童巧文 陳楊芳 吳森翔 鄭麗芬 陳依依 馮梅 葉華

帕金森病是一種中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。帕金森病的病理特征是黑質(zhì)致密部中多巴胺能神經(jīng)元明顯減少和路易小體形成。帕金森病臨床上主要表現(xiàn)為肌強直、運動遲緩和震顫等運動癥狀，以及睡眠障礙、感覺障礙、自主神經(jīng)功能紊亂及神經(jīng)精神障礙等非運動癥狀[1]?；颊叱霈F(xiàn)上述癥狀說明體內(nèi)的自主神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的腦-腸軸通路可能已受到影響[2-6]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道之間存在著腦-腸軸的雙向通信交流，而且越來越多的研究開始關(guān)注腸道菌群對腦-腸軸的作用[7-10]。帕金森病患者體內(nèi)腦-腸-菌群軸的失調(diào)可能導(dǎo)致其胃腸道功能障礙[11]，并促進了帕金森病的發(fā)病，這支持了Braak等[2，4]關(guān)于帕金森病病理過程是從腸道影響到大腦的假設(shè)。本研究采用高通量測序技術(shù)對帕金森病患者腸道菌群進行定量檢測，分析菌群變化及與臨床特征的相關(guān)性，為帕金森病的發(fā)病機制提供理論支持，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2017年11月至2019年2月溫州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的帕金森病患者30例為PD組，并選擇同期醫(yī)院體檢中心的健康體檢者30例為HC 組。PD 組男 14例，女 16例，年齡 46～79（66.1±7.2）歲，BMI為（22.85±2.71）kg/m2；HC 組男 18 例，女 12例，年齡 50～75（64.8±5.0）歲，BMI為（23.08±2.32）kg/m2。兩組對象均長期生活于浙南地區(qū)，飲食結(jié)構(gòu)相似，無特殊飲食習(xí)慣；兩組對象性別、年齡、BMI比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)英國腦庫帕金森病診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，并由經(jīng)驗豐富的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、急性心力衰竭等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；嚴(yán)重消化道疾病史；胃腸手術(shù)病史；3個月內(nèi)服用過抗生素和益生菌。本研究經(jīng)溫州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，兩組對象或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PD組臨床資料和評價的收集 收集PD組患者病史資料。采用Hoehn＆Yahr分級量表（H-Y分級）和統(tǒng)一帕金森病評分量表第三部分（unified Parkinson's disease rating scale Ⅲ，UPDRS Ⅲ）進行臨床分類，以評估疾病進展和運動功能損傷。由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師對PD組患者進行非運動癥狀的評估，包括簡易精神狀態(tài)檢查量表（mini-mental state examination,MMSE），漢密爾頓抑郁量表（hamilton depression scale，HAMD）24 項版，漢密爾頓焦慮量表（hamilton anxiety scale，HAMA），帕金森病自主神經(jīng)癥狀量表（the scale for outcomes in PD for autonomic symptoms，SCOPA-AUT），Wexner便秘評分[13]。

1.2.2 糞便標(biāo)本微生物分類分析 采用統(tǒng)一的無菌一次性便盒在醫(yī)院或家中采集糞便標(biāo)本，并儲存于微生物檢測試劑盒（杭州金源生物技術(shù)公司）。使用糞便基因組DNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司，DP328），按照說明書要求，對糞便標(biāo)本提取DNA。使用特定設(shè)計的細(xì)菌PCR擴增引物對糞便標(biāo)本中的16S rDNA進行PCR擴增，具體引物序列如下：正向引物：5'-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag CCTACGGGNGGCWGCAG-3'，反向引物：5'-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacagGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'。使用 Miseq儀器（美國Illumina公司）進行細(xì)菌16S rDNA高通量測序。

1.2.3 兩組對象腸道菌群的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多樣性分析 過濾處理測序原始數(shù)據(jù)后，得到OTU?；跇颖綩TU，分析菌群Alpha多樣性，計算Chao1指數(shù)，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)及Good's coverage等參數(shù)。它們分別用于反映菌群的豐度；估算樣品中微生物的多樣性；反映一個樣品中任意兩條序列不屬于同一個物種的概率；估算各樣文本庫的覆蓋率。

1.2.4 兩組對象門、屬水平腸道菌群豐度的比較 根據(jù)OTU物種注釋，以及每個OTU的序列數(shù)，計算兩組對象腸道菌群的豐度；根據(jù)分類學(xué)信息，從門水平和屬水平分析比較兩組腸道菌群的豐度。

1.2.5 兩組對象差異菌群與PD組臨床特征的相關(guān)性分析 分析兩組間差異菌群與PD組病程、運動癥狀、非運動癥狀等臨床特征的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用R（v3.6.1）語言軟件進行分析。在Rstudio界面，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。PD組患者腸道菌群豐度與臨床癥狀之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD組臨床資料和評價結(jié)果 PD組病程為（5.54±3.5）年，H-Y 分級為（2.11±0.65）級，UPDRS Ⅲ評分為（25.31±10.37）分，MMSE 評分為（26.94±2.48）分，HAMD評分為（18.67±9.76）分，HAMA 評分為（12.25±6.55）分，SCOPA-AUT 評分為（28.08±8.26）分，Wexner便秘評分為（9.28±6.3）分。

2.2 兩組對象腸道菌群的OTU和Alpha多樣性分析比較 見表1。

由表1可見，PD組與HC組OTU數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)、Good's coverage反映的菌群多樣性比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 兩組對象腸道菌群的OTU和Alpha多樣性分析比較

2.3 兩組對象門水平腸道菌群豐度比較 見表2。

由表2可見，在門水平上，PD組疣微菌門、黏膠球形菌門、異常球菌門的豐度高于HC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。

表2 兩組對象門水平腸道菌群豐度比較（%）

2.4 兩組對象屬水平腸道菌群豐度比較 見表3。

由表3可見，PD組中毛螺旋菌屬、伯勞特菌屬、鏈球菌屬、克雷伯菌屬豐度明顯低于HC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。PD組中埃希菌屬、瘤胃球菌屬、巨單胞菌屬、阿克曼菌屬、巨型球菌屬、顫桿菌屬、伯克菌屬、埃森博格拉菌屬、異味桿菌屬、丹毒絲菌科未命名屬、脫硫弧菌屬、普雷沃菌屬、單胞菌屬、脫硫弧菌科未命名屬、嗜胨菌屬豐度高于HC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。

表3 兩組對象屬水平腸道菌群豐度比較（%）

2.5 兩組對象差異菌群與病程、運動癥狀的相關(guān)性分析 見表4。

由表4可見，PD組與HC組間的差異菌屬分別與帕金森病病程、運動癥狀進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示UPDRS Ⅲ與脫硫弧菌屬呈正相關(guān)（rho=0.482，P=0.023）。

表4 兩組對象差異菌群與病程、運動癥狀的相關(guān)性分析

2.6 兩組對象差異菌群與非運動癥狀的相關(guān)性 見表5。

由表5可見，將PD組與HC組間差異菌屬分別與PD非運動癥狀進行相關(guān)分析，HAMA與鏈球菌屬呈正相關(guān)，HAMA、HAMD與巨型球菌屬呈正相關(guān)；MMSE與埃森博格拉菌屬呈負(fù)相關(guān)；SCOPA-AUT與普雷沃菌屬呈負(fù)相關(guān)。

表5 兩組對象差異菌群與非運動癥狀的相關(guān)性

3 討論

帕金森病是一種以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退行性病變?yōu)樘卣鞯纳窠?jīng)變性性疾病。在神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的神經(jīng)元內(nèi)存在的含有α-突觸核蛋白的路易小體是帕金森病病理診斷重要的相關(guān)標(biāo)志物[14-16]。Braak等[2]根據(jù)帕金森病患者的病理學(xué)研究提出帕金森病腦-腸軸受累的假設(shè)，越來越多證據(jù)表明胃腸道和腸神經(jīng)對帕金森病的發(fā)展有重要作用。腦-腸軸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道之間的雙向通信系統(tǒng)。新近研究提出腸道菌群可能影響胃腸-腦相互作用[17-19]。

本研究分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD組與HC組在菌群多樣性上比較無統(tǒng)計學(xué)意義。這與Pietrucci等[20-21]的研究結(jié)果一致。從門水平上看，本研究結(jié)果顯示PD組患者糞便中疣微菌門、黏膠球形菌門、異常球菌門的豐度較高，其中，疣微菌門比例比較高，作用可能比較大。既往國外研究結(jié)果顯示了帕金森病腸道菌群中疣微菌門豐度較高[22]，與本研究結(jié)果一致。從屬水平上看，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD組毛螺旋菌屬、伯勞特菌屬的豐度較少。這兩種細(xì)菌均參與調(diào)節(jié)產(chǎn)生短鏈脂肪酸[17，23-27]。短鏈脂肪酸是菌群代謝的主要產(chǎn)物,不僅起到穩(wěn)定菌群結(jié)構(gòu)的作用，還參與腸道免疫、動力和腸上皮屏障的調(diào)節(jié)[28]。既往一些研究已經(jīng)表明在帕金森病患者腸道中缺乏短鏈脂肪酸，這可能與帕金森病患者腸道調(diào)節(jié)產(chǎn)生短鏈脂肪酸的菌群減少有關(guān)[29-30]。本研究關(guān)注到PD組腸桿菌科中的埃希菌屬和阿克曼菌屬豐度明顯升高，這與之前的研究結(jié)果一致[31-32]。埃希菌屬是革蘭陰性菌，而脂多糖是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，它可以誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。Small等[33]發(fā)現(xiàn)在克羅恩病中持續(xù)感染黏附侵襲性埃希菌可以導(dǎo)致慢性、持續(xù)性外周炎癥。而阿克曼菌被認(rèn)為可以降解腸道黏液層[34]，導(dǎo)致微生物抗原暴露于免疫細(xì)胞，從而可能具有炎癥潛力。這兩種細(xì)菌可能促進了帕金森病患者腸道炎癥反應(yīng)和腸黏膜屏障的破壞。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示UPDRS Ⅲ與脫硫弧菌屬豐度呈正相關(guān)性。Tomova等[35]的研究發(fā)現(xiàn)自閉癥兒童腸道中脫硫弧菌增加的趨勢，其豐度與自閉癥孤獨癥診斷訪談的限制/重復(fù)行為評分嚴(yán)重程度有明顯的相關(guān)性。從非運動癥狀量表相關(guān)性結(jié)果來看，SCOPA-AUT與普雷沃菌屬豐度呈負(fù)相關(guān)性；同樣在特發(fā)性快速眼動睡眠行為紊亂患者中腸道普雷沃菌下降，提示普雷沃菌可能對帕金森病非運動癥狀有影響[36]。MMSE與埃森博格拉菌屬豐度呈負(fù)相關(guān)性；HAMA與鏈球菌屬呈正相關(guān)性，HAMA、HAMD均與巨型球菌屬豐度均呈正相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者巨型球菌豐度較HC組明顯升高，說明巨型球菌可能與帕金森病精神行為功能相關(guān)[37-38]。

本研究尚有許多不足，包括采用橫斷面研究方法，納入的帕金森病患者較少，未進行不同臨床分型的分類比較和不同階段菌群動態(tài)分析比較，僅初步證實了帕金森病患者與健康人群之間的腸道菌群差異。Sampson等[24]發(fā)現(xiàn)無菌的帕金森病小鼠模型的運動障礙癥狀比正常菌群的帕金森病小鼠模型癥狀更輕；將帕金森病患者的腸道菌群轉(zhuǎn)移至無菌的帕金森病小鼠模型，其運動障礙癥狀則加重。但目前國內(nèi)外關(guān)于帕金森病腸道菌群結(jié)構(gòu)尚不統(tǒng)一，無法歸納出其典型菌群分布特點，腸道菌群被認(rèn)為只是帕金森病發(fā)病機制中的影響因素之一。

綜上所述，帕金森病患者與健康人群之間的腸道菌群存在明顯差異。帕金森病腸道菌群中致炎病菌的增多及短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌減少，而且差異菌群與帕金森病的臨床特征有一定相關(guān)性。但是具體的作用機制尚不明確，還需進一步深入研究，本研究為帕金森病患者診斷的生物標(biāo)志物提供新方向，為腸道菌群的靶點治療方法應(yīng)用提供依據(jù)。