張玲娜 甘梅富 周夢(mèng)雅 翁壽向 李玉晶 蔣菲

胃癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，發(fā)病率和死亡率均較高，目前手術(shù)根治是主要治療胃癌的方法。早期胃癌患者術(shù)后生存率較高，但如果確診時(shí)已處于晚期，即使經(jīng)過(guò)合理的綜合治療，5年生存率也往往不太理想。胃癌影響因素眾多，不同胃癌患者的預(yù)后差異很大，病理形態(tài)學(xué)在預(yù)測(cè)預(yù)后和指導(dǎo)治療方面存在一定局限性，因此尋找具有預(yù)測(cè)意義的標(biāo)志物有助于評(píng)價(jià)不同時(shí)期胃癌患者的預(yù)后。Karyopherin alpha 2（KPNA2）基因位于染色體17q23-q24，其編碼產(chǎn)物是一種含529個(gè)氨基酸的核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白。近來(lái)有多項(xiàng)研究表明，KPNA2與腫瘤形成與發(fā)展相關(guān)（特別是細(xì)胞核內(nèi)KPNA2水平），在多種組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞（乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、食管鱗癌等）中呈高表達(dá)，與腫瘤的分級(jí)、分期等呈正相關(guān)[1-2]。目前關(guān)于KPNA2表達(dá)與胃癌相關(guān)性的研究報(bào)道仍較少，筆者通過(guò)檢測(cè)KPNA2在胃癌組織中的表達(dá)情況，探究KPNA2水平與胃癌各臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2010年1月至2014年11月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院胃腸外科手術(shù)并具有完整臨床資料和隨訪資料的103例原發(fā)胃腺癌患者，男74例（71.8%），女29例（28.2%），年齡39～89歲（中位62歲）。隨訪至2018年12月。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制備 對(duì)所有患者的HE染色切片重新閱片。選取1個(gè)腫瘤組織區(qū)域，1個(gè)癌旁組織區(qū)域，1個(gè)正常組織區(qū)域（距離腫瘤＞5 cm的切緣部位），對(duì)照石蠟標(biāo)本標(biāo)記，用穿刺針（孔徑1 mm）穿入，采集組織置于蠟塊矩陣中，將其排列整齊后進(jìn)行包埋；少部分高分化組織腫瘤區(qū)域太小，無(wú)法制成芯片，直接選用原蠟塊。

1.2.2 免疫組化（Envision法） 組織芯片或原蠟塊切片3 μm，常規(guī)脫蠟，3% H2O2處理后進(jìn)行EDTA抗原修復(fù)，分別滴加一抗 KPNA2（1∶200稀釋，美國(guó) Santa Cruz公司，1 ml）和p53（福州生物科技有限公司，即用型6 ml）室溫孵育2 h，其他按照說(shuō)明書(shū)操作，由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科主治醫(yī)師在顯微鏡下觀察。KPNA2判讀標(biāo)準(zhǔn)[3]：在＞10%的上皮細(xì)胞中觀察到完全核染色判為陽(yáng)性；≤10%的上皮細(xì)胞核陽(yáng)性或者僅細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性、不著色判為陰性。p53判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]：腫瘤區(qū)域核染色陽(yáng)性細(xì)胞比例≤10%為陰性，＞10%為陽(yáng)性。

1.2.3 KPNA2與p53 mRNA水平的相關(guān)性分析 使用可視化TCGA在線數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）分析胃癌組織中KPNA2與p53 mRNA水平的相關(guān)性，P＜0.05為存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r＞0為正相關(guān)，反之為負(fù)相關(guān)；r絕對(duì)值越大，相關(guān)性越強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。KPNA2表達(dá)與患者生存之間的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存曲線分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KPNA2在胃癌、癌旁與正常組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，KPNA2在胃組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。胃癌組織中KPNA2核陰性54例（52.4%），陽(yáng)性49例（47.6%）；癌旁組織核陽(yáng)性10例（9.7%）；正常組織核陽(yáng)性8例（7.8%）。胃癌組織與癌旁組織、正常組織KPNA2陽(yáng)性例數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而癌旁組織與正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 免疫組化檢測(cè)KPNA2在胃組織中的表達(dá)（a：KPNA2在胃正常上皮細(xì)胞核中陰性表達(dá)；b：KPNA2在癌旁細(xì)胞核陰性表達(dá)；c：KPNA2在胃癌組織中核陽(yáng)性表達(dá)；DAB染色，×20）

2.2 KPNA2表達(dá)水平與胃癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系 103例胃癌患者中，腫瘤直徑0.6～10.3 cm（中位4 cm）；組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)分類、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等情況見(jiàn)表1。將KPNA2免疫組化結(jié)果與各臨床病理參數(shù)及p53表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示KPNA2表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、p53表達(dá)等均相關(guān)（均P＜0.05），與患者性別、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)分類、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移、切緣情況、Lauren分型等均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。另外，在GEPIA2平臺(tái)分析了胃癌組織中KPNA2與p53 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)（r=0.24，P＜0.05）（圖 2）。

圖2 胃癌組織中KPNA2與p53 mRNA表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

表1 KPNA2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析（例）

2.3 KPNA2表達(dá)與胃癌患者生存的關(guān)系 隨訪時(shí)間0～90個(gè)月，中位時(shí)間27.5個(gè)月，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，KPNA2核陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間為（56.7±5.8）個(gè)月，陰性表達(dá)患者為（72.8±4.5）個(gè)月，log-rank 檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.631，P=0.018），見(jiàn)圖 3。

圖3 KPNA2不同表達(dá)情況患者的生存曲線

3 討論

KPNA2是importin α家族的成員，通過(guò)識(shí)別和結(jié)合靶蛋白質(zhì)的核定位信號(hào)，而后與其他相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合形成核轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)靶蛋白質(zhì)的核轉(zhuǎn)位。KPNA2的中心疏水結(jié)構(gòu)域有兩個(gè)核定位信號(hào)結(jié)合位點(diǎn)，能與具有核定位信號(hào)的入核蛋白結(jié)合；N端同時(shí)還有一個(gè)功能域結(jié)合importin β。Importin β將KPNA2和入核蛋白組成的復(fù)合物帶入細(xì)胞核，并在核內(nèi)與Ran-GTP結(jié)合從而釋放KPNA2。KPNA2與Ran-GTP、CAS蛋白結(jié)合返回胞質(zhì)區(qū)[1]。近來(lái)有較多研究表明，KPNA2特別是細(xì)胞核內(nèi)KPNA2水平與細(xì)胞增殖、遷移及腫瘤形成發(fā)展相關(guān)，與腫瘤的分級(jí)、分期、脈管浸潤(rùn)以及與預(yù)后不良相關(guān)[5-6]。

關(guān)于KPNA2促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，影響預(yù)后的機(jī)制，在不同腫瘤里面可能不盡相同：乳腺癌中KPNA2可通過(guò)雌激素/c-Myc/miR-26b途徑介導(dǎo)雌激素刺激的細(xì)胞生長(zhǎng)；非小細(xì)胞肺癌中KPNA2高表達(dá)誘導(dǎo)E2F1和OCT4入核引發(fā)腫瘤[7]；上皮性卵巢癌可能上調(diào)或促進(jìn)C-Myc、p-Akt、GSK-3β 等，下調(diào) FOXO3a、p21Cip1 和 p27kip1等，從而促進(jìn)腫瘤的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]；肝細(xì)胞中KPNA2受miR-139負(fù)向調(diào)節(jié)，p53可抑制肝癌中的CAS和KPNA2以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，KPNA2介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子PLAG1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)[1，9]；大腸癌中Wip1與KPNA2相互作用，調(diào)節(jié)AKT/GSK-3β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的激活[10]；食管鱗癌中KPNA2高表達(dá)誘導(dǎo)E2F1入核，促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]；胃癌中報(bào)道有通過(guò)KPNA2/NBS1/Snail激活Wnt/β-catenin信號(hào)，另外受miR-26b的調(diào)節(jié)也可促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[1，12-13]。另外，關(guān)于p53與KPNA2，有報(bào)道稱腸癌中p53激活劑和Wip1抑制劑可下調(diào)KPNA2表達(dá)[10]；膀胱癌細(xì)胞株中敲低KPNA2之后，p53表達(dá)量上升[14]；口腔鱗癌中KPNA2可調(diào)節(jié)p53入核[15]。關(guān)于胃癌中KPNA2與p53的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織細(xì)胞核中KPNA2陽(yáng)性率高，KPNA2表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓、腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期等均相關(guān)（均P＜0.05），KPNA2核陽(yáng)性表達(dá)患者的生存時(shí)間不及陰性表達(dá)患者。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)KPNA2與p53在蛋白水平和mRNA水平上均有相關(guān)性（均P＜0.05），表示KPNA2促進(jìn)胃癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，p53可能也扮演了重要的角色。值得注意的是，由于野生型p53蛋白不穩(wěn)定，室溫保存以及后續(xù)操作過(guò)程中往往會(huì)降解掉，因此免疫組化檢測(cè)到的陽(yáng)性往往是發(fā)生突變的p53；而mRNA水平檢測(cè)是基于新鮮組織的，可同時(shí)包括突變和野生型的p53，兩者可能會(huì)有一定的差異。目前，本課題組關(guān)于KPNA2與p53在胃癌發(fā)展機(jī)制中的相關(guān)研究還在進(jìn)行中。

總之，本研究表明KPNA2核表達(dá)與一些胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后較差相關(guān)，與p53表達(dá)相關(guān)，提示KPNA2可能是胃癌患者的預(yù)后分子標(biāo)志物以及潛在的治療靶標(biāo)。