張雪玉，鄧儀昊，郭 濤，臧 瑞，武煜明，蔡恩麗

(1. 云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650000；2. 昆明理工大學，云南 昆明 650000)

缺血性腦卒中是危害人類生命健康的一大疾患。目前，全球卒中患者超過8 000萬，而缺血性腦卒中患者占比高達80%以上[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學血管內介入診療雖能恢復血流，但再灌注后的級聯(lián)反應難以控制，往往造成比缺血階段更為嚴重的缺血再灌注損傷[2]，且有嚴格的時間窗限制，臨床應用嚴重受限[3]。早在1995年，Nitatori等[4]就在腦缺血模型中檢測到了細胞自噬并伴有溶酶體活性增強，說明自噬及溶酶體功能是腦缺血疾病發(fā)生發(fā)展的重要風險因子。自噬作為溶酶體依賴的嚴格調控分解過程[5]，與清除異常蛋白質聚集體及受損細胞器[6]，抵抗軸突結構和功能變性[7-8]，維持神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)密切相關。自噬流是近年來提出的新概念，既往研究大多通過檢測自噬體數量來評價自噬，但單純觀察自噬體的激活或抑制并不能完整動態(tài)地反映自噬在腦缺血過程中的變化[9]。自噬流不僅檢測自噬體數量，還需動態(tài)監(jiān)測自噬底物來證實底物是否到達溶酶體，以及自噬水平與自噬底物降解率的變化[10]，故研究缺血半影區(qū)神經元自噬流對于進一步揭示缺血性腦卒中的發(fā)病機制及尋找新的治療靶點具有重要意義?！澳绕妗笔窃颇瞎嶙鍙V為流傳、應用比較成熟的卒中驗方，本課題組前期研究已證實“魔吶奇”可誘導大鼠腦內腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，改善大鼠卒中后神經功能，減輕炎癥反應，對腦卒中后的腦組織及神經元形態(tài)結構發(fā)揮著重要保護作用[11]。在此基礎上，本實驗通過建立大腦中動脈梗死模型，進一步觀察“魔吶奇”對大鼠腦缺血損傷后神經保護作用及其與細胞自噬流的關系。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠54只，體重200～230 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0004。適應性喂養(yǎng)1周，自由飲食。

1.2藥物 “魔吶奇”制備：天紅地綠15 g、老虎刺皮15 g、滿山香15 g、黑皮跌打15 g、山皮條9 g、大荃麻9 g、藤蕉9 g、松節(jié)9 g、楊梅皮9 g，上述中藥飲片購自云南墨江縣委黨校醫(yī)務室。用蒸餾水漂洗干凈，磨成粗粉，輔以1 000 mL黃酒，制成生藥濃度約為1.2 g/mL的酒劑，用0.45 μm孔徑混合膜過濾除菌，無菌裝瓶，4 ℃冷藏備用。

1.3試劑及儀器 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、Beclin-1兔多抗、Ubiquitin鼠單抗、P62兔多抗、Beta-聯(lián)蛋白、HRP標記的羊抗鼠、HRP標記的羊抗兔、DAPI均購自Cell Signaling Technology公司；RIPA組織/細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司； LC3B兔多抗 (Sigma)，CathepsinB鼠單抗(SANTA CRUZ)，LAMP1兔多抗(ABclonal) 。電泳儀及轉膜儀(上海天能科技有限公司)；脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；冰凍切片機(德國萊卡公司)；熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.4實驗方法 將54只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、魔吶奇組，每組18只。除假手術組(僅分離各血管，不插入栓線，逐層縫合皮膚)外，其余各組均參照改良Longa線栓法[12]制備大鼠左側大腦中動脈梗死模型，大鼠自然蘇醒后，Longa 5分法[12]評分為1～3分的大鼠為造模成功，進行后續(xù)實驗。造模24 h后，魔吶奇組大鼠按2.5 mL/kg的劑量腹腔注射“魔吶奇”(根據70 kg成人與動物體重藥量折算表及給藥方式生物利用度換算)，模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，均每天1次，持續(xù)腹腔注射14 d。

1.5觀察指標及方法

1.5.1神經功能缺損評分及腦梗死體積 注射14 d后，于斷頸處死前對大鼠進行改良神經缺損評分(mNSS)，分別包括運動測試、置地測試、感覺測試、平衡木測試、反射缺失以及有無異常運動測試[13]。mNSS評分后，按照TTC染色檢測方法進行操作，通過Image J分析軟件測定正常側和梗死側腦組織體積，然后計算腦梗死區(qū)域百分比[(左側大腦梗死白色區(qū)域體積/右側大腦總體積)×100%]。

1.5.2皮質缺血半影區(qū)自噬相關蛋白表達水平 按照 Western blot 檢測方法進行操作，其中一抗?jié)舛?Beclin1 1∶500,LC3 1∶12 000,P62 1∶1 000,Ub 1∶1 000,LAMP1 1∶1 000,CathepsinB 1∶1 000 ，以Beta-actin 1∶1 000為內參。采用ImageJ 軟件測量條帶灰度值，自噬相關蛋白表達水平以目的蛋白/內參的比值表示。

1.5.3皮質缺血半影區(qū)LC3陽性表達情況 按照免疫熒光雙標檢測方法進行操作，其中LC3兔多克隆一抗及Neun鼠多克隆一抗?jié)舛葹?∶400，羊抗鼠和羊抗兔熒光二抗?jié)舛葹?∶800，于顯微鏡下調至高倍鏡視野(×400)，觀察皮質缺血半影區(qū)組織細胞形態(tài)并拍照，采用Image J軟件計算LC3陽性細胞占比。

2 結 果

2.1各組大鼠神經功能mNSS評分比較 模型組大鼠mNSS評分為(5.16±0.98)分，魔吶奇組mNSS評分為(2.67±0.52)分，魔吶奇組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.2各組大鼠腦梗死體積比較 模型組大鼠梗死腦組織占比為(23.87±3.78)%，魔吶奇組梗死腦組織占比為(18.35±1.75)%，魔吶奇組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3各組大鼠缺血半影區(qū)自噬流相關蛋白表達水平比較 模型組大鼠缺血半影區(qū)Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、 LAMP1蛋白表達水平均明顯高于假手術組(P均<0.05)，P62(Souble)蛋白表達水平明顯低于假手術組(P<0.05)；魔吶奇組大鼠缺血半影區(qū)Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1蛋白表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，P62(Souble)蛋白表達水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1及圖2。

圖1 Western blot檢測自噬相關蛋白表達水平的代表性條帶

圖2 各組大鼠缺血半影區(qū)自噬流相關蛋白表達情況

2.4各組大鼠缺血半影區(qū)LC3陽性神經元表達情況 顯微鏡下觀察到假手術組大鼠腦皮質內偶見神經元LC3表達，陽性表達占比為(17.09±2.33)%；模型組大鼠腦皮質缺血半影區(qū)內可見大量點狀LC3分布于神經元細胞，陽性表達占比為(30.35±3.2)%；魔吶奇組大鼠腦皮質缺血半影區(qū)內LC3陽性神經元數量較少，陽性表達占比為(24.81±4.31)%。模型組LC3陽性表達率明顯高于假手術組(P<0.05)，魔吶奇組明顯低于模型組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠缺血半影區(qū)LC3陽性神經元表達情況

3 討 論

缺血性腦卒中歸屬于中醫(yī)“中風”范疇，中風多發(fā)生于老年人，病機特點為元氣不足，瘀血阻絡[14]，其中氣虛血瘀為中風病機關鍵，治宜益氣活血化瘀[15]?！澳绕妗痹诠嵴Z中意譯為“中風、風濕麻木藥”，全方活血兼止血、行氣，能起到氣順血行、開閉通腑的作用，對氣滯痰凝、經絡痹阻導致的卒中后半身不遂、肢體痿弱不用有良好療效[16]，輔以黃酒，入血分，能溫運血脈，以助藥勢，達到補氣活血之功。

在腦缺血早期，激活自噬可加速變性蛋白的清除，挽救大腦殘存的神經元功能[17]。隨著腦缺血發(fā)展，蛋白質聚積物越來越多，自噬溶酶體活性不足，最終自噬的過度激活、不足或缺陷均可加速細胞死亡進程[18-19]。由此可見，在腦缺血晚期，通過調控自噬預防和治療疾病的關鍵是維持自噬穩(wěn)態(tài)，保證自噬流的通暢。Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、P62(Souble)蛋白水平可反映自噬活性的強弱。Beclin-1是自噬啟動的關鍵蛋白，參與自噬隔離膜的形成，隔離膜通過LC3與P62相互作用被吸收到隔離體中，自噬體生長在隔離體表面[20]，LC3亞型LC3Ⅱ和可溶性P62(Souble)可作為自噬體的標記蛋白[21]。自噬底物募集蛋白P62有可溶性和不可溶性之分[22]，細胞發(fā)生自噬時，自噬體通過細胞骨架微管系統(tǒng)將其包裹物運輸至溶酶體，自噬底物募集蛋白P62將破損蛋白及大分子物質經過泛素化蛋白Ubiquitin修飾后與LC3Ⅱ一同運送至溶酶體途徑降解[23]，溶酶體降解率受體內酸性水解酶 CathepsinsB影響[24]，溶酶體相關膜蛋白LAMP1反映了溶酶體完整性[25]， CathepsinB及LAMP1共同參與溶酶體降解過程，可以顯示溶酶體功能的變化。而不溶性P62(Insouble)、泛素化蛋白Ubiquitin蛋白能反映自噬產物降解水平。上述自噬相關蛋白表達水平可以完整反映自噬與溶酶體清除之間的動態(tài)平衡情況，是判斷自噬流是否通暢的依據。

本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達上調，P62(Souble)表達下調，提示大鼠腦缺血14 d后，半影區(qū)自噬活性增強；且P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1表達顯著上調，推斷為應對腦缺血的發(fā)展，大量溶酶體標志物LAMP1及酸性水解酶蛋白CathepsinB活化，但也不能充分降解胞內大量異常積聚的自噬體和底物，導致底物P62(Insouble)及泛素化蛋白Ubiquitin在自噬下游堆積，阻礙自噬流通暢。提示自噬溶酶體清除障礙及缺陷導致大腦中動脈梗死大鼠腦中存在大量的自噬體和自噬溶酶體，故免疫熒光檢測見大量LC3表達于Neun，且大鼠神經功能表現(xiàn)嚴重缺損及腦梗死體積顯著增加。而魔吶奇組Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達下調，P62(Souble)表達有增高，免疫熒光可見定位于Neun的LC3占比減少，提示“魔吶奇”可抑制缺血半影區(qū)自噬活性； P62(Insouble)、Ubiquitin、CathepsinB、LAMP1表達顯著下調，表明“魔吶奇”可減少自噬產物堆積，同時大鼠神經功能損傷顯著逆轉，腦梗死體積占比減少。

綜上所述，持久的缺血損傷或高水平的自噬消耗引起溶酶體功能障礙及溶酶體活性不足，導致過量自噬體及底物在神經元中異常集聚，最終觸發(fā)細胞死亡。故防止過量自噬體和底物的積累，保障自噬流通暢是一個潛在的治療靶點，能有效改善缺血性損傷?！澳绕妗笨赏ㄟ^抑制皮質缺血半影區(qū)過度誘導的自噬流，保障自噬與溶酶體清除動態(tài)維穩(wěn)，有效逆轉缺血誘導的過量自噬產物滯留，促進自噬流通暢，從而顯著逆轉神經元損傷，發(fā)揮卒中后神經保護作用。最近一項研究表明過度的自噬可以通過溶酶體系統(tǒng)誘導細胞死亡，抑制自噬可以穩(wěn)定溶酶體膜，從而阻斷細胞凋亡信號通路，這揭示了缺血性腦卒中中自噬的“黑暗面”[26]。對于“魔吶奇”抑制缺血性腦卒中后自噬與凋亡之間的關系及對其神經元的最終影響有待深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。