌素的合成。

4.5 其他重要調(diào)控基因及蛋白

核糖體蛋白、DNA 修復(fù)蛋白、分子伴侶以及熱休克蛋白作為全局調(diào)控蛋白，在乳酸菌脅迫響應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。其中，分子伴侶蛋白如GroEL、GrpE、DnaK、DnaJ、Hsp、CspC 等的主要作用是協(xié)助蛋白進(jìn)行組裝折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，脅迫條件下這類(lèi)蛋白質(zhì)還能增加代謝相關(guān)蛋白如細(xì)菌素的穩(wěn)定性[62]。1990 年，Vanbogelen 等[63]發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白不僅具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的功能，還能感受外界環(huán)境如熱、冷、酸、滲透壓等的變化并參與細(xì)菌素的翻譯。2013 年，陳衛(wèi)等[64]發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳酸菌受酸、膽鹽等環(huán)境脅迫時(shí)，熱休克蛋白、冷休克蛋白和通用應(yīng)激蛋白等通常被誘導(dǎo)表達(dá)。還有研究顯示，大腸桿菌應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力所采用的修復(fù)系統(tǒng)由全局轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子RecA和轉(zhuǎn)錄抑制因子LexA 控制，自然狀態(tài)下LexA 蛋白結(jié)合在大腸桿菌素結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子處，因此顯著抑制細(xì)菌素合成[65]。然而當(dāng)菌體受到紫外線(xiàn)等脅迫誘導(dǎo)后，RecA 受到激活，促進(jìn)阻遏蛋白LexA 自身發(fā)生裂解，解除對(duì)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因的抑制作用，最終導(dǎo)致細(xì)菌素合成量增大。

5 總結(jié)與展望

由于調(diào)控細(xì)菌素合成基因的多樣性及其調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，目前關(guān)于環(huán)境脅迫下植物乳桿菌細(xì)菌素合成機(jī)制的研究相對(duì)缺乏，仍有諸多問(wèn)題有待解決，筆者認(rèn)為主要集中在以下幾個(gè)方面：第一，環(huán)境脅迫介導(dǎo)哪些基因的轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的表達(dá)參與細(xì)菌素的合成；第二，是否存在相關(guān)調(diào)控蛋白與植物乳桿菌細(xì)菌素啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域有結(jié)合作用；第三，目前還沒(méi)有找到通用的代謝通路用于解釋環(huán)境脅迫下植物乳桿菌的應(yīng)激機(jī)制；第四，應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫時(shí)，群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)的基因如luxS基因的轉(zhuǎn)錄水平、信號(hào)分子AI-2 的活性及LuxS 蛋白的穩(wěn)定性如何變化還未可知。但隨著深入研究，利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多組學(xué)技術(shù)挖掘植物乳桿菌中重要功能基因，從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平和代謝水平多層面研究不同脅迫下細(xì)菌素合成系統(tǒng)的表達(dá)差異是未來(lái)的研究方向。利用脅迫應(yīng)答等外源壓力提高植物乳桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的方法必將成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，進(jìn)而更好的發(fā)揮生物保護(hù)發(fā)酵劑的生防作用。