梁運(yùn)特，廖志遠(yuǎn)，賴斯華，張 琴，湯 勇，孫平良

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

潰瘍性結(jié)腸炎以反復(fù)腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)，多伴腹痛及不同程度的全身癥狀，具有病程漫長(zhǎng)、易反復(fù)發(fā)作以及治愈難度大等特點(diǎn)。近年來(lái)的研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎多與遺傳因素、免疫異常[1]、腸道微生態(tài)紊亂[2-3]有關(guān)。本課題組前期研究表明，安腸湯能夠調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群，降低腸道乙酸及血清內(nèi)毒素含量，維持大鼠腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的愈合[4-5]。其治療機(jī)制是否與miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信號(hào)軸相關(guān)，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血漿中miRNA-146a表達(dá)量及結(jié)腸組織中miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信號(hào)軸中關(guān)鍵蛋白IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)量，旨在闡明安腸湯基于miRNA-146a/IRAK-1/NF-κB信號(hào)軸修復(fù)受損腸黏膜治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠60只，雄雌各半，體重180～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(湘)2014-0011。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào):SYXK(桂)2010-0001；實(shí)驗(yàn)室溫度20～23 ℃，濕度50%～60%。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2013(KF)-E-003]。

1.2主要藥物 安腸湯藥物組成:補(bǔ)骨脂25 g、黃芪20 g、潞黨參15 g、干姜10 g、炒白術(shù)10 g、白頭翁15 g、茯苓15 g、檳榔15 g、黑順片15 g、炒雞內(nèi)金10 g、薏苡仁10 g、廣木香10 g、地榆15 g、赤芍15 g、延胡索10 g、炙甘草10 g。藥材全部購(gòu)自廣東康美藥業(yè)股份有限公司，按以上用量取藥材洗凈、自來(lái)水浸泡30 min，先煎黑順片30 min，再加入其他藥物，再繼續(xù)煎煮30 min，每劑藥水煎3次，濃縮后4 ℃保留備用。麗珠腸樂由珠海麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字S10960040，實(shí)驗(yàn)全程使用同一批次藥品)。本次實(shí)驗(yàn)用藥處方及用量全部經(jīng)過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部審核。

1.3主要試劑及耗材 水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào):2013101801，250 g/瓶)；5%的2，4，6-三硝基苯磺酸液(南寧市托普邦生物科技有限公司，商品編號(hào):P2297-10ML，10 mL/瓶)；甲醛(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào):20130817，500 mL/瓶)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(品牌：Takara，型號(hào)：RR047A)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(品牌：Takara，型號(hào)：RR036A)；TriQuick Reagent(品牌：索萊寶，型號(hào)：R1100)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(品牌：Takara，型號(hào)：RR082A)；TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(品牌：全式金，型號(hào)：AU311)；0.2 mL熒光定量PCR透明八排管八連管蓋(品牌：ABI，型號(hào)：4323032)。高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(品牌：Solarbio，型號(hào)：R0010)；蛋白酶抑制劑混合液(100xPIC)(品牌：Solarbio，型號(hào)：P6730)。

1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器 組織勻漿機(jī)(品牌：IKA，T18型)；恒溫金屬浴鍋(上海一恒，TU-100C)；普通離心機(jī)(上海盧湘儀，TD4)；Haier醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器，DW-86L728J)；超微量核酸檢測(cè)儀(遂真，F(xiàn)C-1100)；Ariamx Real-Time PCR(Agilent Technologies，G8830-64001)；VeritiTM96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems?，4375786)；低溫離心機(jī)(eppendorf，5418R)；制冰機(jī)(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室，SIM- F140AY65)；單道移液器(德國(guó)Eppendorf 公司，10/20/100/200/1 000 μL)；一次性使用真空采血管(江西精致科技有限公司，抗凝管EDTA-K2)；Thermo FisherUHPLC 3000液相色譜(美國(guó)賽默飛，Ulti Mate 3000) ；超聲清洗機(jī)(鄭州園田清潔設(shè)備有限公司)。電泳儀(Bio-Rad，PowerPac Basic)；蛋白轉(zhuǎn)印模塊(濕轉(zhuǎn))(Bio-Rad，Mini Trans-Blot Cell)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)選取SD大鼠15只作為空白組，其余45只大鼠參照文獻(xiàn)[6-7]方法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型：在禁食不禁飲24 h后，用水合氯醛(濃度：10%，按大鼠體重0.3 mL/100 g計(jì)算用量)進(jìn)行腹腔注射麻醉，將灌腸管緩慢深入距大鼠肛門約7 cm，注入2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(按大鼠體重90 mg/kg計(jì)算用量)造模，待藥液完全進(jìn)入腸道后，將大鼠提尾倒立1 min，保證藥液充分停留在結(jié)腸內(nèi)?？瞻捉M大鼠注入等體積的生理鹽水，操作完畢待大鼠清醒后自由飲食，自由進(jìn)水。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、麗珠腸樂組、安腸湯組，每組15只。麗珠腸樂組大鼠灌胃麗珠腸樂混懸液[0.5億活菌/(mL·只)]，安腸湯組灌胃安腸湯5 mL/(kg·d)(按臨床等效量的6倍)，空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水3 mL/只，均連續(xù)灌胃14 d。

1.6標(biāo)本采集與處理 灌胃14 d后，水合氯醛麻醉各組大鼠，立即剖腹取腹主動(dòng)脈血5～7 mL，室溫靜置30 min，然后3 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min，分離血清，并于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。取距離肛門約8 cm處結(jié)腸病變最明顯的組織，以等滲生理鹽水沖洗表面黏附的血液、糞便、分泌物等，清除干凈后，切取病變明顯結(jié)腸組織，其中一部分凍存于-80 ℃冰箱，另一部分固定于4%多聚甲醛中。

1.7觀察指標(biāo)及方法

1.7.1病理組織學(xué)觀察 選取結(jié)腸組織的病變部位，待4%多聚甲醛固定24 h后，按梯度進(jìn)行酒精脫水，浸蠟，組織切片，脫蠟，HE染色等，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變，并拍照。

1.7.2血漿中miRNA-146a表達(dá)水平測(cè)定 采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)方法檢測(cè)：取0.3 mL血漿，放入2 mL離心管中置于冰盒上，加入1.2 mL TriQuick Reagent，混勻，室溫靜置5 min，加入0.3 mL氯仿，震蕩機(jī)震蕩15 s，靜置2 min；4 ℃下12 000×g離心15 min，取上清0.6 mL加入潔凈的1.5 mL離心管中；加入0.6 mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min；4 ℃下12 000 ×g離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%酒精，輕輕洗滌沉淀，4 ℃下12 000 ×g離心5 min，棄上清；加入1 mL 75%酒精，輕輕洗滌沉淀，4 ℃下12 000 xg離心5 min，棄上清；加入1 mL無(wú)水乙醇，4 ℃下12 000 xg離心5 min，棄上清；65 ℃金屬浴鍋上烘干沉淀，加0.03 mL DEPC水溶解。使用超微量核酸檢測(cè)儀(遂真，F(xiàn)C-1100)進(jìn)行RNA濃度及純度檢測(cè)，后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(全式金AU311)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA置于-80 ℃保存待用。qPCR反應(yīng)體系：MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，Primer Forward(10 μmol/L)0.4 μL，Primer Reverse(10 μmol/L)0.4 μL，H2O 8.2 μL；反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR循環(huán)(40循環(huán))：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s。實(shí)驗(yàn)儀器為Agilent Technologies AriaMx Real-Time PCR儀。miR-146a-F引物序列：GGGACCTGTGAAGTTCAGTT。經(jīng)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行整理及分析，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，公式：ΔCt=(Ct gene-Ct β-actin),ΔΔCt= (ΔCt treat-ΔCt control)。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad進(jìn)行整理制圖。

1.7.3結(jié)腸組織中IRAK-1、NF-κb蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)：取20～40 mg剪成細(xì)小碎片的結(jié)腸組織，放入2 mL離心管中置于冰盒上，加入200～400 μL RIPA-PMSF-PIC，用勻漿機(jī)勻漿至無(wú)沉淀，勻漿時(shí)勻漿5 s左右放回冰盒冷卻一會(huì)兒再繼續(xù)勻漿。12 000 r/min離心(離心半徑13.5 cm)5 min，取上清采用BCA法測(cè)定蛋白含量。將濃度定量至2 μg/μL，加入4×蛋白上樣buffer，100 ℃變性10 min。所得變性后的蛋白置于-80 ℃保存待用。90 V恒壓電泳約20 min，待樣品進(jìn)入分離膠層后，換用120 V恒壓電泳1～1.5 h。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。用TBST(索萊寶，T1081)配制8%脫脂奶粉(索萊寶，D8340)作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說(shuō)明書上的推薦比例使用封閉液將一抗進(jìn)行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4 ℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入按1∶4 000比例稀釋的二抗(goat anti-rabbit:Abcam, ab6721)中37 ℃ 孵育1 h，使用TBST洗膜3次，每次15 min。使用ECL顯色劑對(duì)膜進(jìn)行顯色，于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光成像。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠結(jié)腸組織病理表現(xiàn) 空白組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腺體排列整齊，黏膜上皮組織完整，黏液層光滑；模型組大鼠腸組織結(jié)構(gòu)異常，黏膜表面出現(xiàn)缺損，黏液層部分丟失，大量炎細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)，腺體破壞甚至丟失；麗珠腸樂組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)部分紊亂，黏膜缺損較模型組輕，部分腺體遭到破壞，炎細(xì)胞較模型組少；安腸湯組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本正常，黏膜缺損輕，受損部位可見少量炎癥細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色病理表現(xiàn)(×100)

2.2各組大鼠血漿中miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量比較 空白組、模型組、麗珠腸樂組、安腸湯組大鼠血漿中miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.34，2.01±0.58，1.34±0.25，1.12±0.12，模型組明顯高于空白組(P<0.05)，麗珠腸樂組和安腸湯組明顯低于模型組(P均<0.05)，安腸湯組明顯低于麗珠腸樂組(P<0.05)。

2.3各組大鼠結(jié)腸組織中IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)量比較 模型組大鼠結(jié)腸組織中IRAK-1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05)，麗珠腸樂組和安腸湯組均明顯低于模型組(P均<0.05)，安腸湯組明顯低于麗珠腸樂組(P均<0.05) 。見表1及圖2。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸組織中IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)情況

表1 各組大鼠結(jié)腸組織中IRAK-1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4各組大鼠血清 TNF-α、IL-10、IL-17水平比較 模型組大鼠血清中 TNF-α、IL-10、IL-17水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。麗珠腸樂組和安腸湯組大鼠血清中 TNF-α 、IL-17水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，但安腸湯組明顯高于麗珠腸樂組(P均<0.05)；麗珠腸樂組和安腸湯組大鼠血清中IL-10水平明顯高于模型組(P均<0.05)，且安腸湯組明顯高于麗珠腸樂組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清 TNF-α、IL-10、IL-17水平比較

3 討 論

潰瘍性結(jié)腸炎在美、歐等發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率較高，近年來(lái)我國(guó)患病率也逐年上升。據(jù)調(diào)查，我國(guó)的潰瘍性結(jié)腸炎患病率為11.6/10萬(wàn)[8]。目前臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物很多，但都存在不同程度的不良反應(yīng)。如長(zhǎng)期服用氨基水楊酸藥物會(huì)引起惡心、腹瀉、腹痛、胃燒灼感、納差、腹脹等胃腸道反應(yīng)，甚至出現(xiàn)白細(xì)胞減少、血小板減少、中性粒細(xì)胞減少、急性和慢性胰腺炎、肝炎、心包炎等嚴(yán)重的不良反應(yīng)[9]。長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可引起機(jī)體內(nèi)電解質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)及脂肪的代謝紊亂，且有向心性肥胖、滿月面、水牛背等風(fēng)險(xiǎn)，甚者會(huì)引起高血壓、消化道潰瘍、免疫力下降等。免疫抑制劑的常見不良反應(yīng)主要是骨髓抑制，表現(xiàn)為白細(xì)胞和血小板減少，也會(huì)引起胃腸道癥狀、泌尿生殖系統(tǒng)癥狀。生物制劑如英夫利西單克隆抗體的不良反應(yīng)主要是感染，其次是提高腫瘤及充血性心力衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

中醫(yī)藥治療慢性反復(fù)發(fā)作的潰瘍性結(jié)腸炎，可對(duì)患者機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙重調(diào)節(jié)作用。安腸湯是全國(guó)名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師、廣西名老中醫(yī)肖振球教授治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗(yàn)方。肖老認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎當(dāng)屬中醫(yī)“痢疾”范疇，以脾腎陽(yáng)虛為本，濕、毒、瘀為標(biāo)，寒濕停滯腸腑，郁而化熱，致脂膜損傷、絡(luò)破血溢所引起，強(qiáng)調(diào)正虛是發(fā)病之根本。治療上以溫補(bǔ)脾腎、行氣祛濕為法，從而創(chuàng)制了安腸湯。為進(jìn)一步闡明安腸湯改善潰瘍性結(jié)腸炎炎性病變的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了安腸湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠miRNA-146a/ IRAK-1/NF-κB 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。

MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼、長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，可通過(guò)調(diào)控炎癥因子和免疫細(xì)胞的作用參與炎癥發(fā)生，如炎癥細(xì)胞受到某種刺激后會(huì)導(dǎo)致miRNA向上或向下調(diào)節(jié)，從而影響多種生物功能，起到促進(jìn)炎癥或抗炎的雙向調(diào)節(jié)作用[10-12]。殷媛等[13]研究表明炎癥相關(guān)miR-146a和癌癥相關(guān)miR-27a、miR-29a、miR-20a、miR-21在潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病和腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌中的表達(dá)都顯著高于正常結(jié)腸組織，且這一組mi RNA的靶基因都富集在癌癥相關(guān)通路、免疫信號(hào)相關(guān)通路和炎癌轉(zhuǎn)換相關(guān)通路上。周毅駿等[14]報(bào)道，雷公藤多苷片能通過(guò)抑制mi R-146a和mi R-146b的表達(dá)和抑制TLR4/My D88依賴信號(hào)通路及炎癥因子IL-1β、TNF-α釋放而減輕潰瘍性結(jié)腸炎病情。由此可見，miRNA-146a是炎癥過(guò)程中重要的調(diào)控基因，是促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)的關(guān)鍵因素，且與炎癥相關(guān)信號(hào)通路關(guān)系密切，這為研究安腸湯促進(jìn)受損腸黏膜的修復(fù)治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了思路。

NF-κB介導(dǎo)是炎癥反應(yīng)中的經(jīng)典信號(hào)通路[15-17]，靜息狀態(tài)下以NF-κB二聚體與IκB結(jié)合，此時(shí)并無(wú)生物學(xué)活性，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞因子等多種因素刺激時(shí)， IκB激酶(IKK) 復(fù)合物被激活降解，釋放出NF-κB，激活后具有活性的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與κB位點(diǎn)序列特異性結(jié)合，導(dǎo)致促炎性因子如IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ等的過(guò)表達(dá)，使炎癥反應(yīng)得以放大和持續(xù)，最終導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生[18]。顧思臻等[19]認(rèn)為潰結(jié)通治療潰瘍性結(jié)腸炎可能是通過(guò)阻斷NF-κB經(jīng)典炎癥通路的活化起到抗炎作用。張鏢等[20]研究表明別旁茶苷能通過(guò)激活PXR、CYP3A等因子，抑制NF-κB的表達(dá)，從而降低結(jié)腸組織中炎癥因子 TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1的表達(dá)水平。

IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)家族包括IRAK-1、IRAK-2、IRAK-3和IRAK-4，均含死亡結(jié)構(gòu)域(DD)，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過(guò)程[21-23]。如IRAK-1分子被激活后，可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等生物行為[24]。Cheng等[25]研究發(fā)現(xiàn)IRAK-1通過(guò)AP-1/AKR1B10信號(hào)通路在肝細(xì)胞癌中增強(qiáng)癌癥的抵抗力和耐藥性。IL-17主要是由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在炎癥性疾病、過(guò)敏性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病中發(fā)揮作用。IL-10是多源細(xì)胞因子，主要由腸道的T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)表明，IL-10或IL-10R等位基因突變與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生密切相關(guān)，可見IL-10在抗?jié)冃越Y(jié)腸炎治療中的重要作用[26]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麗珠腸樂組、安腸湯組miRNA-146a相對(duì)表達(dá)量和結(jié)腸組織中IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，且安腸湯組明顯低于麗珠腸樂組，提示麗珠腸樂和安腸湯均可抑制miRNA-146a及IRAK-1、NF-κB蛋白的表達(dá)，安腸湯的抑制作用好于麗珠腸樂。同時(shí)麗珠腸樂組及安腸湯組大鼠血清中TNF-α、IL-17水平均明顯低于模型組，而麗珠腸樂組均明顯低于安腸湯組；麗珠腸樂組和安腸湯組大鼠血清中IL-10水平明顯高于模型組，且安腸湯組明顯高于麗珠腸樂組。提示麗珠腸樂和安腸湯都能夠抑制該信號(hào)通路末端炎癥因子的表達(dá)，麗珠腸樂的作用優(yōu)于安腸湯，但安腸湯上調(diào)IL-10的作用優(yōu)于麗珠腸樂。

綜上所述，推測(cè)安腸湯能夠通過(guò)miRNA-146a調(diào)控IRAK-1/NF-κB信號(hào)通路，控制潰瘍性結(jié)腸炎的炎癥活動(dòng)，從而修復(fù)受損腸黏膜。安腸湯是復(fù)方中藥，特別是煎煮過(guò)后湯劑中化學(xué)成分更為復(fù)雜，其確切的抗?jié)冃越Y(jié)腸炎組分及詳細(xì)的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。