項麗慧，王麗麗，陳 林*，宋振碩，張應根，余文權，陳 鍵

(1.福建省農業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福州 350013；2.福建省農業(yè)科學院，福建 福州 350002)

茶葉香氣是反映茶葉品質的重要因子之一。在茶鮮葉中許多香氣成分以糖苷形式(GBVs，Glycosidically-bound volatile compounds)存在，如順-3-己烯醇、苯乙醇、苯甲醇、香葉醇、芳樟醇及其氧化物等[1]。糖苷水解在紅茶和烏龍茶香氣形成中的作用已基本明晰。紅茶中的苯甲醇、苯乙醇和香葉醇，主要來源于揉捻過程櫻草糖苷(苯甲醇、苯乙醇和香葉醇)水解釋放[2,3]。烏龍茶加工過程中，由于細胞保持較完整的形態(tài)[4]，櫻草糖苷和櫻草糖苷水解酶處于區(qū)室分離狀態(tài)，無法發(fā)生水解反應。在烏龍茶做青過程游離態(tài)香氣成分并非來源于糖苷水解[3,5,6]。芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇等是白茶的主要揮發(fā)性物質[7,8]。在白茶加工過程中，這些糖苷類香氣成分源自糖苷水解或從其他物質轉化而來尚待探究。糖苷物質在白茶萎凋過程中呈現水解與合成動態(tài)變化。苯乙基和苯甲基葡萄糖苷含量在萎凋全程基本保持穩(wěn)定，其余葡萄糖苷下降；順-3-己烯醇、苯乙醇、芳樟醇、香葉醇的櫻草糖苷在萎凋后期出現了明顯升高[9]。為解析白茶加工過程中糖苷對香氣形成的作用，本文分析了白茶加工對β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表達量、β-葡萄糖苷酶活性、香氣成分的影響。根據糖苷類香氣成分相關代謝通路分析，探討白茶糖苷結合態(tài)香氣的形成途徑，以期為基于萎凋失水的茶葉增香工藝技術調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗茶樣為福鼎大毫茶(Camelliasinensisvar.sinensisFuding Dahaocha)一芽二、三葉，采摘自福建省農業(yè)科學院茶葉研究所(福安市社口鎮(zhèn))試驗茶園。順-3-己烯醇、苯甲醇、苯乙醇、香葉醇、苯甲醛、水楊酸甲酯、芳樟醇購自國內化學試劑公司代理的進口原裝或分裝試劑。CAR/PDMS固相微萃取頭(75μm；美國Supelco公司)。7890A/5975C氣質聯用儀(美國Agilent 公司)。MP Fastprep-24 5G組織研磨儀(美國MP Biomedicals公司)。β-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 樣品制備

采用微波固樣方式制得茶鮮葉樣品[10]。將其余茶鮮葉薄攤于尼龍網篩上，置于室內進行控溫除濕(溫度20±1℃，相對濕度60±5%)萎凋，并將萎凋減重了64%的萎凋葉放入烘箱，80℃烘至足干，獲得白茶樣品。上述茶鮮葉和白茶樣品用于香氣成分檢測。另外在茶鮮葉萎凋減重0(S0)、10%(S1)、20%(S2)、30%(S3)、40%(S4)、50%(S5)、60%(S6)、64%(S7；白茶萎凋結束)階段進行液氮固樣，樣品用于基因表達和酶活性檢測。

1.3 香氣成分檢測

參照王麗麗等[8]建立的香氣成分檢測方法，具體操作如下：稱取磨碎試樣5.0 g(過40目篩)于250 mL錐形瓶，加入150 mL沸超純水，擰緊帶本色PTFE/硅膠隔墊的自制活塞，置60℃恒溫水浴。磁力攪拌茶水混合液10 min后，將老化后的CAR/PDMS固相微萃取頭(75 μm；美國Supelco公司)迅速插入樣品瓶上方。加熱吸附30 min后，取出萃取頭，并迅速插入7890A/5975C氣質聯用儀(美國Agilent 公司)進樣口，熱解吸5 min，用于GC-MS分析(萃取頭插入進樣口，同時啟動儀器采集數據)。

色譜條件：HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；進樣口溫度：250℃；程序升溫：50 ℃，保持1 min；以2 ℃·min-1速率升至80℃，保持1 min；再以5 ℃·min-1速率升至160℃，保持1 min；最后以10℃·min-1速率升至220℃，保持10 min，升溫程序結束。載氣：氦氣(純度>99.999%)；柱流量為1.0 mL·min-1；進樣方式：不分流進樣。質譜條件：EI離子源；離子化電壓70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；輔助通道溫度：250℃；電子倍增器電壓：350V；掃描時間：0.5～50.0 min；質量分析范圍(m/z)：40～600。通過NIST2011譜庫檢索和標準品鑒定香氣成分。

1.4 糖苷水解酶基因表達量分析

采用植物總RNA提取試劑盒(中國北京天根生物科技有限公司)提取樣本總RNA，各取2 μg的RNA用于建庫測序，采用Illumina Hiseq 4000(美國加利福尼亞州圣地亞哥Illumina，Inc.)測序。以舒茶早茶樹基因組[11]作為參考基因組，使用tophat 2(v2.1.0)[12]進行數據比對。利用HTSeq(v 0.5.4 p3)軟件計算FPKM，用于衡量基因表達水平[13]。β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因序列信息來源于參考文獻[14,15]。

qRT-PCR分析：以RNA為模板，按 TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 的說明書進行反轉錄。引物序列見表1。qRT-PCR采用TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)進行。使用美國ABI QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀檢測β-櫻草糖苷酶在樣本中的相對表達量。3個葡萄糖苷酶基因(CsGH1BG6、CsGH1BG67和CsGH1BG626)相對表達量數據引用文獻[14]。

表1 內參基因和目標基因qRT-PCR分析的引物序列

1.5 β-葡萄糖苷酶活性檢測

β-葡萄糖苷酶活性檢測方法為對硝基苯酚顯色法[16]。將5 g樣品在冷凍狀態(tài)下搗碎，用鑷子取出約0.2 g葉片放入2 mL離心管，離心管內預先加入A裂解介質(石榴石、陶瓷球)及0.2 g PVPP，然后加入1 mL提取液，使用MP Fastprep-24 5G組織研磨儀(美國MP Biomedicals公司)進行研磨，其余步驟參照β-葡萄糖苷酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，微量法)方法操作。酶活力單位(Unit)定義為測定條件下，每分鐘水解1 nmol對硝基苯酚β-葡萄糖苷的酶量。

1.6 數據分析

使用STEM軟件進行趨勢分析；使用Excel軟件進行單因素方差分析和相關性分析；采用GraphPad Prism 7.04繪制柱形圖和折線圖。

2 結果與分析

2.1 白茶工藝對糖苷來源香氣成分的影響

鑒定了8個糖苷來源香氣成分，結果顯示，茶鮮葉經過萎凋和干燥工序后，顯著增加的包括水楊酸甲酯、香葉醇、苯甲醛、苯乙醇、芳樟醇；順-3-己烯醇和苯甲醇無顯著差異；呋喃型芳樟醇氧化物顯著減少(圖1)。

圖1 白茶加工工序對糖苷來源香氣成分的影響Fig.1 Changes on glycosidically-bound volatile compounds in white tea during processing注：1-8分別為水楊酸甲酯、香葉醇、呋喃型芳樟醇氧化物、順-3-己烯醇、苯甲醛、苯甲醇、芳樟醇和苯乙醇；*表示差異達顯著性水平(p<0.05)，**表示差異達極顯著性水平(p<0.01)。圖2、圖5同。

2.2 在萎凋過程糖苷水解酶基因表達量的變化

根據水解底物不同，可將糖苷水解酶分為β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。為了探究糖苷代謝對茶葉香氣的貢獻，測定了茶鮮葉萎凋過程β-葡萄糖苷酶和β-櫻草糖苷酶基因的表達量，并進行熒光定量PCR驗證。結果表明，與S0相比，S2階段β-櫻草糖苷酶基因表達量極顯著降低，S2至S7階段表達量變化小(圖2)。采用STME軟件對28條β-葡萄糖苷酶基因表達量進行趨勢分析(圖3)，獲得1種顯著富集模型(Profile#1)，Profile#1包括11條酶基因，表達趨勢為持續(xù)下調。值得關注的是，Profile#7(CsGH1BG21和CsGH1BG6)表達持續(xù)上調，Profile#5(CsGH1BG15)在萎凋階段S0-S5階段持續(xù)上調，隨后急劇下降。qRT-PCR分析顯示(圖4)，β-櫻草糖苷酶基因表達下調，2個β-葡萄糖苷酶基因(CsGH1BG6和CsGH1BG26)先升后降，在S4之前CsGH1BG7相對表達量微降，在S7階段上升。qRT-PCR分析結果同轉錄組表達趨勢基本一致。

圖2 茶鮮葉萎凋過程β-櫻草糖苷酶基因表達量變化Fig.2 Expressions of β-primeverosidase gene in white tea during withering

圖3 茶鮮葉萎凋過程β-葡萄糖苷酶基因表達變化趨勢Fig.3 Expressions of β-glucosidase genes in white tea during withering注：每個方框表示一種趨勢模型。在方框左上方數字為模型編號，左下方為基因數量。紅色方框表示該模型有顯著性富集(P<0.05)。

圖4 茶鮮葉萎凋過程β-櫻草糖苷酶(BP)和β-葡萄糖苷酶(BG)相對表達量變化Fig.4 Relative expressions of β-primeverosidase (BP) and β-glucosidases (BG) genes in white tea during withering

2.3 萎凋過程β-葡萄糖苷酶活性及其基因表達的相關性

為了解β-葡萄糖苷酶基因水平和蛋白水平的調控情況，分析了茶鮮葉萎凋過程β-葡萄糖苷酶活性變化及其編碼基因表達量的相關性。結果顯示β-葡萄糖苷酶活性在萎凋減重≤30%階段逐漸升高，萎凋減重30%(S3)與鮮葉(S0)存在顯著差異，之后活性趨于穩(wěn)定(圖5)。11個基因表達量與β-葡萄糖苷酶活性呈負相關，8個基因表達量與β-葡萄糖苷酶活性呈正相關(圖6)。CsGH1BG6、CsGH1BG21與β-葡萄糖苷酶活性呈正相關，相關系數大于0.6。

圖5 茶鮮葉萎凋過程β-葡萄糖苷酶活性變化Fig.5 Changes on β-glucosidase activity in white tea during withering

圖6 β-葡萄糖苷酶活性與GH1基因表達的相關性Fig.6 Correlation between β-glucosidase activity and GH1 gene expression of white tea注：ns表示相關系數無統計學意義，未標注為相關系數有統計學意義(P<0.05)。

3 討論與結論

在白茶加工過程，5個主要的糖苷類香氣成分顯著增加，與前人研究一致[7, 9,21]。白茶加工包含萎凋和干燥兩個工序。白茶萎凋失水重，時間較長，是白茶品質形成的主要工序。本試驗主要探討萎凋對糖苷類香氣成分及代謝酶的變化，以期探明糖苷類香氣成分的代謝變化。

這些糖苷類香氣成分以櫻草糖苷和葡萄糖苷兩種形成存在于茶樹體內，分別被β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶水解釋放。通常在細胞破碎的情況下，櫻草糖苷發(fā)生酶促水解，含量大幅減少[2,4]。然而在長時萎凋過程，葉細胞分區(qū)仍處于較為完整狀態(tài)，櫻草糖苷發(fā)生水解可能性低。本研究結果顯示萎凋過程β-櫻草糖苷酶表達量減少，櫻草糖苷并未出現大幅減少[9]，推測白茶中的香葉醇、苯乙醇、芳樟醇、苯甲醛、水楊酸甲酯的大量積累并非來源于櫻草糖苷酶解途徑。然而，β-葡萄糖苷酶在萎凋前期顯著增加。在茶鮮葉萎凋過程中CsGH1BG6、CsGH1BG15和CsGH1BG21基因表達上調，CsGH1BG6、CsGH1BG 21與β-葡萄糖苷酶活性呈正相關。Zhou Y認為CsGH1BG1可水解葡萄糖苷釋放苯甲醇和芳樟醇[17]。芳樟基、香葉基的葡萄糖苷在萎凋過程中呈減少趨勢[9]。相比櫻草糖苷，茶葉中芳樟基、香葉基的葡萄糖苷含量較低[3]。由此推測CsGH1BG6和CsGH1BG21編碼的葡萄糖苷酶水解了葡萄糖苷，釋放了部分的香葉醇和芳樟醇。

除了糖苷水解途徑，這些香氣成分的積累還有可能是源于非酶促水解反應及從頭合成途徑。我們發(fā)現白茶加工過程積累了大量的苯乙醇，這與前人研究結果一致[7,9]。然而苯乙基葡萄糖苷在萎凋過程中基本保持穩(wěn)定[9]，因此可排除葡萄糖苷水解途徑。苯乙基櫻草糖苷在萎凋過程中減少了80%[9]。有研究顯示在茶葉的熱水浸提過程或茶飲料的加熱過程，GBVs發(fā)生非酶促水解反應[18]。萎凋過程細胞失水以及干燥的熱力作用促使了苯乙基櫻草糖苷的非酶解反應，增加了白茶中的苯乙醇。另外，有研究顯示苯丙氨酸在萎凋過程大量增加[9,19]。苯丙氨酸是苯乙醇和苯甲醇的前體物質。苯丙氨酸被苯乙醛合酶催化形成苯乙醛，通過芳基脫氫酶轉化為苯乙醇[18,20]。由此推測苯乙醇的主要來源為苯丙氨酸轉化，其次為非酶促櫻草糖苷水解途徑。前人研究表明苯甲醇在萎凋過程顯著增加[9,21]。本研究顯示苯甲醇在鮮葉和白茶中含量無顯著差異，這可能是干燥造成苯甲醇損失。苯甲醇糖苷在白茶過程基本保持穩(wěn)定[9]，其來源于糖苷水解可能性小，說明白茶中苯甲醇來源于苯丙氨酸途徑，但烘干的熱力作用減少了苯甲醇。

王榮秀發(fā)現水楊酸甲酯在白茶萎凋過程呈線性增長趨勢[22]，這與本研究結果相同。水楊酸甲酯糖苷在綠茶加工過程整體呈增加態(tài)勢，萎凋后含量小幅增加，殺青揉捻后含量大量增加[23]。水楊酸甲酯葡萄糖苷在紅茶加工過程保持穩(wěn)定[2]。根據其他茶類水楊酸甲酯糖苷的變化結果，推測白茶的水楊酸甲酯葡萄糖苷減少的可能性較小。茶鮮葉萎凋過程，葉片受到失水脅迫，水楊酸羧基甲基轉移酶催化水楊酸生成水楊酸甲酯[22]。水楊酸酯化是白茶的水楊酸甲酯富集的主要來源。綜上，根據糖苷類香氣成分的形成途徑推測櫻草糖苷酶解作用對這些香氣形成貢獻較小，而CsGH1BG6和CsGH1BG21編碼的β-葡萄糖苷酶對香葉醇和芳樟醇的積累略有貢獻。